使用层压技术来执行人类巩膜共聚焦显微镜

Abstract

巩膜是致密结缔组织覆盖和保护眼睛。它主要由致密的胶原束（I型，III，IV，V，VI和VII）的。由于它的自身荧光，不透明，和厚度，它没有被发现适合于共焦显微镜。另一种方法的一个在这里提出，其使用石蜡包埋用于免疫组织化学福尔马林固定巩膜，具有技术挑战，预热抗原修复组织时尤其如此。由于巩膜在两个细胞和血管相对较差，使用较大的组织样本进行了探讨，以帮助防止俯瞰细胞，并了解他们有关的船只及其他解剖部位的定位。以允许共焦显微镜下放大的组织样本的分析，进行层压技术来创建从巩膜薄层。继CD31血管和淋巴管内皮hyalu的结果分析罗南受体1（LYVE1）阳性细胞，获得针对该批准科学检查，该方法的优点和局限性进行了讨论。

Introduction

巩膜是覆盖眼，它是由致密结缔组织的刚性外层。它有助于保护眼内的结构和保持眼压。因此，巩膜是明确的目标至关重要。它不含淋巴管^1,2，从而形成它与自由淋巴-内眼^3-7之间的外自由淋巴边界。它也提供了眼外肌附着位点，从而与筋共享解剖相似之处。 因为巩膜主要由I型胶原的致密束和具有型胶原III，IV，V，VI，VIII族 ^8,9和弹性^10,11的较小的数字，这个组织是不容易使用用于免疫组织化学。

解剖学，巩膜可以分为三个主要层：（1）浅血管巩膜外层，实测结膜和眼球筋膜囊下方并朝向侧面和第面对轨道眼睛E回; （2）巩膜间质，巩膜的主要部分;及（3）的薄层fusca的，这是直接位于葡萄膜上方的薄的着色层。我们对巩膜解剖知识主要来源于20 ^世纪上半叶。在那个时候，研究人员研究了血管的解剖结构主要是利用墨汁注射¹²和血管铸造^13-15。后来，它血管造影研究^16-19进行了研究。

自那时以来，旧的技术进行了改进，新的问题被开发出来，使我们能够补充先前的解剖知识。例如，它仅仅是约十年，因为我们有过这样可靠淋巴标记淋巴血管内皮特定透明质酸受体^{1（LYVE1）20}或podoplanin ^21。共聚焦显微镜提供了新的可能性，研究不同的TI的解剖学特征眼睛的ssues。它允许将用于分化细胞的标记物或用于细胞有关的血管和其它解剖结构的本地化多个污渍。它提供了一个概述当样品是尺寸较大的，使我们能够通过样品扫描中搜索一个特定的细胞类型的时。同的Z-Stack技术，共聚焦显微镜可以用于样品达100-200微米。巩膜的不同之处的肌肉插入后面0.3毫米和在后极¹¹ 1毫米的厚度。由于其厚度和不透明度两者，巩膜不适合用传统的方法共聚焦显微镜。

为了解决这个问题，巩膜组织进行层叠，以允许他们的共聚焦显微镜分析。这项技术是在人类巩膜更好地了解双方的生理和病理情况下非常有用。

Protocol

使用人体组织，必须审查和机构审查委员会或等效的批准。这里所描述的工作被批准由当地伦理委员会批准了科学检查。这项工作是根据赫尔辛基宣言进行。人类巩膜标本采自世界各地的捐助者的眼中（最大验尸时间24小时），在科隆大学眼库眼科部，德国获得。

1.实验准备

1. 制备96％的乙醇，并在不同的管中的磷酸缓冲盐水（PBS）。制备在含有2％牛血清白蛋白（BSA）的PBS的推荐稀释的第一抗体，并保持在冰上的所有解决方案。准备每个样品100微升。
2. 清洁所有乐器和用锋利的手术刀。重复相同的手术刀切割后，改变手术刀。
3. 获得1-2 COLIBRI钳，直微解剖剪刀，＃10手术刀或眼科手术刀微羽毛，和四＆G针。
4. 包裹铝箔周围聚苯乙烯板或使用软木板上贴上组织。一个双目立体显微镜下工作。如果需要一个层流下工作无菌。

2.准备巩膜

1. 轻轻握住灯泡和角巩膜部分进行打孔环锯术，然后旋转环锯。仔细而均匀地旋转环锯在表面上进行同样切割的圆形。使用15.5毫米大小的环钻。与切弯剪剩下的附件。取出角巩膜环锯术。这将导致一个向前打开灯泡。
   1. 把巩膜与开放的部分向上棉签。取出视网膜和葡萄膜，使用镊子COLIBRI拉断从巩膜两个层（视网膜和色素膜）。不要离开在内巩膜色素葡萄膜。用弯剪去除乳头视网膜和葡萄膜。删除REM癌宁结膜，眼外肌，和从表面的巩膜榫的胶囊。
2. 通过使用直型剪刀和镊子COLIBRI中取出所需要的尺寸巩膜样本。取2厘米左右从不同的地点²大小的巩膜样本。由于规模小，轻轻握住巩膜切出所需的尺寸采用了直板型剪刀广场。角巩膜环钻限定巩膜样品的前缘。
   1. 避免与镊子为那里抢到的组织是不适合激光共聚焦显微镜分析区域反复抓。制备所需数目取决于实验的类型的样品（ 例如 ，前方与后方，比较图1）和抗体的使用量。
3. 把样品在1.5ml管中供以后使用。固定在1.5ml 96％乙醇的样品15分钟，然后把它们洗干净三次，每次5分钟在摇床1.5毫升PBS中。如果冷冻组织合作，进行快速冷冻之前这一步。
4. 使用新鲜的组织。但是，如果这是不可能的，卡扣冷冻在液氮巩膜并保持在-20℃以备后用。如果冷冻组织，使用前解冻工作。避免反复冻融循环。
5. 保持在PBS中含有1.5毫升5％的BSA在室温下2小时各样品。此步骤导致这对层叠有帮助的样品的膨胀，也可以防止非特异性结合。
6. 样品已经膨胀后，准备巩膜广场层压。显微镜， 例如 ，一个双目立体显微镜下工作。贴上后巩膜样本以聚苯乙烯膜包裹在铝箔或使用＆G针状软木板上。
7. 弯针的边缘，使它们不与在显微镜下的视野干扰。
8. 层压全层巩膜SAMPLES。
   1. 首先，使用抱钳COLIBRI前巩膜边缘。然后小心地切开使用＃10解剖刀，所述眼科手术刀微羽毛，或刮刀刀片浅表巩膜的薄层。水平握住手术刀和底层层薄薄地切表面层。
   2. 从解剖巩膜广场薄薄一层巩膜。这种方法是比得上标准外科手术技术来小梁切除术过程中制备的翼片和应导致30-80微米厚的层（比较图2）。
9. 通过， 例如 ，50微升PBS中使用移液管加入少量的PBS于组织防止巩膜的干燥。
10. 把切层为100微升PBS在96孔板和标签两个方向（向extern和实习生）和层（肤浅和深刻的）， 例如具有防水颜色。
11. 重复步骤2.7-2.9，直到组织充分地被碾压。</ LI>

3.进行免疫组化

1. 加入100μl所需初级抗体的进入推荐稀释。这里， 例如使用光盘31（单克隆小鼠抗人）和LYVE1抗体（兔抗人），二者以1:1的稀释度：100在PBS（含有2％BSA）并在4℃下孵育过夜。来改变在96孔板的培养基，保持吸管到孔的壁上并取出流体。
2. 第二天，洗涤样品三次，每次5分钟，用200-300微升的PBS上的振动筛。添加100微升相应的次级抗体;这里使用的山羊抗小鼠异硫氰酸荧光素（FITC）和山羊抗兔花青染料3（Cy3标记），并孵育在室温下将样品1-2小时。稀释二级抗体1：300在含有2％山羊血清的PBS中。
3. 再次冲洗样本三次，每次在200-300微升PBS中的5分钟的振动筛。
4. 进行核染色， 如：
5. 转移样品到显微镜载玻片，将它们嵌入在荧光封固剂1-2滴，加盖玻片，由覆盖有透明清漆的边缘密封它，并储存在4℃以备后用或者直接检查用共焦的幻灯片显微镜。
6. 使用共聚焦显微镜（或等同物）来分析样品。使用所需的放大倍率， 例如 10-40X的放大倍率。
7. 为了验证样品的厚度，测量用的Z堆叠共聚焦显微镜。可能的巩膜部分的量取决​​于巩膜的位置，随着厚度的不同之平展和向后（比较介绍）。

Representative Results

在这里进行的实验的代表，也有因使用这种特殊层压技术的衍生论证好处。在第一个实验中示出的巩膜外血管丛的三种代表性的照片（ 图3）的不同的网络。这些船只是积极为CD31。

第二个实验中显示了免疫细胞，在巩膜和它们对CD31阳性血管关系的特定LYVE1 +细胞。这里是在10X放大率用的Z-Stack技术穿过组织进行扫描和理解的血管细胞和免疫细胞（ 图4）的立体关系。

巩膜，以及封闭眼外肌，可以分析血管或免疫细胞的存在; 图5示出了LYVE1阳性细胞和CD31阳性血管。

图1：。人眼的原理图这里是人眼的横截面的示意图，请点击此处查看该图的放大版本。

图2：层压技术原理图巩膜仔细举行COLIBRI镊子和层压成用手术刀罚款层。重复此步骤，导致了可用于共聚焦显微镜薄组织切片。 请点击此处查看该网络的放大版本古尔。

图3：巩膜血管丛，免疫阳性CD31 A和​​B由前巩膜外层衍生，而C是从后位置。比例尺为100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：CD31 +血管和LYVE1 +细胞在Z堆栈，显示他们之间的局部解剖关系小船和较大的可能会重叠。比例尺为100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：在巩膜随函附上眼外肌它们包含类似的细血管网和一些LYVE1 +细胞。比例尺为200微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

层压人类巩膜是这个组织的执行共聚焦显微镜的方法。在这个过程中的一个关键步骤是使用乙醇代替福尔马林用于固定组织。根据我们的经验，使用乙醇代替福尔马林固定时获得更好的结果。钝解剖刀加剧过程，应避免使用。同样地，应避免巩膜的干涸，因为它的复杂性的方法，降低了图像的质量。

对于免疫组织化学染色，可以使用比这里施加的那些其他抗体。在一般情况下，胶原显示更加自体荧光和绿色通道的背景下，因此红色，蓝色，和远红色通道显示具有较少的背景更好的结果。

但是，也有该技术的一些限制。层压巩膜需要大量的练习的，因为它是一个microsc下进行显微外科方法OPE。因为这种技术是手动执行的，在单个层压片是不完全一样的尺寸和一块组织内的厚度不相同。具有完全相同的尺寸的组织中，环钻可能是另一种选择，虽然这些层的厚度仍然会有所不同。以实现用于巩膜部分的精确限定的厚度，一个自动角膜刀可能是未来的实验的替代方法。如果层压使用太多的厚层执行，则封面幻灯片可能脱臼，并且组织有可能干出。巩膜和基质之间的确切边界可能很难，一旦叠片进行区分。

尽管这样，层叠巩膜在使用免疫组化特别是当相对于福尔马林固定的石蜡包埋的免疫组化，这是在目前的临床状况的标准方法有几个优点。层压巩膜允许焦microsc要执行OPY，巩膜的较大尺寸的区域进行分析，要检查的巩膜的不同层，以及筛选和组织的扫描。相反，用福尔马林固定的石蜡包埋的样品时，巩膜预热抗原检索期间改变其在无益的方式的一致性。在整个加热过程中，胶原纤维萎缩和组织失去与滑动接触。以前，在巩膜血管丛只通过使用血管造影技术或在整个安装视图是可见的，但不是在横截面。

除了技术上的困难，巩膜相对无血管和免疫细胞相对较差相比，在眼其他组织，如视网膜。因此，使用福尔马林固定的石蜡包埋的载玻片，这通常是4微米厚，多个幻灯片时，需要检测阳性细胞在巩膜。最近，使用这种laminat被证明ING的技术，人的巩膜不脱，但含有大量LYVE1 +巨噬细胞的积聚血管周围^1。

概括地说，上层叠巩膜部分进行共聚焦显微镜是调查在未来病理疾病，如巩膜炎，葡萄膜炎，或外伤有希望的工具。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% ethanol	Merck Chemicals, Darmstadt, Germany	P075.4
binocular stereo microscope	Motic, Hongkong, China	n.a
26 G needles	Terumo, Leuven, Belgium	303800
15.5 mm trepan	Geuder, Heidelberg, Germany	n.a
no.10 scalpel	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	2E+08
ophthalmic scalpel micro feather	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	no. 7657BR
CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human)	Dako, USA	IR610
LYVE1 antibody  (polyclonal rabbit anti human)	Zytomed, Germany	RBK014-05
goat anti mouse FITC antibody	Sigma Aldrich, Steinheim, Germany	F0257
goat anti rabbit Cy3 antibody	Dianova, Germany	111-165-003
Goat Serum normal	Dako, Glostrup, Denmark	X090710-8
DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335.1
microscope slides	Engelbrecht, Edermünde, Germany	WC7695002
Coverslips 24 mm x 24 mm	Th. Gayer, Lohmar, Germany	7695026
DAKO fluorescent mounting medium	DAKO, USA	S3023
LSM Meta 510 confocal microscopy	Carl Zeiss AG, Jena, Germany	n.a