Abstract
במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) ניתן פרטים על ארגון ultrastructure הסלולר. עם זאת, ניתוח TEM של אוכלוסיות תאים נדירות, במיוחד התאים בתרחיף כמו בתאי גזע hematopoietic (HSCs), נשאר מוגבל בשל הדרישה של מספר תאים גבוה במהלך הכנת המדגם. ישנן כמה גישות cytospin או בשכבה לניתוח TEM ממדגמים נדירים, אבל הגישות האלה לא מצליחות לקבל נתונים כמותיים משמעותיים מהמספר המצומצם של תאים. הנה, גישה חלופית ורומן להכנת מדגם במחקרי TEM מתוארת על אוכלוסיות תאים נדירות המאפשרות ניתוח כמוני.
מספר תאים נמוך יחסית, כלומר, 10,000 HSCs, שימש בהצלחה לניתוח TEM לעומת מיליוני תאים המשמשים בדרך כלל ללימודי TEM. בפרט, מכתים אוונס הכחול בוצע לאחר paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) קיבעון לדמיין את pel התא הזעירבואו, אשר הקלו מוטבע agarose. אשכולות של תאים רבים נצפו בסעיפים דקים. היו תאי מורפולוגיה השתמרה היטב, ואת הפרטים אולטרה-המבניים של המיטוכונדריה המורכב וכמה Golgi נראו. פרוטוקול יעיל, קל לשחזור זו מאפשר הכנת מדגם ממספר תא נמוך וניתן להשתמש בו לצורך ניתוח TEM איכותי וכמותיים על אוכלוסיות תאים נדירות מ דגימות ביולוגיות מוגבלות.
Introduction
Ultra-מבניים תת-אברון הפרטים של תאים נחשפו בעיקר על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (TEM) מחקרים מרקמות או כדורי תא 1,2. חתיכות מוצקות של רקמות יכולות בקלות להיות מנוצלות ללימודים במיקרוסקופ אלקטרונים. עם זאת, TEM מנתח 1,3 על תאים בתרחיף להישאר מאתגר להצריך מספרים סלולריים גבוהים, כלומר, מיליוני תאים. בגלל זה, ניתוחים אולטרה-מבניים של אוכלוסיות תאי נדירות השעיה, למשל, בתאי גזע hematopoietic (HSCs), אינם להעריך בקלות. ניסיונות מרובים עבור ניתוח TEM ממדגמים נדירים תוך שימוש בגישות cytospin או בשכבה מצליחים לקבל נתונים כמותיים משמעותי ממספר מצומצם של תאים. לכן, הדרישה של מספר תאים גבוהים מגבילה את השימוש של כלי רב עצמה זה כדי להבין את פרטי ultrastructural subcellular של אוכלוסיות תאים נדירות.
מגבלת מפתח ללימודי TEM עם מספר מצומצם של תאs השעיה הוא הלוקליזציה של התאים לעיבוד ולכן, מחקרי TEM מתאי מוגבל עם מידות קטנות במיוחד להישאר מאתגר. מספר גישות חלופיות אומצו כדי להתמודד עם מגבלה זו: ארגון ה- BSA / bisacrylamide (BSA-BA) פילמור בתיווך של השעיה התא, צביעת תאים עם צבע כדי לגרום להם גלוי על תמיכה סרט דק כולל coverslips, ו TEM מנתח מן ההכנות cytospin 4-6. עם זאת, הצלחה מוגבלת מאוד הושגה, כמו מעט מאוד תאים נמצאו בסעיפים לאחר חתך אולטרה. האתגר המרכזי של לזיהוי תאים דלילים נמשך משום monolayer התא אינה נראית בעיקר ג'ל הקרושה עבור חתך. יתר על כן, הכנת cytospin של תאים עשויה לשנות הארגון הסלולר שלהם בשל הפצת תא ואת השבריריות של מבנה התא. לפיכך, חסרונות הגלומים אלה מתחייבים גישה חדשנית לבצע מחקרי TEM מן אוכלוסיות תאים נדירות עם יותרעֲקֵבִיוּת. כדי להתגבר על בעיה זו, שתארנו רומן ושיטת הכנת מדגם חלופי מחקרי TEM מן אוכלוסיות תאים נדירות 7.
כאן אנו מדווחים פרוטוקול הכנת מדגם יעיל לבצע TEM מ דגימות ביולוגיות נדירות עם תוצאות איכותיות וכמותיות עקביות. כתמי כחולי אוונס בוצעו לאחר הקיבוע למקם תא גלול זעיר מתאי מספר נמוך, כלומר, 10,000 מח עצם גזע hematopoietic ו ובתאים שאחרת נותרו בלתי נראה, לבין הגלולה הייתה מוטבעת לתוך agarose לפני תהליכי הטמעת התייבשות שרף. שיטה זו אשכולות התאים יחד ומאפשר ניתוח יעיל של ultrastructure וארגון subcellular של תאי גזע hematopoietic (מזוהה לין - SCA-1 + c-Kit + FLT3 - CD34 -; HSC), 0.2 נדיר - האוכלוסייה 0.5% התא במח העצם. פרו ניסיוני זהtocol יכול להיות שימושי כדי לבצע מחקרים אולטרה-מבניים להשיג תוצאות כמותיות על אוכלוסיות נדירות רבות אבל מאוד חשובות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוצדורות אושרו על ידי ועדת בעלי החיים המוסדית קרן המחקר של סינסינטי הילדים. לצורך המחקר, בתאי גזע hematopoietic בודדו ממח העצם של עכברים מולדים C57Bl / 6 בגילים 2 - 4 חודשים. מיון תאים באמצעות FACS לאחר צביעה של BM עם מקבלי משטח שונים כולל Lineage, c-Kit, SCA-1, FLT3 ו- CD34 שימש לטיהור HSC מבוסס על Lin- SCA-1 + c-kit + FLT3 - CD34 - gating אסטרטגיה כמו פרוטוקול סטנדרטי תיאר לפני 8.
זהירות: כימיקלים רעילים מספר מאוד משמשים במהלך הליך זה. אלו הם רעילים משאיפת ומגע עור. יש ללבוש כפפות וביגוד מגן. לעבוד במנדף תוך כדי עבודה עם כימיקלים אלה.
1. תאים, קיבוע, מכתים טרום הטבעה
- מיין 10,000 בתאי גזע hematopoietic (באמצעות לין - SCA-1
- ספין למטה HSCs מיון XG ב 1000 במשך 10 דקות בתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge באמצעות צנטריפוגות עם דליים התנופה-אאוט. הסר בינוני על ידי שאיפה עדינה ולהשאיר 200 בינוני μl של צינורות בכל שלב. בשלב זה, התא הגלול אינו נראה בצינור.
- תקן את התאים על ידי הוספת 0.2 מ"ל של תמיסת מקבע 2x בטמפרטורת החדר (RT) במשך שעה 1 1,9.
- הפוך את הפתרון מקבע טרי לפני השימוש. בשעה 1x, הפתרון מורכב glutaraldehyde paraformaldehyde 3% ו -2.5% במאגר M 0.1 cacodylate.
- צנטריפוגה התאים XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 30 ° C באמצעות צנטריפוגות עם דליים-אאוט התנופה.
- שטפו תאים עם 600 μl של חיץ 0.1 M cacodylateבאמצעות צנטריפוגה ולהשאיר חיץ 200 μl בצינור לאחר צנטריפוגה.
- הכתם התאים קבוע על ידי הוספת 200 μl של 2 פתרון מ"ג / מ"ל של כחול אוונס במאגר cacodylate דגירה במשך 20 דקות ב RT. התא יהיה בצבע כחול.
- לשטוף התאים 3 פעמים עם 600 μl של 0.1 מ 'צנטריפוגה באמצעות חיץ cacodylate ולהשאיר חיץ 200 μl בצינור בכל פעם.
- Re- להשעות את התאים 200 חיץ μl ולהעביר את ההשעיה לתא צינור 0.5 מ"ל. צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 10 דקות באמצעות צנטריפוגות בראש הטבלה. הסר חוצץ בעדינות מבלי להפריע גלולה תא זעיר נראה כעת, ולהשאיר חיץ 50 μl בצינור.
- הוספת 200 מ"ג התכה נמוכה agarose עד 5 מ"ל של 0.1 M חיץ cacodylate בצינור 15 מ"ל פתרון agarose 4%. ממיסים את agarose על ידי העברת צינור למים רותחים בתוך בקבוק זכוכית 100 מ"ל ולשמור פושרים עד בשימוש.
- הוסף 200 μl של 4% התכה נמוכה מומס agarose ב 0.1 M cacodylate חיץ ההשעיה תא צינור 0.5 מ"ל ומיד צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 30 ° C באמצעות צנטריפוגות בראש הטבלה.
- לאחר אישור תאים pelleted בתחתית הצינור 0.5 מ"ל לתוך agarose חצי מוצק לאחר צנטריפוגה, מיד להעביר את הצינור עד 4 מעלות צלזיוס או קרח למשך 20 דקות כדי לחזק את agarose. שלב זה הוא קריטי מאוד, כמו תא גלול גלוי קטן תוצאות שלב זה מקבץ טוב של תאים מתחת למיקרוסקופ האלקטרונים.
- להעביר בזהירות את agarose הקרושה המכיל את התא גלולה מהצינור על צלחת פלסטיק 35 מ"מ פטרי המכילה חיץ באמצעות 3,10 מחט 27 G.
- חתוך את agarose הקרושה המכיל את התא גלולה לתוך חתיכה אחת של כ 1 - 2 מ"מ עם אזמל. מעבירים את פיסת agarose המכיל גלולה לתא צינור 1.5 מ"ל חדש.
- לשטוף 2 - 3 פעמים באמצעות 600 μl של חיץ 0.1 M cacodylate ידי הוספה והסרה של חיץ באמצעות פיפטה ללא צנטריפוגה. השתמש חתיכת agarose זה המכיל את התא גלול עבור לשלב הבא. בשלב זה, המדגם יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני המעבר לשלב הבא.
2. Osmification, התייבשות, והטבעה
- הסר את חוצץ cacodylate מהצינור 1.5 מ"ל עם תא גלולה המכילה באמצעות agarose טפטפת. להוסיף 1.0 מ"ל של 1% אוסמיום ארבע-חמצני (OSO 4) פתרון במנדף, דגירה במשך שעה 1 ב 4 ° C..
- לשטוף שלוש פעמים עם 600 μl של 0.1 מ 'cacodylate חיץ ולהעביר את המדגם כדי בקבוקון הנצנץ זכוכית 20 מ"ל עם מכסה.
- לעבד את המדגם עבור התייבשות, חדירה והטבעה לתוך שרף (למשל, LX-112) עם שינויים סידוריים של הפתרונים הבאים לפי צלחת גם 6. הזז את פיסת agarose תא גלול באמצעות מלקחיים.
- לטבול את המדגם באתנול 25% ב RT במשך 15 דקות.
- לטבול את המדגם באתנול 50% ב RT במשך 15 דקות.
- לטבול את המדגם ב 75% אתנול ב RT במשך 15 דקות.
- לטבול את המדגם באתנול 95% ב RT במשך 15 דקות.
- לטבול את המדגם באתנול 100% ב RT במשך 15 דקות, פעמיים.
- לטבול את המדגם באתנול: שרף (3: 1) ב RT במשך 30 דקות.
- לטבול את המדגם באתנול: שרף (1: 1) ב RT במשך 30 דקות.
- לטבול את המדגם באתנול: שרף (1: 3) ב RT במשך 30 דקות.
- לטבול את המדגם שרף טהור ב RT במשך 60 דקות, פעמיים.
- מעבירים את המדגם לתחתית תבנית גומי בצורת קצה הפירמידה באמצעות מלקחיים בזהירות ולהוסיף שרף טהור יותר על גבי המדגם למלא את התבנית. דגירת המדגם ב 60 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות עבור פילמור שרף.
- סר הפירמידה שרפה polymerized מהתבניות על ידי סיבוב עובש הגומי. אשכול שחור קטן של תאים צריך להיות גלוי בפירמידת שרף polymerized, כפי שתואר קודם לכן 7. צרף הפירמידה שרף polymerized על גליל הרכבה באמצעות cyanoacrylate.
ילדה = "jove_title"> 3. חתך במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים
- חתוך את בלוק הפירמידה עם סכין גילוח וסכין יהלומים לאחר הרכבת הבלוק על-microtome אולטרה. ליצור צורה טרפזית רחבה קצרה עם החלק העליון והחלק התחתון של מקבילי בלוק זה לזה, ועם צדדים זוויתי באופן שווה. צורה זו של הפירמידה מסייעת עבור חתך סדרתי.
- יתר על כן, לקצץ את הבלוק סביב התא גלול עם סכין היהלום ולהסיר את חלקי הפלסטיק סביב יצירת agarose תא הגלולה.
- חותכים 1 מיקרומטר חלקים באמצעות-microtome אולטרה. הזז את 1 מיקרומטר חלקים מהסירה למים לשקופית זכוכית באמצעות כלי עפעף ו כלי לולאת מתכת כפי שדווח בעבר 7. העברת חלקים בשקופיות ומגלשות העברת הצלחת החמה (37 מעלות צלזיוס) במשך ייבוש.
- הוסף טיפה של תמיסת toluidine הכחולה בסעיפים באמצעות מזרק מצויד 0.22 מיקרומטר מסנן דגירה במשך 3 דקות. יש לשטוף את השקופיות במים מזוקקים let בסעיפים לייבוש. בדוק עם מיקרוסקופ אור כדי לזהות את המיקום של התאים.
- חותכים סעיפים דקים (70 - 100 ננומטר) באמצעות סכין יהלום. זז 2 - 3 חלקים על רשתות 200-רשת מהסירה למים בכלי זכוכית פטרי באמצעות כלי עפעף.
- מעביר את צלחת זכוכית פטרי המכילה רשתות עם קטעים על צלחת חמה ב 30 מעלות צלזיוס לייבוש חלקים למשך 30 דקות.
- כתם הרשתות עם טיפות של אצטט uranyl 1% ב RT במשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים 6 - 8 פעמים. הכתם עם ריינולדס להוביל ציטראט, ב RT במשך 5 דקות ולשטוף במים מזוקקים 6 - 8 פעמים. מעביר את צלחת זכוכית פטרי המכילה את הרשתות על צלחת חמה ב 37 מעלות צלזיוס לייבוש חלקות.
- לנתח את החלקים עם מיקרוסקופ אלקטרונים, ב 80 kV 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול יעיל ועקבי להכנת מדגם לבצע ניתוח TEM ממספר נמוך של תאים מתואר. מכתים שלאחר קיבוע עם אוונס כחול העברת התאים צינור 0.5 מ"ל microcentrifuge עזר להמחיש את התא גלולה זעירה 7. Osmification עם אוסמיום ארבע-חמצני ב agarose הביא לגילוי קל של התא גלולה כהה במהלך התייבשות והטבעה.
חלקים חצי דקה מהבלוקים המכילים תא גלול זעיר אשרו מקבץ של תאים רבים יחד (איור 1A ו -1 B). סעיפים דקים נחתכו מהאזור-אשכולות התא ונתחו תחת מיקרוסקופ אלקטרונים (איור 1 ג). המורפולוגיה ו-המבנה אולטרה של תאים אלה השתמרו היטב (1D איור). מיקרוסקופ האלקטרונים של תאים בודדים הראה פרטים גבוהים על תאייםאולטרה-מבנים (איור 1E). יתר על כן, וההגברה הגדולה (50,000X) התמונות הראו מבנה שמור היטב ואת היושרה של אברונים תת-תאיים, כגון המיטוכונדריה (האיור 1F).
איור 1: תמונה ניתוח תחת אור מיקרוסקופ אלקטרוני. (א) תמונה בהגדלה נמוכה של שדה נציג קטע מוכתם toluidine הכחול של 1 מיקרומטר עובי תחת מיקרוסקופ אור. (ב) תמונת מיקרוסקופ אור מראה המורפולוגיה השלמה של תאים באשכול לאחר מכתים toluidine הכחול של 1 מיקרומטר סעיף עובי. (C) שדה סקירה של אשכול תא נצפתה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים לאחר צביעה עם אצטט uranyl ולהוביל ציטראט. (ד) מיקרוסקופ LT-HSC יחיד תחת האלקטרון. (E) magnif גבוההתמונת ication של HSC מראה מבני subcellular. (F) תמונה בהגדלה גבוהה של המיטוכונדריה מן HSPC. סרגל קנה מידה: A / B, 100 מיקרומטר; C, 10 מיקרומטר; D, 2 מיקרומטר; E / F, 500 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה זו מאפשרת ניתוח TEM על מספרים סלולריים נמוכים, באמצעות אוונס מכתים כחול agarose ההטבעה למקם תא גלול זעיר במהלך ההתייבשות, הטבעת השרף ו חתך תהליכים. חשוב לציין, היא שומרת צבירי תאים יחד ושומרת על אולטרה-מבנה התא, אשר רצוי לבחון מספר תאי כימות של נתונים.
במחקרי TEM, תא גלולה המכילה מיליוני תאים נדרשה לעתים קרובות עבור embedment ביותר לתוך מטריצת agarose / ג'לטין לשטיפה, התייבשות וחדירה לקבל נתונים מתאיים רבה. חוקרים אמצו וקיבוע של השעית תא שרף polymerized BSA-bisacrylamide, מכתים של monolayers על תמיכה דקה, או cytospins לניתוח TEM על מספרים סלולריים נמוכים / דגימות נדירות 4-6. עם זאת, הוא נשאר משעממת עבודה בתרגום וחותכי תאים תחת TEM בגלל והתפוצה הדלילה של התאים בתוך מטריקסשינויים אפשריים של מורפולוגיה התא, בשל הפצת מחשוף בין התאים במהלך הכנת cytospin כי לעתים קרובות נדרשים מחדש הטבעה לפני החתך. יתר על כן, בשכבה נותרת מאתגרת למקם עבור חתך 11. לכן, תא גלול אפילו דגימות ביולוגיות נדירות של מספר תאים הנמוך הרבה יותר קל עבור ניתוח TEM 1.
שיטה זו מהווה יתרון משמעותי לשיטות קודמות שפורסמו 4,5 מבחינת ניתוח איכותי וכמוני אולטרה-מבני ממדגמים מוגבלים. יחד, פרוטוקול זה מתאר דרך יעילה למקם את כדורי תא עבור TEM באמצעות אוונס כחול, מה שהופך את עיבוד המדגם מתא נמוך מספרים קל עבור TEM כדי לאפשר ניתוח נתונים איכותיים וכמותיים. בדרך כלל, הכנת המדגם עבור TEM דורשת מספר גדול יותר של תאים ממה בדרך כלל נדרשו עבור מיקרוסקופ אור, בגלל השלבים המרובים f עיבוד המדגםאו TEM וכיוון נכון של גוש התאים לחיתוך במיקום הנכון 1,10.
זה ידוע כי osmification שלאחר הקיבוע מספק ניגוד טוב בתמונות, במיוחד אלה של ממברנות וחלקיקי גליקוגן תחת מיקרוסקופ אלקטרונים 9, והכתים תמיכה נוספת עם אצטט uranyl, כתם יחסי שאינו ספציפי עבור חלבונים, ולהוביל ציטראט כי כתמים ממברנות, חומצות גרעין גליקוגן. עם זאת, osmification כמעט בלתי אפשרית לבצע עם דגימות ביולוגיות נדירות השעיה לאחר הטבעה טרום ב BSA-BA בשל הסבירות הגבוהה של אובדן מדגם במהלך חתך מחשיך מטריקס. לכן איכות micrographs האלקטרונים נפגעה במחקרים קודמים 4,9. Osmification כאן הוביל מחשיך של התא גלול עם שינוי מזערי את הצבע של agarose. לפיכך, הפרוטוקול הנוכחי מאפשר osmification לאחר טרום מוטבע agarose על מנת לספק ניגודיות טובה ב TEM imהגילאים.
צבירי תאים היו די קלים לנתח עם מיקרוסקופ אלקטרונים באמצעות שיטה זו. The-מכתים מראש עם אוונס הכחול עזר למקם כדורי תא זעירים במהלך הכנת מדגם מבלי להשפיע פרטי תא תת-אברון. שיטה זו מציעה גישה חלופית להכנת מדגם לבצע ניתוח TEM בהצלחת ממספרים סלולריים נמוכים. בשיטה זו, ניתוח TEM בוצע ביעילות באמצעות תאים בגודל קטן (5 - 8 מיקרומטר). לכן, גישה זו ניתן לאמץ בקלות עם מספר תאים נמוך עוד יותר (בערך 1000 תאים) של תאים גדולים כגון פיברובלסטים ותאי האנדותל. למרות כחול אוונס לא השפיע פרטי תא תת-אברון במחקר הנוכחי, השימוש אוונס כחול עבור במיקרוסקופ אלקטרונים חיסוני זהב עם מספרים סלולריים נמוכים לא נבדק.
יחד, שיטה יעילה הכנת מדגם לבצע מחקרי TEM ממספר תאים נמוכים מתוארת. מחקרים TEM נדרשים לחשוף criticaמידע l על המורפולוגיה ואת-מבנים אולטרה של תאים. לפיכך, מידע אולטרה-מבני לעתים קרובות חסר על אוכלוסיות תאים שונות נדירות. חלופה זו גישה חדשנית להכנת מדגם תהיה מועילים לבצע מחקרי TEM מכל אוכלוסיית תאים נדירה. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת נתונים איכותיים וכמותיים מניתוח צבירי תאים. כפי במיקרוסקופ אלקטרונים מציע מידע מתחרה של התא אולטרה-מבנה והארגון, שיטה זו תהיה שימושית למדי להבין תהליכים ביולוגיים רבים על מפתח, אבל נדירה, אוכלוסיות תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 °C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic Petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
References
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
- Leapman, R. D.
- Anderson, D. R. A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy. J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).
- Taupin, P. Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy. Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).
- Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy. J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).
- Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).
- Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations. J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).
- Hopwood, D. The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks. Histochemistry. 24, 50-64 (1970).
- Saini, R., et al. Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies. J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).
- Kumar, S., et al. The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation. J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).
