Abstract
투과 전자 현미경 (TEM)을 세포 조직과 미세 구조의 세부 사항을 제공한다. 그러나, 이러한 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포) 희귀 세포 집단, 현탁액, 특히 세포의 TEM 분석에 의한 시료 전처리 동안 높은 세포 수의 요구에 한정 남아있다. 거기에서 부족한 시료 TEM 분석을위한 몇 cytospin 단층 또는 방법이 있지만,이 방법은 셀들의 한정된 수의 상당한 정량 데이터를 얻을 못한다. 여기서, TEM 연구 샘플 준비를위한 다른 신규 한 방법은 정량 분석을 가능 희귀 세포 집단에 대해 설명한다.
비교적 낮은 셀 번호, 즉 10,000 조혈 모세포는 성공적 일반적 TEM 연구에 사용되는 세포의 수많은 비교 TEM 분석에 사용 하였다. 특히, 에반스 블루 염색은 파라 포름 알데히드 - 글루 타르 알데히드 후 작은 세포 화소를 시각화 (PFA-GA) 고정을 시행 하였다아가로 오스에 포함 촉진하는 수 있습니다. 수많은 세포의 클러스터 초박형 섹션에서 관찰되었다. 세포는 잘 보존 된 형태가 있고, 골지 복잡하고 여러 미토콘드리아의 초 구조 세부 사항을 볼 수 있었다. 이 효율적 쉽게 재현 프로토콜은 저 세포 수의 샘플을 제조 할 수 있으며 제한되는 생물학적 시료에서 희귀 세포 집단에 정량적 TEM 분석을 위해 사용될 수있다.
Introduction
세포의 구조 및 울트라 서브 소기관 정보는 주로 투과형 전자 현미경 (TEM) 조직 또는 세포 펠렛으로부터 1,2- 연구에 의해 밝혀왔다. 조직의 단단한 부분은 쉽게 전자 현미경 연구에 이용 될 수있다. 그러나, TEM은 서스펜션의 셀에 1,3 도전을 유지하고 높은 세포 즉, 숫자, 세포의 수백만을 필요로 분석한다. 이 때문에, 서스펜션 희귀 세포 집단의 초 구조 해석은, 예를 들면, 조혈 세포 (조혈 모세포)를 용이하게 평가되지 않는다. cytospin 또는 단일 층 방법을 사용하여 부족한 샘플에서 TEM 분석을위한 여러 시도는 세포의 제한된 수의에서 중요한 정량적 데이터를 얻기 위해 실패합니다. 따라서, 높은 세포 수의 요구 희귀 세포 집단의 세포 내 미세 내용을 이해하는 강력한 도구의 사용을 제한한다.
셀의 한정된 수의 TEM 연구에 중요한 제약현탁액에서의 처리를 위해 셀의 위치 파악하고 이에 따라, 특히 작은 크기의 제한 셀로부터 TEM 연구 도전 남아있다. 여러 가지 다른 접근 방식이 한계에 대응하기 위해 채택 된 다음 BSA / 비스 아크릴 아미드 (BSA-BA) 세포 현탁액의 매개 중합, 커버 슬립을 포함하는 박막 지원에 그들을 볼 수 있도록하는 염료와 세포의 염색, 및 TEM은 cytospin 준비 4-6에서 분석한다. 소수의 세포가 매우 절편 이후 섹션에서 발견 된 그러나, 매우 제한된 성공은 달성되었다. 세포 단층이 절편의 응고 겔의 대부분은 눈에 보이지 않는 남아 있기 때문에 스파 스 세포를 식별의 주요 과제는 지속됩니다. 또한, 세포의 제조 cytospin 인해 셀 확산 셀 구조의 취약성 그들의 세포 조직을 변경할 수있다. 따라서, 이러한 본질적인 결점 더 희귀 한 세포 집단에서 TEM 연구를 수행하는 신규 한 방법을 보증일관성. 이러한 문제를 극복하기 위해, 희귀 세포 집단 (7)로부터의 TEM 연구를위한 새로운 대안 샘플 제조 방법을 설명 하였다.
여기서는 일관성 정량적 결과 부족한 생물학적 시료에서 TEM을 수행하는 효율적인 샘플 준비 프로토콜을보고한다. 에반스 블루 염색 그렇지 않으면 눈에 보이지 않는 남아있을 것입니다 적은 수의 세포, 즉, 만 골수 조혈 줄기 및 전구 세포에서 작은 세포 펠렛을 국산화 고정 후에 수행하고, 펠릿을 탈수 수지 매립 처리 전에 아가로 오스에 포함되었다. 이 방법은 함께 세포 클러스터와 미세 구조 및 LIN (식별 - 무서-1 + 형 c-Kit + FLT3 - CD34 -; HSC) 조혈 줄기 세포의 세포 내 기관의 효율 분석 가능 드문 0.2-0.5 %의 세포 집단을 골수이다. 이 실험 프로로토콜 울트라 구조 연구를 수행하고 희귀하지만 매우 중요한 인구에 대한 정량적 인 결과를 얻기 위해 유용 할 수 있습니다.
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Protocol
모든 실험 절차는 신시내티 아동 연구 재단에서 기관 동물위원회에 의해 승인되었다. 사개월 - 본 연구를 위해, 조혈 줄기 세포는 2 세 C57BL / 6 타고난 쥐의 골수로부터 분리 하였다. CD34 - - 게이팅 전략 리니지, C-키트, 무서-1 등 다양한 표면 업체와 BM의 염색 후 FACS를 사용하여 정렬 셀, FLT3 및 CD34는 선형 적 무서-1 + C-키트 + FLT3에 따라 HSC의 정제에 사용 된 표준 프로토콜은 8 전에 설명했다.
주의 : 여러 독성이 강한 화학 물질이 절차를 수행하는 동안 사용됩니다. 다음은 흡입 및 피부 접촉에 의한 독성. 장갑과 보호 복을 착용하십시오. 이러한 화학 물질로 작업하는 동안 흄 후드에서 작업 할 수 있습니다.
1. 세포, 고정, 염색 및 사전 삽입
- 무서 -1 - 린을 사용하여 정렬 만 조혈 줄기 세포 (
- 스윙 아웃 양동이와 원심 분리기를 사용하여 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 10 분 동안 1,000 XG에서 정렬 된 조혈 모세포를 스핀 다운. 부드럽게 흡인 배지를 제거하고 각 단계에서 튜브에 200 ㎕의 배지를 떠난다. 이 단계에서, 세포 펠렛은 튜브 보이지 남아있다.
- 1,9- 1 시간 동안 실온 (RT)에서 2 배 정착액 용액 0.2 ml를 첨가하여 세포를 고정한다.
- 사용하기 전에 정착 솔루션은 신선한합니다. 1 배, 용액을 0.1 M cacodylate 버퍼에 3 %의 파라 포름 알데히드 및 2.5 % 글루 타르 알데히드로 구성된다.
- 원심 분리기 스윙 아웃 양동이와 원심 분리기를 이용하여 30 ° C에서 10 분 동안 1,000 XG에 세포.
- 0.1 M cacodylate 버퍼 600 μL와 세포를 씻으원심 분리를 이용하여 원심 분리 한 후 튜브에 200 μL 버퍼를 둡니다.
- cacodylate 버퍼 에반스 블루 2 ㎎ / ㎖ 용액 200 μL를 첨가하여 세포를 고정 및 염색 RT에서 20 분 동안 배양한다. 세포는 파란색으로한다.
- 0.1 M cacodylate 버퍼를 사용하여 원심 분리의 600 μL와 세포를 3 회 반복하고 튜브마다 200 ㎕의 버퍼를 둡니다.
- 200 ㎕의 완충액에 세포를 다시 중지 및 0.5 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송. 테이블 탑 원심 분리기를 이용하여 10 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. 부드럽게 지금 눈에 보이는 작은 세포 펠렛을 방해하지 않고 버퍼를 제거하고 튜브에 50 μL 버퍼를 둡니다.
- 4 % 아가로 오스 솔루션을 15 ML 튜브에 0.1 M cacodylate 버퍼 5 ㎖에 아가로 오스 200 밀리그램에게 저 융점를 추가합니다. 100 ml의 유리 병에 끓는 물에 튜브를 전송하여 아가로 오스를 용융하여 사용할 때까지 미지근한 유지.
- 4 % 저 융점 200 μL는 아가로 오스 0.1 M cacodyla에 용해 추가바로 셀 0.5 ML 튜브에 서스펜션과에 테 버퍼는 테이블 위에 원심 분리기를 이용하여 30 ° C에서 10 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기.
- 세포를 원심 분리 후 반고체 아가로 0.5 ㎖의 튜브의 하단 펠릿 것을 확인한 후, 즉시 아가 고화 20 분 동안 39 ° C까지 튜브 또는 얼음을 옮긴다. 이 단계는 전자 현미경으로 세포의 좋은 클러스터에서이 단계의 결과에 작은 가시 세포 펠렛으로서 매우 중요하다.
- 조심스럽게 27 G 바늘을 사용하여 3,10- 버퍼를 포함하는 35mm의 플라스틱 페트리 접시에 관으로부터 세포 펠렛을 함유하는 응고 된 아가로 옮긴다.
- 메스와 2mm - 1의 한 조각으로 세포 펠렛을 함유하는 아가로 오스 고형화 트림. 새로운 1.5 ㎖의 튜브에 세포 펠렛을 함유하는 아가로 오스 편을 전송.
- 추가 및 원심 분리하지 않고 피펫을 사용하여 버퍼를 제거하여 0.1 M cacodylate 버퍼의 600 μl를 사용하여 3 회 - 2 세척. 다음 단계를 위해 세포 펠렛을 함유하는이 아가 로스 편을 사용한다. 이 단계에서, 샘플 밤새 다음 단계로 이동하기 전에 4 ℃에서 저장 될 수있다.
2. Osmification, 탈수, 퍼가기
- 세포 펠렛은 피펫을 사용하여 아가로 오스 함유로 1.5 ML 튜브에서 cacodylate 버퍼를 제거합니다. 흄 후드에서 1 % 오스뮴의 1.0 ㎖ (OSO 4) 솔루션을 추가하고 4 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
- 0.1 M cacodylate 버퍼 600 μL로 3 회 세척하고 모자와 함께 20 ㎖ 유리 섬광 유리 병에 샘플을 전송합니다.
- 탈수, 침투에 대한 샘플을 처리하고 수지에 포함 (예를 들어, LX-112) 6 웰 플레이트에서 다음 솔루션의 직렬 변경. 집게를 사용하여 세포 펠렛 아가로 오스 조각을 이동합니다.
- 실온에서 15 분 동안 25 % 에탄올에서 샘플을 담근다.
- 실온에서 15 분 동안 50 % 에탄올에서 샘플을 담근다.
- 75 %에 샘플을 담가15 분 동안 실온에서 에탄올.
- 실온에서 15 분 동안 95 % 에탄올에서 샘플을 담근다.
- 회, 15 분 동안 실온에서 100 % 에탄올에 담가 샘플.
- 에탄올 샘플 담가 : 수지 (3 : 1)로 RT에서 30 분 동안.
- 에탄올 샘플 담가 : 수지 (1 : 1)로 RT에서 30 분 동안.
- 에탄올 샘플 담가 : 수지 (1 : 3)로 RT에서 30 분 동안.
- 회, 60 분 동안 실온에서 순수한 수지 샘플을 담근다.
- 신중 집게를 사용하여 피라미드 형상의 선단 고무 금형의 바닥에 시료를 전송하고 주형을 채우기 위해 샘플 위에 더 순수한 수지를 추가한다. 수지의 중합을 72 시간 동안 60 ℃에서 샘플을 인큐베이션.
- 고무 몰드를 왜곡하여 금형에서 중합 수지 피라미드를 제거합니다. 이전 7 설명한 바와 같이 세포의 작은 검은 클러스터는 중합 수지 피라미드에서 볼 수 있어야합니다. 시아 노 아크릴 레이트를 사용하여 장착 실린더에 중합 수지 피라미드를 연결합니다.
- 면도날 및 울트라 마이크로톰에 블록을 장착 후의 다이아몬드 칼 피라미드 블록 낸다. 상부 및 서로 병렬 블록의 바닥 짧은 넓은 사다리꼴 형상을하고, 균일하게 각도 양쪽. 피라미드의이 형태는 직렬 절편을 위해 도움이됩니다.
- 또한, 다이아몬드 나이프 세포 펠렛 주변 블록을 잘라 내고 세포 펠렛 아가 로스 편 주위 플라스틱 부분을 제거한다.
- 울트라 마이크로톰을 사용하여 1 μm의 섹션을 잘라. 속눈썹 도구 이전 7보고 금속 루프 도구를 사용하여 유리 슬라이드에 물 보트에서 1 ㎛의 섹션을 이동. 건조 용 핫 플레이트 (37 ° C)에 슬라이드와 이전 슬라이드에 전송 섹션.
- 0.22 ㎛의 필터를 장착하고 3 분 동안 배양 주사기를 사용하여 섹션을 톨루이딘 블루 용액 한 방울을 추가한다. 증류수 L로 슬라이드 린스등 부분은 건조. 셀의 위치를 식별하기 위해 광학 현미경으로 확인한다.
- 다이아몬드 나이프를 사용하여 - (100 nm의 70) 초박형 부분을 잘라. 속눈썹 도구를 사용하여 유리 페트리 접시에 물 보트에서 200 메쉬 그리드 3 부 - 2를 이동합니다.
- 30 분간 부분 건조 30 ℃의 핫 플레이트 섹션 그리드를 함유하는 유리 페트리 접시에 옮긴다.
- 10 분 동안 실온에서 1 % 우라 닐 아세테이트 방울과 그리드를 얼룩 후 증류수에 6 린스 - 8 번. 8 번 - 레이놀즈와 얼룩 6을 5 분 동안 실온에서, 구연산을 주도하고 증류수로 씻어. 부분 건조 37 ℃의 핫 플레이트에 그리드를 함유하는 유리 페트리 접시에 옮긴다.
- 80 kV의 7에서, 전자 현미경으로 분석 섹션.
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Representative Results
샘플 준비에 대한 효율적이고 일관성 프로토콜은 세포의 낮은 숫자는 설명의 TEM 분석을 수행한다. 에반스 블루와 0.5 ml의 microcentrifuge 관에 세포의 이동과 후 고정 염색은 작은 세포 펠렛 7을 시각화 도움을 주었다. 아가로 오스의 산화 오스뮴과 Osmification는 탈수 및 매립 동안 어두운 세포 펠렛의 쉬운 검출되었다.
작은 세포 펠렛을 함유하는 블록 세미 얇은 부분이 함께 다수의 셀의 클러스터 (도 1A 및 1B)를 확인했다. 초박형 섹션 셀 클러스터 지역에서 잘라 전자 현미경 (그림 1C)에서 분석 하였다. 이러한 세포의 형태와 매우 구조가 아니라 (그림 1D) 보존되었다. 개별 세포의 전자 현미경 사진은 세포 내에서 높은 세부 사항을 보여초 구조 (그림 1E). 또한, 고배율 (50,000 배) 이미지가 잘 보존 된 구조 및 미토콘드리아 (도 1F)와 같은 서브 - 세포 소기관의 무결성을 보였다.
그림 1 : 이미지 분석에서 빛과 전자 현미경. (A) 광학 현미경 하에서 1 ㎛ 두께의 톨루이딘 블루 스테인드 섹션의 대표 필드의 낮은 배율 이미지. (B) 1 μm의 두께 섹션의 톨루이딘 블루 염색 후 클러스터에있는 세포의 손상 형태를 보여주는 빛 현미경 이미지. (C) 우라 닐 아세테이트로 염색 시트르산 리드 후에 전자 현미경 하에서 관찰 된 세포 클러스터의 개요 필드. (D) 전자 현미경 단일 LT-HSC. (E) 높은 그니세포 내 구조를 보여주는 HSC의 ication 이미지입니다. (F) HSPC에서 미토콘드리아의 높은 배율 이미지입니다. 스케일 바 : A / B, 100 μm의; C, 10 μm의; D, 2 μm의; E / F, 500 내지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 방법은 에반스에게 블루 염색을 사용하여 아가 로스 탈수, 수지 삽입하는 동안 작은 세포 펠렛을 국산화 삽입 및 프로세스를 절편으로, 낮은 세포 수에 TEM 분석을 할 수 있습니다. 중요한 것은 함께 세포 클러스터를 유지하고 데이터의 정량화를위한 여러 셀을 검사하는 것이 바람직하다 셀 울트라 구조를 유지합니다.
TEM 연구에서, 세포 수백만를 함유하는 세포 펠렛은 종종 다수의 셀들로부터 데이터를 얻기 위해 아가 로스 / 젤라틴 매트릭스로 세척하고, 탈수 및 침투에 대한 효율적인 매립 요구된다. 연구원은 BSA-비스 아크릴 아미드 중합 수지의 세포 현탁액의 고정화를 채택, 낮은 세포 수 / 부족 샘플 4-6 TEM 분석을위한 얇은 지원에 단일 층, 또는 cytospins의 염색. 그러나, 지역화 때문에 매트릭스 내에서 세포의 희박한 분포 하에서 TEM 셀을 절단하기위한 번거로운 작업이 남아때문에 확산 종종 절편 전에 다시 삽입을 요구 cytospin 준비하는 동안 세포 사이의 분열로 세포 형태의 수 변경. 또한, 단일 층 11 절편을위한 현지화 도전 남아있다. 따라서, 심지어 낮은 세포 수의 부족 생물학적 샘플에서 세포 펠렛은 TEM 분석 1 훨씬 쉽습니다.
이 방법은 제한된 샘플에서 정량적 초 구조 분석의 관점에서 이전 문서 4,5- 방법에 큰 이점을 나타낸다. 함께,이 프로토콜은 TEM은 정성 및 정량 데이터 분석을 사용하기 쉬운 낮은 세포 수에서 샘플 처리를하게 에반스 블루를 사용하여 TEM에 대한 세포 펠렛을 지역화 할 수있는 효율적인 방법을 설명합니다. 통상적으로, TEM 용 샘플 준비 때문에 샘플 처리부 (F)의 여러 단계, 통상 광학 현미경에 필요한 것보다 큰 셀의 개수를 필요TEM 오른쪽 위치 1,10에서 절단 셀 블록의 올바른 방향 또는.
사후 고정 osmification 특히 멤브레인 글리코겐 입자들 우라 닐 아세테이트, 단백질 비교적 비특이적 얼룩 전자 현미경 (9)과 상기지지 염색 아래 이미지에서 더 나은 대비를 제공하는 공지 얼룩 시트르산 이끌고 멤브레인 핵산 글리코겐. 그러나 osmification 인해 절편 및 매트릭스 어두워 동안 샘플 손실의 높은 가능성에 BSA-BA에 미리 삽입 후 현탁액 부족 생물학적 샘플을 수행 할 거의 불가능하다. 따라서, 전자 현미경 사진의 품질은 이전 연구 4,9에 노출시켰다. Osmification 여기 아가로 오스의 색상에 최소한의 변화와 세포 펠렛의 어둡게되었다. 이와 같이, 본 프로토콜은 TEM 메신저 양호한 콘트라스트를 제공하기 위하여 아가로 오스에 미리 삽입 한 후 osmification 허용나이.
셀 클러스터는이 방법을 사용하여 전자 현미경으로 분석하는 것은 매우 쉬웠다. 에반스 블루와 사전 염색은 서브 소기관 세포 세부 사항에 영향을주지 않고 샘플 준비하는 동안 작은 세포 펠렛을 현지화하는 데 도움이. 이 방법은 시료 준비 성공적 저 세포 수로부터 TEM 분석을 수행하기위한 다른 방법을 제공한다. (- 8 ㎛의 5) 방법에있어서, TEM 분석 효과적으로 작은 크기의 셀을 사용하여 수행 하였다. 따라서,이 방법은 용이하게 섬유 아세포 및 내피 세포와 같은 더 큰 셀들의 더 낮은 세포 수 (~ 1000 셀)에 채용 할 수있다. 에반스 블루는 본 연구에서 서브 소기관 세포 세부 사항에 영향을 미치지 않았지만, 낮은 세포 수와 면역 골드 전자 현미경을위한 에반스 블루의 사용은 테스트되지 않았습니다.
함께, 저 세포 수로부터 TEM 연구를 수행하기 위해 샘플을 준비하기위한 효율적인 방법을 설명한다. TEM 연구는 비판적를 공개해야형태 및 세포의 초 구조에 리터 정보를 제공합니다. 따라서, 울트라 구조 정보는 종종 다양한 부족한 세포 집단에 없습니다. 이 대안 및 샘플 준비를위한 새로운 접근 방식은 희귀 세포 인구에서 TEM 연구를 수행하는 데 도움이 될 것입니다. 또한,이 방법은 세포의 클러스터 분석에서 정량적 데이터를 허용한다. 전자 현미경은 세포 울트라 구조 및 조직의 타의 추종을 불허하는 정보를 제공하고,이 방법은 꽤 키에 많은 생물학적 과정을 이해하는 데 유용하지만, 희귀 세포 집단 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 °C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic Petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
References
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