De chip-exo Methode: Het identificeren van eiwit-DNA interacties met Near basenparen Precision
Summary
Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.
Abstract
Chromatine immunoprecipitatie (chip) is een onmisbaar instrument op het gebied van de epigenetica en genregulatie dat specifieke eiwit-DNA-interacties isolaten. ChIP gekoppeld met high throughput sequencing (ChIP-seq) wordt vaak gebruikt om de genomische locatie van eiwitten die interageren met chromatine bepalen. Echter, ChIP-seq belemmerd door een relatief lage resolutie in kaart brengen van enkele honderden basenparen en hoge achtergrond signaal. De chip-exo-methode is een verfijnde versie van de chip-seq die substantieel verbetert zowel de resolutie en lawaai. Het belangrijkste verschil van de ChIP-exo methode is het opnemen van lambda exonuclease vertering in de bibliotheek bereiding workflow effectief footprint links en rechts 5 'DNA grenzen van het eiwit-DNA verknoping plaats. De chip-exo bibliotheken worden vervolgens onderworpen aan high throughput sequentiebepaling. De resulterende gegevens kunnen worden benut om unieke en ultra-hoge resolutie inzicht te verschaffen in de functionele organisatie of het genoom. Hier beschrijven we de ChIP-exo methode die wij hebben geoptimaliseerd en gestroomlijnd voor zoogdierlijke systemen en de volgende generatie sequencing-door-synthese platform.
Introduction
Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) is een krachtige methode om mechanismen van genregulatie bestuderen door het selectief verrijken van DNA-fragmenten die interageren met een bepaald eiwit in levende cellen. Detectiemethoden-ChIP verrijkte DNA-fragmenten ontwikkeld als technologie verbetert, van detectie van een enkele locus (standaard ChIP-qPCR) hybridisatie aan oligonucleotide microarrays (ChIP-chip) bij hoge doorvoer sequentiebepaling (ChIP-seq) 1. Hoewel ChIP-seq wijdverbreide toepassing, chromatine heterogeniteit en niet-specifieke DNA-interacties heeft gezien hebben kwaliteit van de gegevens leidt tot valse positieven en onnauwkeurig mapping belemmerd. Om deze beperkingen te omzeilen, Dr. Frank Pugh ontwikkelde de chip-exo-methode 2. De meest opvallende eigenschap van ChIP-exo is verbanden met een 5 'naar 3' exonuclease, effectief footprinting transcriptiefactor bindende plaatsen. Hierdoor de ChIP-exo methode produceert een grotere resolutie, groter dynamisch bereik van detection, en een lager achtergrondgeluid.
Hoewel ChIP-exo is meer technisch uitdagende te beheersen dan ChIP-seq, wordt het op grote schaal aangenomen studies gericht zijn op unieke ultra high-resolution inzichten te krijgen met behulp van diverse biologische systemen 3-8. Inderdaad, ChIP-exo met succes toegepast op bacteriën, gist, muis, rat en humane cellen. Als bewijs van het principe werd ChIP-exo oorspronkelijk gebruikt om de precieze bindingsmotief identificeren een handvol gist transcriptiefactoren 2. De techniek werd ook gebruikt in gist om de organisatie van de transcriptie pre-initiatie complex te bestuderen, en subnucleosomal structuur van verschillende histonen 9,10 ontcijferen. Meer recent, leveraged we ChIP-exo naar aangrenzende TFIIB en Pol II bindend gebeurtenissen in de menselijke initiatiefnemers op te lossen, en toonde aan dat op grote schaal uiteenlopende transcriptie komt voort uit verschillende initiatie complexen 11.
De workflow hier gepresenteerde is geoptimaliseerd en streamlined voor zoogdierlijke ChIP-exo (figuur 1). Eerst worden levend primaire of weefselkweek cellen behandeld met formaldehyde te bewaren in vivo eiwit-DNA-interacties via een covalente verknoping. De cellen worden gelyseerd en chromatine afgeschoven naar ~ 100-500 basenparen grootte fragmenten. ChIP vervolgens selectief verrijkt voor DNA-fragmenten verknoopt aan het eiwit van belang. Op dit punt worden ChIP-seq bibliotheken typisch bereid die inherent de detectieresolutie de gemiddelde fragmentgrootte van enkele honderden basenparen beperkt. Echter, ChIP-exo overwint deze beperking door bijsnijden links en rechts 5 'DNA grenzen van het eiwit-DNA verknoping plaats met lambda exonuclease. Sequencing bibliotheken worden vervolgens geconstrueerd uit DNA exonuclease digestie zoals hieronder beschreven. De resulterende geneste 5 'grenzen vormen een in vivo footprint van de eiwit-DNA-interactie (Figuur 1, stap 14), en worden gedetecteerd door sequenering. although de chip-exo methode is meer betrokken dan ChIP-seq, overgangen tussen de meeste stappen vereist eenvoudige kraal wassen, welk monster verlies en experimentele variabiliteit minimaliseert. Belangrijk is, aangezien ChIP-exo is een verfijnde versie van ChIP-seq, een monster dat is succesvol met chip-seq moet ook succesvol met chip-exo zijn.
De in vivo footprinting van eiwit-DNA interacties met chip-exo resultaten in een fundamenteel verschillende datastructuur van ChIP-seq. Hoewel gemeenschappelijke ChIP-seq bellers kunnen worden toegepast op ChIP-exo data, om de meest nauwkeurige piek gesprekken te verkrijgen raden wij bioinformatica instrumenten die specifiek ontworpen met de unieke structuur van de chip-exo gegevens in het achterhoofd. Deze omvatten Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla en ExoProfiler 12-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
We presenteren een functioneel genomische protocol om de precieze bindende locatie voor chromatine interactie eiwitten in een onbevooroordeelde, genoom-brede wijze op in de buurt van basenparen resolutie te bepalen. De meest kritische stap om in de buurt van basenparen in kaart brengen van de resolutie te bereiken is de exonuclease behandeling van de ChIP verrijkte DNA terwijl de immunoprecipitaat op de magnetische hars blijft. Ogenschijnlijk, kon eiwitcomplexen potentieel te blokkeren in vivo footprintin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Venters Lab and members of the Molecular Physiology and Biophysics Department for helpful discussions. Special thanks to Frank Pugh for his guidance, mentoring, and many insightful discussions on the nuances of ChIP-exo while I was a post-doctoral fellow in his laboratory.
Materials
| 37% formaldehyde, methanol free, 10x10ml ampules | ThermoFisher Scientific | 28908 | Section 3 |
| Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sections 4, 8 |
| Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | Section 5 |
| 15 ml polystyrene tubes | BD Falcon | 352095 | Section 5 |
| MagSepharose Protein G Xtra beads | GE Healthcare | 28-9670-66 | Section 6 |
| DynaMag-1.5ml Side Magnetic Rack | Invitrogen | 12321D | Sections 6-17, 22 |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sections 7, 22 |
| T4 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0203 | Section 9 |
| DNA Polymerase I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Section 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) | New England BioLabs | B7002 | Sections 9-11, 13, 15, 20 |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sections 9-16 |
| ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sections 9, 11, 13 |
| dNTPs | New England BioLabs | N0447 | Sections 9, 12, 19, 23 |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201 | Sections 9, 13 |
| dATP | New England BioLabs | N0440 | Sections 10, 20 |
| Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sections 10, 20 |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202 | Sections 11, 21 |
| Φ-29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269 | Sections 12, 19 |
| 10x Φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sections 12, 19 |
| Lambda Exonuclease | New England BioLabs | M0262 | Section 14 |
| 10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Section 14 |
| RecJf Exonuclease | New England BioLabs | M0264 | Section 15 |
| Proteinase K | Roche Life Science | 03115828001 | Section 16 |
| Glycogen | Roche Life Science | 010901393001 | Section 18 |
| 10x T4 Ligase Buffer | New England BioLabs | B0202 | Section 21 |
| AMPure XP (clean up) beads | Beckman Coulter | A63881 | Section 22 |
| Q5 Hot Start DNA Polymerase | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 25 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
| Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |
References
- Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
- Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
- Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
- Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
- Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
- Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
- Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035 (2015).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339 (2016).
- Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack–a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
- Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638 (2012).
- Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
- Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156 (2014).
- Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24 (2012).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147 (2013).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).
