La méthode ChIP-exo: Identification de protéine-ADN Interactions avec les environs de Base Paire de précision
Summary
Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.
Abstract
Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est un outil indispensable dans les domaines de l'épigénétique et la régulation des gènes qui isole les interactions spécifiques protéine-ADN. ChIP couplé à un séquençage à haut débit (ChIP-seq) est couramment utilisé pour déterminer la localisation génomique des protéines qui interagissent avec la chromatine. Cependant, ChIP-seq est entravée par résolution relativement faible de la cartographie de plusieurs centaines de paires de bases et le signal de fond élevé. La méthode ChIP-exo est une version raffinée de ChIP-seq qui améliore sensiblement à la fois la résolution et le bruit. La distinction clé de la méthodologie ChIP-exo est l'incorporation de lambda exonucléase digestion dans le flux de travail de préparation de la bibliothèque Footprint efficacement la gauche et droite 5 frontières 'ADN du site de réticulation de protéine-ADN. Les bibliothèques de copeau exo sont ensuite soumis à un séquençage à haut débit. Les données obtenues peuvent être mis à profit pour fournir des aperçus uniques et ultra-haute résolution dans l'organisation fonctionnelle of génome. Ici, nous décrivons la méthode ChIP-exo que nous avons optimisé et rationalisé pour les systèmes de mammifères et de prochaine génération plate-forme de séquençage par synthèse.
Introduction
Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une méthode puissante pour étudier les mécanismes de régulation des gènes en enrichissant sélectivement des fragments d'ADN qui interagissent avec une protéine donnée dans les cellules vivantes. Méthodes de fragments d'ADN ChIP enrichi de détection ont évolué comme la technologie améliore, de la détection d'un seul locus (standard ChIP-qPCR) pour hybridation sur microréseaux d'oligonucléotides (ChIP-chip) à séquençage à haut débit (ChIP-seq) 1. Bien que ChIP-seq a vu une large application, l'hétérogénéité de la chromatine et les interactions d'ADN non spécifiques ont entravé la qualité des données conduisant à des faux positifs et la cartographie imprécise. Pour contourner ces limitations, le Dr Frank Pugh a développé la méthode ChIP-exo 2. Le trait saillant de ChIP-exo est qu'il intègre un 5 'à 3' exonucléase, Footprinting efficacement des emplacements de liaison du facteur de transcription. Par conséquent, la méthode ChIP-exo obtient une résolution plus élevée, une plus grande plage dynamique de detection, et le bruit de fond inférieur.
Bien que ChIP-exo est techniquement plus difficile à maîtriser que ChIP-seq, il est largement adopté comme études visent à mieux comprendre à haute résolution ultra uniques en utilisant des systèmes biologiques divers 3-8. En effet, ChIP-exo a été appliquée avec succès à des bactéries, des levures, la souris, le rat et les systèmes cellulaires humains. Comme preuve de principe, ChIP-exo a été initialement utilisé pour identifier le motif de liaison précis pour une poignée de facteurs de transcription de levure 2. La technique a également été utilisée dans la levure pour étudier l'organisation du complexe de pré-initiation de transcription, et à déchiffrer la structure subnucleosomal de diverses histones 9,10. Plus récemment, nous avons tiré parti ChIP-exo pour résoudre TFIIB adjacente et Pol II événements à des promoteurs humains de liaison, et montré que la transcription divergente répandue découle de complexes d' initiation distincts 11.
Le flux de travail présenté ici est optimisé et streamlined pour les mammifères ChIP-exo (Figure 1). Tout d' abord, les cellules vivantes de cultures primaires ou de tissus sont traités avec du formaldéhyde pour préserver dans les interactions protéine-ADN in vivo grâce à une réticulation covalente. Les cellules sont lysées et la chromatine cisaillées à environ 100 – 500 paires de bases de fragments de taille. ChIP puis enrichit sélectivement des fragments d'ADN réticulés à la protéine d'intérêt. A ce stade, les bibliothèques de copeau suivants sont préparés typiquement, ce qui limite inhérente à la résolution de détection de la taille moyenne des fragments de quelques centaines de paires de bases. Cependant, ChIP-exo surmonte cette limitation en coupant le droit 5 frontières 'ADN du site de réticulation de protéine-ADN avec lambda exonucléase et gauche. bibliothèques de séquençage sont ensuite construits à partir de exonucléase ADN digéré comme détaillé ci-dessous. Les frontières imbriquées 5 'résultantes représentent une empreinte in vivo de l'interaction protéine-ADN (figure 1, étape 14), et sont détectées par séquençage à haut débit. Although la méthodologie ChIP-exo est plus impliqué que ChIP-seq, les transitions entre la plupart des étapes nécessite le lavage des billes simple, qui minimise la perte d'échantillonnage et de la variabilité expérimentale. Il est important, puisque ChIP-exo est une version raffinée de ChIP-seq, tout échantillon qui a du succès avec ChIP-seq devrait également avoir du succès avec ChIP-exo.
L'empreinte des interactions protéine-ADN avec des résultats ChIP-exo dans une structure de données fondamentalement distinctes de ChIP-seq in vivo. Bien que les appelants ChIP-seq communs peuvent être appliquées à des données ChIP-exo, pour obtenir des appels de pointe les plus précis, nous recommandons des outils bioinformatiques spécifiquement conçus avec la structure unique de données ChIP-exo à l'esprit. Ceux – ci comprennent Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla et ExoProfiler 12-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons un protocole de génomique fonctionnelle pour déterminer l'emplacement de liaison précise pour chromatine protéines interagissant dans, d'une manière pangénomique impartiale à proximité de la résolution de paires de bases. L'étape la plus critique pour atteindre base près de la résolution de mappage de la paire est un traitement par une exonucléase de l'ADN ChIP enrichi tandis que le reste immunoprécipité sur la résine magnétique. Ostensiblement, des complexes de pr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Venters Lab and members of the Molecular Physiology and Biophysics Department for helpful discussions. Special thanks to Frank Pugh for his guidance, mentoring, and many insightful discussions on the nuances of ChIP-exo while I was a post-doctoral fellow in his laboratory.
Materials
| 37% formaldehyde, methanol free, 10x10ml ampules | ThermoFisher Scientific | 28908 | Section 3 |
| Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sections 4, 8 |
| Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | Section 5 |
| 15 ml polystyrene tubes | BD Falcon | 352095 | Section 5 |
| MagSepharose Protein G Xtra beads | GE Healthcare | 28-9670-66 | Section 6 |
| DynaMag-1.5ml Side Magnetic Rack | Invitrogen | 12321D | Sections 6-17, 22 |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sections 7, 22 |
| T4 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0203 | Section 9 |
| DNA Polymerase I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Section 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) | New England BioLabs | B7002 | Sections 9-11, 13, 15, 20 |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sections 9-16 |
| ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sections 9, 11, 13 |
| dNTPs | New England BioLabs | N0447 | Sections 9, 12, 19, 23 |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201 | Sections 9, 13 |
| dATP | New England BioLabs | N0440 | Sections 10, 20 |
| Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sections 10, 20 |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202 | Sections 11, 21 |
| Φ-29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269 | Sections 12, 19 |
| 10x Φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sections 12, 19 |
| Lambda Exonuclease | New England BioLabs | M0262 | Section 14 |
| 10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Section 14 |
| RecJf Exonuclease | New England BioLabs | M0264 | Section 15 |
| Proteinase K | Roche Life Science | 03115828001 | Section 16 |
| Glycogen | Roche Life Science | 010901393001 | Section 18 |
| 10x T4 Ligase Buffer | New England BioLabs | B0202 | Section 21 |
| AMPure XP (clean up) beads | Beckman Coulter | A63881 | Section 22 |
| Q5 Hot Start DNA Polymerase | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 25 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
| Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |
References
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