Il metodo ChIP-exo: Identificazione interazioni proteina-DNA con Vicino paia di basi di precisione
Summary
Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.
Abstract
Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è uno strumento indispensabile nel campo della epigenetica e regolazione genica che isola specifiche interazioni proteina-DNA. ChIP accoppiato ad alto rendimento sequenziamento (ChIP-seq) viene comunemente utilizzato per determinare la posizione genomica di proteine che interagiscono con cromatina. Tuttavia, Chip-Seq è ostacolata dalla risoluzione mappatura relativamente basso di diverse centinaia di paia di basi e di alta segnale di fondo. Il metodo ChIP-Exo è una versione raffinata di ChIP-Seq che migliora sostanzialmente al momento sia la risoluzione e rumore. La distinzione fondamentale della metodologia ChIP-Exo è l'incorporazione di lambda esonucleasi digestione nel flusso di lavoro di preparazione biblioteca all'impronta efficacemente sinistra e destra 5 confini 'del DNA del sito reticolazione proteina-DNA. Le librerie CHIP-exo vengono poi sottoposti ad alto rendimento sequenziamento. I dati risultanti può essere sfruttata per fornire intuizioni uniche e ultra-alta risoluzione nell'organizzazione funzionale of genoma. Qui, descriviamo il metodo ChIP-exo che abbiamo ottimizzato e semplificato per i sistemi di mammiferi e la piattaforma di sequenziamento per sintesi di nuova generazione.
Introduction
Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è un potente metodo per studiare i meccanismi di regolazione genica da selettivamente arricchente per frammenti di DNA che interagiscono con una certa proteina nelle cellule viventi. Metodi di rilevamento di frammenti di DNA chip arricchito si sono evoluti come la tecnologia migliora, dal rilevamento di un singolo locus (standard ChIP-qPCR) per ibridazione su microarray di oligonucleotidi (Chip-chip) a high-throughput sequencing (ChIP-Seq) 1. Anche se ChIP-Seq ha visto applicazione diffusa, l'eterogeneità della cromatina e le interazioni DNA aspecifiche hanno ostacolato la qualità dei dati che porta a falsi positivi e la mappatura imprecisa. Per aggirare queste limitazioni, il Dr. Frank Pugh ha sviluppato il metodo di ChIP-Exo 2. La caratteristica saliente di ChIP-Exo è che incorpora un 5 'a 3' esonucleasi, footprinting efficace fattore di trascrizione posizioni vincolanti. Come risultato, la metodologia ChIP-exo raggiunge risoluzione maggiore, una maggiore gamma dinamica di detection, e più basso rumore di fondo.
Anche se ChIP-exo è più tecnicamente impegnativo da padroneggiare rispetto ChIP-seq, esso viene ampiamente adottato come gli studi hanno lo scopo di acquisire conoscenze uniche ultra ad alta risoluzione utilizzando diversi sistemi biologici 3-8. Infatti, Chip-exo è stato applicato con successo a batteri, lieviti, topo, ratto, e sistemi di cellule umane. Come prova di principio, Chip-exo è stato originariamente utilizzato per identificare il motivo preciso vincolante per una manciata di trascrizione del lievito fattori 2. La tecnica è stata utilizzata anche nel lievito studiare l'organizzazione del complesso di pre-inizio della trascrizione, e per decifrare la struttura subnucleosomal di vari istoni 9,10. Più di recente, abbiamo sfruttato ChIP-exo per risolvere TFIIB adiacente e Pol II eventi a promotori umani vincolanti, e ha dimostrato che diffuso la trascrizione divergenti deriva da iniziazione distinti complessi 11.
Il flusso di lavoro qui presentata è ottimizzata e streamlined per mammiferi ChIP-Exo (Figura 1). In primo luogo, che vivono cellule di coltura primarie o tessuti sono trattati con formaldeide per preservare in vivo interazioni proteina-DNA attraverso una reticolazione covalente. Le cellule sono lisate e cromatina tosati a ~ 100 – 500 frammenti di dimensioni coppie di basi. ChIP poi arricchisce selettivamente per frammenti di DNA reticolati per la proteina di interesse. A questo punto, librerie ChIP-seq sono tipicamente preparati, che limita intrinsecamente la risoluzione di rilevamento per la dimensione media frammento di qualche centinaio di paia di basi. Tuttavia, ChIP-exo supera questa limitazione tagliando il diritto confini 5 'del DNA del sito reticolazione proteina-DNA con lambda esonucleasi e sinistro. librerie di sequenziamento sono poi costruiti da esonucleasi DNA digerito come di seguito dettagliato. I nidificate 5 'confini risultanti rappresentano un ingombro in vivo dell'interazione proteina-DNA (Figura 1, fase 14), e vengono rilevati da elevata produttività sequenziamento. although la metodologia ChIP-exo è più coinvolto di ChIP-seq, le transizioni tra la maggior parte delle operazioni richiede semplice lavaggio tallone, che riduce al minimo la perdita di campione e la variabilità sperimentale. È importante sottolineare che, dal momento che ChIP-Exo è una versione raffinata di ChIP-seq, qualsiasi campione che è successo con il circuito integrato-Seq dovrebbe anche avere successo con Chip-Exo.
Il footprinting in vivo di interazioni proteina-DNA con risultati ChIP-eso in una struttura dati fondamentalmente diversi dagli ChIP-seq. Anche se i chiamanti CHIP-ss incontrate possono essere applicate ai dati del chip-exo, per ottenere le chiamate di picco più precise si consiglia di strumenti bioinformatici specificamente progettati con la struttura unica di dati del chip-exo in mente. Questi includono Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla, e ExoProfiler 12-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presentiamo un protocollo di genomica funzionale per determinare la posizione di rilegatura preciso per cromatina proteine interagenti in modo imparziale, genome-wide a risoluzione pressi coppia di basi. La fase più critica per ottenere vicino alla base risoluzione pair mappatura è il trattamento esonucleasi del DNA ChIP arricchiti mentre l'immunoprecipitato rimane sulla resina magnetica. Apparentemente, complessi proteici potrebbero potenzialmente bloccare footprinting in vivo di ogni subu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Venters Lab and members of the Molecular Physiology and Biophysics Department for helpful discussions. Special thanks to Frank Pugh for his guidance, mentoring, and many insightful discussions on the nuances of ChIP-exo while I was a post-doctoral fellow in his laboratory.
Materials
| 37% formaldehyde, methanol free, 10x10ml ampules | ThermoFisher Scientific | 28908 | Section 3 |
| Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sections 4, 8 |
| Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | Section 5 |
| 15 ml polystyrene tubes | BD Falcon | 352095 | Section 5 |
| MagSepharose Protein G Xtra beads | GE Healthcare | 28-9670-66 | Section 6 |
| DynaMag-1.5ml Side Magnetic Rack | Invitrogen | 12321D | Sections 6-17, 22 |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sections 7, 22 |
| T4 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0203 | Section 9 |
| DNA Polymerase I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Section 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) | New England BioLabs | B7002 | Sections 9-11, 13, 15, 20 |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sections 9-16 |
| ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sections 9, 11, 13 |
| dNTPs | New England BioLabs | N0447 | Sections 9, 12, 19, 23 |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201 | Sections 9, 13 |
| dATP | New England BioLabs | N0440 | Sections 10, 20 |
| Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sections 10, 20 |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202 | Sections 11, 21 |
| Φ-29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269 | Sections 12, 19 |
| 10x Φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sections 12, 19 |
| Lambda Exonuclease | New England BioLabs | M0262 | Section 14 |
| 10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Section 14 |
| RecJf Exonuclease | New England BioLabs | M0264 | Section 15 |
| Proteinase K | Roche Life Science | 03115828001 | Section 16 |
| Glycogen | Roche Life Science | 010901393001 | Section 18 |
| 10x T4 Ligase Buffer | New England BioLabs | B0202 | Section 21 |
| AMPure XP (clean up) beads | Beckman Coulter | A63881 | Section 22 |
| Q5 Hot Start DNA Polymerase | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 25 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
| Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |
References
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