Метод ЧИП-экзо: Выявление белок-ДНК взаимодействий с Near пар оснований Precision
Summary
Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.
Abstract
Иммунопреципитации хроматина (ЧИП) является незаменимым инструментом в области эпигенетике и регуляции генов, который изолирует специфические взаимодействия белок-ДНК. ЧИП в сочетании с высокой пропускной последовательности (чип-сл) обычно используется для определения геномных расположение белков, которые взаимодействуют с хроматином. Тем не менее, ЧИП-сл препятствует относительно низким разрешением отображения нескольких сотен пар оснований и высокого фонового сигнала. Метод ЧИП-экзо является усовершенствованной версией Обломок-SEQ, который существенно улучшает как разрешение и шума. Ключевое отличие методологии ЧИП-экзо является включение лямбда-экзонуклеазной пищеварение в технологическом процессе подготовки библиотеки для эффективного след левого и правого 5 'ДНК границы перекрещивающимися сайта белок-ДНК. Кристаллодержателя-экзо библиотеки затем подвергаются высокой пропускной последовательности. Полученные данные могут быть использованы для обеспечения уникальных и сверхвысокие понимание разрешения в функциональной организации Oе генома. Здесь мы опишем метод ЧИП-экзо, что мы оптимизировали и обтекаемый для систем млекопитающих и следующего поколения секвенирования посредством синтеза платформы.
Introduction
Иммунопреципитации хроматина (ЧИП) является мощным методом для изучения механизмов регуляции генов путем селективного обогащения фрагментов ДНК, которые взаимодействуют с данным белком в живых клетках. Методы обнаружения фрагментов ДНК Обломок-обогащенная развивались , как технология улучшается, от обнаружения одного локуса (стандарт ЧИП-КПЦР) для гибридизации на олигонуклеотидных микрочипов (ЧИП-чип) до высокой пропускной последовательности (ЧИП-сл) 1. Хотя ЧИП-сл видел широкое применение, хроматина гетерогенность и неспецифических взаимодействий ДНК затрудняют качество данных, ведущий к ложным срабатываниям и неточного отображения. Чтобы обойти эти ограничения, д – р Франк Pugh разработал метод ЧИП-экзо 2. Характерной чертой чиповых-экзо является то, что она включает в себя 5 'к 3' экзонуклеазы, эффективно Footprinting связывания транскрипционных факторов местоположения. В результате методология ЧИП-экзо достигает более высокое разрешение, более широкий динамический диапазон detectioп, и нижний фоновый шум.
Хотя ЧИП-экзо является технически более сложным в освоении , чем Обломок-SEQ, она широко принята в качестве исследования стремятся получить уникальные ультра идеи высокого разрешения с использованием разнообразных биологических систем 3-8. Действительно, ЧИП-экзо был успешно применен для бактерий, дрожжей, мыши, крысы и клеточных систем человека. В качестве доказательства принципа, ЧИП-экзо первоначально использовался для определения точного связывания мотив для горсть дрожжей транскрипционных факторов 2. Этот метод был также использован в дрожжах , чтобы изучить организацию транскрипции предварительного комплекса инициации, и расшифровать subnucleosomal структуру различных гистонов 9,10. Совсем недавно мы использовали Обломок-экзо разрешить соседнюю TFIIB и Pol II связывания событий на человека промоутеров, и показал , что возникает широко распространена расходящимся транскрипции с особым местом инициации комплексов 11.
Рабочий процесс, представленный здесь оптимизирован и streamlined для млекопитающих Обломок-экзо (рисунок 1). Во- первых, живые клетки первичные или культуры тканей обрабатывают формальдегидом , чтобы сохранить в естественных условиях взаимодействия белок-ДНК посредством ковалентной сшивки. Клетки лизируют и хроматина стриженый ~ 100 – 500 фрагментов размером пар оснований. Микросхема выборочно обогащают для фрагментов ДНК сшивают с интересующего белка. На данный момент, Обломок-сл библиотеки обычно получают, что по своей сути ограничивает разрешение обнаружения до среднего размера фрагмента нескольких сотен пар оснований. Тем не менее, ЧИП-экзо преодолевает это ограничение путем обрезки левый и правый 5 'ДНК границы перекрещивающимися сайта белок-ДНК с лямбда-экзонуклеазы. библиотеки секвенирования затем построены из экзонуклеазной расщепленной ДНК, как описано ниже. Полученные в результате вложенные 5 'границы представляют собой след в естественных условиях взаимодействия белок-ДНК (рис 1, стадия 14), и обнаруживаются высокой пропускной последовательности. Altподжилки методология ЧИП-экзо более активное участие, чем Обломок-SEQ, переходы между большинством шагов требует простого мытья шарик, который сводит к минимуму потери пробы и экспериментальной изменчивости. Важно отметить, что так как ЧИП-экзо является усовершенствованной версией Обломок-, любой SEQ образца, который является успешным с микросхемой-SEQ должны также быть успешным с микросхемой-экзо.
Футпринтинга в естественных условиях взаимодействия белок-ДНК с результатами ЧИП-экзо в принципиально отличной от структуры данных Обломок-SEQ. Хотя общие Обломок-сл вызывающие абоненты могут быть применены к данным ЧИП-экзо, чтобы получить наиболее точные пиковые вызовы мы рекомендуем биоинформатики инструменты, специально разработанные с уникальной структурой данных ЧИП-экзо в виду. К ним относятся Genetrack, GEM, Мейс, Peakzilla и ExoProfiler 12-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представляем функциональный геномный протокол для определения точного связывания расположение хроматина взаимодействующих белков непредвзято, общегеномного образом при близком разрешении пар оснований. Самым важным шагом для достижения вблизи базового разрешения отображен…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Venters Lab and members of the Molecular Physiology and Biophysics Department for helpful discussions. Special thanks to Frank Pugh for his guidance, mentoring, and many insightful discussions on the nuances of ChIP-exo while I was a post-doctoral fellow in his laboratory.
Materials
| 37% formaldehyde, methanol free, 10x10ml ampules | ThermoFisher Scientific | 28908 | Section 3 |
| Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sections 4, 8 |
| Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | Section 5 |
| 15 ml polystyrene tubes | BD Falcon | 352095 | Section 5 |
| MagSepharose Protein G Xtra beads | GE Healthcare | 28-9670-66 | Section 6 |
| DynaMag-1.5ml Side Magnetic Rack | Invitrogen | 12321D | Sections 6-17, 22 |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sections 7, 22 |
| T4 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0203 | Section 9 |
| DNA Polymerase I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Section 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) | New England BioLabs | B7002 | Sections 9-11, 13, 15, 20 |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sections 9-16 |
| ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sections 9, 11, 13 |
| dNTPs | New England BioLabs | N0447 | Sections 9, 12, 19, 23 |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201 | Sections 9, 13 |
| dATP | New England BioLabs | N0440 | Sections 10, 20 |
| Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sections 10, 20 |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202 | Sections 11, 21 |
| Φ-29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269 | Sections 12, 19 |
| 10x Φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sections 12, 19 |
| Lambda Exonuclease | New England BioLabs | M0262 | Section 14 |
| 10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Section 14 |
| RecJf Exonuclease | New England BioLabs | M0264 | Section 15 |
| Proteinase K | Roche Life Science | 03115828001 | Section 16 |
| Glycogen | Roche Life Science | 010901393001 | Section 18 |
| 10x T4 Ligase Buffer | New England BioLabs | B0202 | Section 21 |
| AMPure XP (clean up) beads | Beckman Coulter | A63881 | Section 22 |
| Q5 Hot Start DNA Polymerase | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 25 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
| Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |
References
- Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
- Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
- Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
- Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
- Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
- Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
- Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035 (2015).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339 (2016).
- Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack–a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
- Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638 (2012).
- Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
- Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156 (2014).
- Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24 (2012).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147 (2013).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).
