ChIP-エキソ方法：近く塩基対の精度でタンパク質 - DNA相互作用を同定します
Summary
Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.
Abstract
クロマチン免疫沈降（チップ）エピジェネティクスと特定のタンパク質-DNA相互作用を分離する遺伝子調節の分野で不可欠なツールです。ハイスループットシークエンシング（チップ配列）に結合されたチップは、一般に、クロマチンと相互作用するタンパク質のゲノム位置を決定するために使用されます。しかしチップ-配列は数百塩基対の比較的低いマッピング分解能および高いバックグラウンドシグナルによって妨げられます。 ChIP-エキソ方法は、実質的に解像度とノイズの両方を改善するのChIP-seqのの洗練されたバージョンです。 ChIP-エキソ方法論の重要な違いは、効果的にタンパク質-DNA架橋部位の左右の5 'DNAボーダーフットプリントするためのライブラリ作成ワークフローのラムダエキソヌクレアーゼ消化の組み込みです。 ChIPのエキソライブラリーは、高スループット配列決定に供されます。得られたデータは、機能的な組織O中にユニークな超高解像度の洞察を提供するために活用することができゲノムF。ここで、我々は、哺乳動物系と次世代シーケンシング・バイ・合成プラットフォーム向けに最適化し、合理化しているのChIP-エキソ方法について説明します。
Introduction
クロマチン免疫沈降（チップ）が選択的に生きている細胞内の指定されたタンパク質と相互作用するDNA断片を濃縮することにより、遺伝子調節のメカニズムを研究するための強力な方法です。技術は、ハイスループットシークエンシング（チップ配列番号1）をオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（チップオンチップ）のハイブリダイゼーションを単一遺伝子座（標準のChIP-定量PCR）の検出から、改善、チップ富化DNAフラグメントの検出方法が発展してきました。 ChIP-seqが幅広い応用、クロマチン異質と非特異的なDNA相互作用を見たが、偽陽性と不正確なマッピングにつながるデータ品質を妨げてきました。これらの制限を回避するために、博士はフランク・ピューは、チップエキソ方法2を開発しました。 ChIPのエキソの顕著な特徴は、それが効果的に位置転写因子結合をフットプリンティング、エキソヌクレアーゼ5 'から3'を組み込むことです。その結果、チップエキソ方法は、より高い解像度、detectioの大きなダイナミックレンジを達成しますnおよびより低いバックグラウンドノイズ。
ChIP-エキソは、より技術的に困難なのChIP-seqのよりマスターにではあるが研究は、多様な生物学的システム3-8を使用して、ユニークな超高解像度の洞察を得ることを目指しとして、それが広く採用されています。実際に、チップエキソ正常細菌、酵母、マウス、ラット、およびヒトの細胞系に適用されています。原理の証明としてチップエキソは当初、酵母転写因子2の一握りのための正確な結合モチーフを同定しました。技術はまた、転写開始前複合体の組織化を研究するために、種々のヒストン9,10のsubnucleosomal構造を解読するために、酵母中で使用しました。最近では、我々は人間のプロモーターで隣接TFIIBとポルII結合事象を解決するためのChIP-エキソを活用し、かつ広範な発散転写は11と錯体を形成する別個の開始から生じることを示しました。
ここで紹介するワークフローを最適化およびsされます哺乳類のChIP-エキソ（ 図1）のためにtreamlined。まず、生きている一次または組織培養細胞は、共有架橋を介してインビボでタンパク質-DNA相互作用を維持するためにホルムアルデヒドで処理されます。細胞を溶解し、クロマチンは〜100に剪断された – 500塩基対のサイズの断片。チップはその後、選択的に目的のタンパク質に架橋DNA断片のために豊かにします。この時点でのChIP-seqのライブラリーは、典型的には、本質的に、数百塩基対の平均断片サイズに検出分解能を制限する、調製されます。しかし、のChIP-エキソはラムダエキソヌクレアーゼでタンパク質-DNA架橋部位の左右の5 'DNA境界をトリミングすることによって、この制限を克服します。以下に詳述するようにシークエンシングライブラリーは、その後、エキソヌクレアーゼ消化DNAから構成されています。得られたネストされた5 '境界は、タンパク質-DNA相互作用（ 図1、ステップ14）とのインビボでのフットプリントを表し、ハイスループットシークエンシングによって検出されます。 AltキーChIP-エキソ方法論は、チップ-seqのよりも複雑であるハフ、ほとんどの工程間の遷移はサンプルのロスや実験的なばらつきを最小限に抑えるシンプルなビーズの洗浄が必要です。重要なことに、チップエキソは、チップのseq、またのChIP-エキソと成功するはずのChIP-seqのと成功している任意のサンプルの洗練されたバージョンがあるため。
ChIP-seqのとは根本的に別個のデータ構造でのChIP-エキソ結果とタンパク質-DNA相互作用のin vivoフットプリント。共通のChIP-seqの発信者が最も正確なピークのコールを取得するために、ChIPのエキソデータに適用することができるが、我々は、具体的に念頭に置いてのChIP-エキソデータのユニークな構造で設計されたバイオインフォマティクスツールをお勧めします。これらはGenetrack、GEM、MACE、Peakzilla、およびExoProfiler 12-15が含まれます。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、クロマチンが近い塩基対の解像度で公平な、ゲノムワイドな方法で相互作用タンパク質の正確な結合位置を決定するために、機能ゲノムプロトコルを提示します。免疫沈降物は、磁性樹脂のままに近い塩基対のマッピング分解能を達成するための最も重要なステップは、チップに富むDNAのエキソヌクレアーゼ処理です。表向きは、タンパク質複合体は、潜在的に任意のサブユニ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Venters Lab and members of the Molecular Physiology and Biophysics Department for helpful discussions. Special thanks to Frank Pugh for his guidance, mentoring, and many insightful discussions on the nuances of ChIP-exo while I was a post-doctoral fellow in his laboratory.
Materials
| 37% formaldehyde, methanol free, 10x10ml ampules | ThermoFisher Scientific | 28908 | Section 3 |
| Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sections 4, 8 |
| Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | Section 5 |
| 15 ml polystyrene tubes | BD Falcon | 352095 | Section 5 |
| MagSepharose Protein G Xtra beads | GE Healthcare | 28-9670-66 | Section 6 |
| DynaMag-1.5ml Side Magnetic Rack | Invitrogen | 12321D | Sections 6-17, 22 |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sections 7, 22 |
| T4 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0203 | Section 9 |
| DNA Polymerase I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Section 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) | New England BioLabs | B7002 | Sections 9-11, 13, 15, 20 |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sections 9-16 |
| ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sections 9, 11, 13 |
| dNTPs | New England BioLabs | N0447 | Sections 9, 12, 19, 23 |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201 | Sections 9, 13 |
| dATP | New England BioLabs | N0440 | Sections 10, 20 |
| Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sections 10, 20 |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202 | Sections 11, 21 |
| Φ-29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269 | Sections 12, 19 |
| 10x Φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sections 12, 19 |
| Lambda Exonuclease | New England BioLabs | M0262 | Section 14 |
| 10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Section 14 |
| RecJf Exonuclease | New England BioLabs | M0264 | Section 15 |
| Proteinase K | Roche Life Science | 03115828001 | Section 16 |
| Glycogen | Roche Life Science | 010901393001 | Section 18 |
| 10x T4 Ligase Buffer | New England BioLabs | B0202 | Section 21 |
| AMPure XP (clean up) beads | Beckman Coulter | A63881 | Section 22 |
| Q5 Hot Start DNA Polymerase | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 25 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
| Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |
References
- Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
- Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
- Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
- Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
- Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
- Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
- Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035 (2015).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339 (2016).
- Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack–a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
- Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638 (2012).
- Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
- Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156 (2014).
- Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24 (2012).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147 (2013).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).
