שיטת שבב exo: זיהוי אינטראקציות חלבון-דנ"א עם Precision סמוך לבסיס זוג
Summary
Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.
Abstract
הכרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא כלי הכרחי בתחומי אפיגנטיקה ויסות הגנים המבודדת אינטראקציות חלבון-דנ"א ספציפי. שבב מצמידים את רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך) משמש בדרך כלל כדי לקבוע את המיקום הגנומי של חלבונים אינטראקציה עם הכרומטין. עם זאת, שבב seq הקשה על ידי ברזולוצית מיפוי נמוכה היחסי של כמה מאה זוגות בסיסים ו אות רקע גבוהה. שיטת השבב exo היא גרסה מעודנת של שבב seq המשפר באופן משמעותי את שני ברזולוציה ורעש. ההבחנה המפתח של המתודולוגיה שבב exo הוא שילוב של עיכול exonuclease למבדה בתהליך העבודה הכנת הספרייה כדי טביעת רגל שמאל ביעילות וימין 5 גבולות DNA של האתר crosslink חלבון-דנ"א. הספריות-exo שבב חשופים מכן רצף קצב העברת נתונים גבוה. כתוצאת הנתונים ניתן למנף לספק תובנה ברזולוציה ייחודיות ועל עליון לתוך o הארגון הפונקציונליf הגנום. כאן אנו מתארים את שיטת השבב exo כי לנו אופטימיזציה וייעלו למערכות יונקות הדור הבא רצף-ידי-סינתזת פלטפורמה.
Introduction
הכרומטין immunoprecipitation (שבב) היא שיטה רבת עוצמה כדי לחקור מנגנונים של ויסות הגנים על ידי העשרת סלקטיבי עבור שברי דנ"א אינטראקציה עם חלבון נתון בתאים חיים. שיטות איתור של קטעי DNA מועשר שבב התפתחו ככל שהטכנולוגיה משתפרת, מן הגילוי של מוקד יחיד (תקן שבב qPCR) הכלאה על microarrays oligonucleotide (שבב שבב) כדי רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך) 1. למרות-seq השבב רואה יישום נרחב, ההטרוגניות הכרומטין אינטראקציות DNA ספציפיות יש הכבד איכות נתונים המוביל תוצאות חיוביות שגויות ומיפוי מדויק. כדי לעקוף מגבלות אלו, ד"ר פרנק Pugh פיתח את שיטת שבב exo 2. התכונה הבולטת של-exo השבב היא שזה משלב 5 'ל 3' exonuclease, footprinting ביעילות גורם שעתוק מחייבים מקומות. כתוצאה מכך, המתודולוגיה השבב exo משיגה רזולוציה גבוהה יותר, טווח דינמי גדול יותר של detection, ורעש רקע תחתון.
למרות שבב exo הוא יותר מאתגר מבחינה טכנית כדי להתמחות מ שבב seq, בחודשים האחרונים הוא לאימוץ נרחב כמו מחקרים שואפים לקבל תובנה ברזולוציה גבוהה אולטרה ייחודיות באמצעות מערכות ביולוגיות מגוונות 3-8. ואכן,-exo השבב יושם בהצלחה חיידקים, שמרים, עכבר, חולדה, ומערכות תאים אנושיות. כהוכחה עקרונית,-exo השבב שמש במקור כדי לזהות את מוטיב המחייב המדויק בעבור חופן שעתוק שמרים גורם 2. הטכניקה שימש גם בשמרים ללמוד את הארגון של המתחם מראש ייזום שעתוק, וכדי לפענח מבנה subnucleosomal של היסטונים שונים 9,10. לאחרונה, אנו ממונפים-exo השבב לפתור TFIIB הסמוך Pol II מחייב אירועי יזמים אנושיים, והראינו כי שעתוק מסתעף נרחב נובע ייזום ברור קומפלקסי 11.
זרימת העבודה המוצגת כאן היא מותאמת ו- streamlined עבור שבב exo היונק (איור 1). ראשית, התרבות תאים ראשוניים או רקמות חיות מטופלות עם פורמלדהיד לשמר באינטראקציות חלבון-דנ"א vivo באמצעות crosslink קוולנטיים. התאים lysed ו הכרומטין טעון ~ 100 – 500 שברי גודל בסיס זוג. שבב אז מעשיר באופן סלקטיבי עבור קטעי DNA crosslinked לחלבון של עניין. בשלב זה, ספריות-seq שבב ערוכים בדרך כלל, אשר מטבעו מגביל את הרזולוציה זיהוי לגודל שבר הממוצע של כמה מאות זוגות בסיסים. עם זאת, שבב exo מתגבר על מגבלה זו על ידי זמירה משמאל ומימין 5 גבולות DNA של האתר crosslink חלבון-דנ"א עם exonuclease למבדה. ספריות רצף בנויות אז מ- DNA מתעכל exonuclease כמפורט להלן. הגבולות המקוננים 5 'וכתוצאה מכך מייצגים טביעת in vivo של אינטראקצית החלבון-דנ"א (איור 1, שלב 14), והם מזוהים על ידי רצף קצב העברת נתונים גבוה. Altיו המתודולוגיה שבב exo הוא מעורב יותר מאשר שבב seq, מעברים בין רוב השלבים דורש כביסה חרוז פשוט, אשר ממזערת אובדן מדגם ולהבדלים ניסיוני. יודגש, כי בגלל-exo השבב היא גרסה מעודנת של-seq שבב, כל מדגם כי הוא מוצלח עם-seq שבב צריכה גם להצליח עם-exo שבב.
תפקידו של המוסד vivo footprinting של אינטראקציות חלבון-דנ"א עם תוצאות שבב exo במבנה נתונים ברורים במהותו מן-seq שבב. למרות המתקשר שבב seq משותף ניתן להחיל נתוני שבב exo, כדי לקבל את שיחות שיא המדויקות ביותר אנו ממליצים כלי ביואינפורמטיקה שתוכננו במיוחד עם המבנה הייחודי של נתוני שבב exo בראש. אלה כוללים Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla, ו ExoProfiler 12-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מציגים פרוטוקול גנומית תפקודי כדי לקבוע את המיקום המחייב המדויק עבור הכרומטין אינטראקצית חלבוני משוא פנים, רחב-הגנום ברזולוצית זוג הבסיס קרובה. השלב הקריטי ביותר להשיג ברזולוצית מיפוי זוג ליד הבסיס הוא טיפול exonuclease של ה- DNA השבב מועשר בעוד immunoprecipitate נשאר על הש?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Venters Lab and members of the Molecular Physiology and Biophysics Department for helpful discussions. Special thanks to Frank Pugh for his guidance, mentoring, and many insightful discussions on the nuances of ChIP-exo while I was a post-doctoral fellow in his laboratory.
Materials
| 37% formaldehyde, methanol free, 10x10ml ampules | ThermoFisher Scientific | 28908 | Section 3 |
| Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sections 4, 8 |
| Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | Section 5 |
| 15 ml polystyrene tubes | BD Falcon | 352095 | Section 5 |
| MagSepharose Protein G Xtra beads | GE Healthcare | 28-9670-66 | Section 6 |
| DynaMag-1.5ml Side Magnetic Rack | Invitrogen | 12321D | Sections 6-17, 22 |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sections 7, 22 |
| T4 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0203 | Section 9 |
| DNA Polymerase I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Section 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) | New England BioLabs | B7002 | Sections 9-11, 13, 15, 20 |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sections 9-16 |
| ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sections 9, 11, 13 |
| dNTPs | New England BioLabs | N0447 | Sections 9, 12, 19, 23 |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201 | Sections 9, 13 |
| dATP | New England BioLabs | N0440 | Sections 10, 20 |
| Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sections 10, 20 |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202 | Sections 11, 21 |
| Φ-29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269 | Sections 12, 19 |
| 10x Φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sections 12, 19 |
| Lambda Exonuclease | New England BioLabs | M0262 | Section 14 |
| 10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Section 14 |
| RecJf Exonuclease | New England BioLabs | M0264 | Section 15 |
| Proteinase K | Roche Life Science | 03115828001 | Section 16 |
| Glycogen | Roche Life Science | 010901393001 | Section 18 |
| 10x T4 Ligase Buffer | New England BioLabs | B0202 | Section 21 |
| AMPure XP (clean up) beads | Beckman Coulter | A63881 | Section 22 |
| Q5 Hot Start DNA Polymerase | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 25 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
| Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |
References
- Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
- Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
- Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
- Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
- Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
- Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
- Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035 (2015).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339 (2016).
- Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack–a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
- Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638 (2012).
- Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
- Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156 (2014).
- Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24 (2012).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147 (2013).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).
