Der Chip-exo-Methode: Ermittlung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Near-Basenpaar Precision
Summary
Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.
Abstract
Chromatinimmunpräzipitation (Chip-) ist ein unverzichtbares Werkzeug in den Bereichen Epigenetik und Genregulation, die spezifische Protein-DNA-Wechselwirkungen isoliert. ChIP gekoppelt Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) wird allgemein die genomische Lage von Proteinen zu bestimmen, die mit Chromatin in Wechselwirkung treten. Allerdings ChIP-seq wird durch eine relativ geringe Abbildungsauflösung von mehreren hundert Basenpaaren und hohen Hintergrundsignal behindert. Der Chip-exo-Methode ist eine verfeinerte Version von ChIP-seq, die auf sowohl Auflösung und Rauschen wesentlich verbessert. Der Hauptunterschied der ChIP-exo-Methodik ist die Einarbeitung von lambda-Exonuclease-Verdauung in der Bibliothek Vorbereitungsarbeitsablauf, um effektiv die linke Standfläche und rechts 5 'DNA-Grenzen des Protein-DNA-Vernetzungsstelle. Der Chip-exo-Bibliotheken werden dann einer Hochdurchsatz-Sequenzierung unterzogen. Die resultierenden Daten können genutzt werden, um eine einzigartige und extrem hochauflösende Einblicke in die funktionelle Organisation of das Genom. Hier beschreiben wir die ChIP-exo-Methode, die wir optimiert und rationalisiert für Säugetier-Systeme der nächsten Generation Sequenzierung-durch-Synthese-Plattform.
Introduction
Chromatinimmunpräzipitation (Chip-) ist eine leistungsfähige Methode Mechanismen der Genregulation zu untersuchen, indem selektiv für die DNA-Fragmente zu bereichern, die in lebenden Zellen mit einem bestimmten Protein in Wechselwirkung treten. Nachweisverfahren von ChIP angereicherte DNA – Fragmente haben sich weiterentwickelt , wie die Technologie verbessert, von der Erfassung eines einzelnen Locus (Standard ChIP-qPCR) zur Hybridisierung an Oligonukleotid – Mikroarrays (ChIP-Chip) auf Hochdurchsatz – Sequenzierung (ChIP-seq) 1. Obwohl ChIP-seq weit verbreitete Anwendung, Chromatin Heterogenität und unspezifischer DNA-Wechselwirkungen Datenqualität gesehen haben, was zu falsch-positive erschwert und ungenau Mapping. Um diese Einschränkungen zu umgehen, entwickelte Dr. Frank Pugh dem Chip-exo – Methode 2. Das hervorstechendste Merkmal von ChIP-exo ist, dass es eine 5 'zu 3' Exonuklease enthält, effektiv Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen Footprinting. Im Ergebnis erreicht der Chip-exo-Methodik höhere Auflösung, größeren Dynamikbereich von detection und unteren Hintergrundgeräusche.
Obwohl ChIP-exo technisch schwer zu meistern ist als ChIP-seq ist es weithin angenommen wird , wie Studien einzigartige , ultrahochauflösende Einblicke mit verschiedenen biologischen Systemen 3-8 gewinnen wollen. Tatsächlich ChIP-exo wurde auf Bakterien, Hefe, Maus, Ratte und menschlichen Zellsysteme erfolgreich eingesetzt. Als Beweis für das Prinzip wurde ChIP-exo ursprünglich verwendet , um die genaue Bindungsmotiv für eine Handvoll von Hefe – Transkriptions zu identifizieren 2 Faktoren ab . Die Technik wurde auch in Hefe verwendet , um die Organisation des Transkriptions Präinitiationskomplex zu studieren, und subnucleosomal Struktur verschiedener Histone 9,10 zu dechiffrieren. In jüngerer Zeit, Leveraged wir ChIP-exo benachbarten TFIIB und Pol II an menschlichen Promotoren Bindungsereignisse zu lösen, und zeigte , dass weit verbreitete divergente Transkription entsteht aus verschiedenen Initiations 11 – Komplexe.
Der Workflow hier präsentiert wird optimiert und streamlined für Säugetier ChIP-exo (Abbildung 1). Erstens leben primäre oder Gewebekulturzellen mit Formaldehyd behandelt in vivo Protein-DNA – Wechselwirkungen durch eine kovalente Vernetzungs zu erhalten. Die Zellen werden lysiert und Chromatin abgeschert ~ 100-500 Basenpaar Größe Fragmente. ChIP dann reichert selektiv für DNA an das Protein von Interesse vernetzt Fragmente. An diesem Punkt ChIP-seq-Bibliotheken werden typischerweise hergestellt, die von Natur aus begrenzt die Detektionsauflösung auf die durchschnittliche Fragmentgröße von wenigen hundert Basenpaaren. Jedoch ChIP-exo überwindet diese Einschränkung durch die linken und rechten 5'-DNA Grenzen der Protein-DNA-Vernetzungsstelle mit Lambda-Exonuklease Trimmen. Sequencing Bibliotheken werden dann aus Exonuklease verdaut DNA konstruiert, wie unten beschrieben. Die resultierenden verschachtelten 5 'Grenzen stellen eine in vivo Footprint des Protein-DNA – Interaktion (Abbildung 1, Schritt 14) und werden durch Hochdurchsatz – Sequenzierung nachgewiesen. Although der Chip-exo-Methodik mehr beteiligt als ChIP-seq ist, Übergänge zwischen den meisten Schritten erfordert einfache Perle Waschen, die Probenverlust und experimentelle Variabilität minimiert. Wichtig ist, dass da ChIP-exo ist eine verfeinerte Version von ChIP-seq, jede Probe, die mit ChIP-seq sollte auch erfolgreich sein, mit ChIP-exo erfolgreich ist.
Die de – vivo – Fußabdrucks von Protein-DNA – Wechselwirkungen mit ChIP-exo Ergebnisse in einer grundlegend unterschiedliche Datenstruktur von ChIP-seq. Obwohl häufig vorkommend ChIP-seq Anrufern ChIP-exo-Daten angewendet werden kann, die präzisesten Spitzen Anrufe zu erhalten, empfehlen wir die Bioinformatik Tools, die speziell mit der einzigartigen Struktur von ChIP-exo-Daten im Auge behalten. Dazu gehören Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla und ExoProfiler 12-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir präsentieren eine funktionelle Genom Protokoll die genaue Bindungsstelle für Chromatin-interagierende Proteine in einer unvoreingenommenen, genomweite Weise in der Nähe von Basenpaar-Auflösung zu bestimmen. Der wichtigste Schritt in der Nähe von Basenpaar Abbildungsauflösung zu erreichen, ist die Exonuclease-Behandlung des ChIP angereicherte DNA während der Immunopräzipitat auf dem magnetischen Harz bleibt. Vordergründig könnte Proteinkomplexe möglicherweise blockieren in vivo Fußabd…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Venters Lab and members of the Molecular Physiology and Biophysics Department for helpful discussions. Special thanks to Frank Pugh for his guidance, mentoring, and many insightful discussions on the nuances of ChIP-exo while I was a post-doctoral fellow in his laboratory.
Materials
| 37% formaldehyde, methanol free, 10x10ml ampules | ThermoFisher Scientific | 28908 | Section 3 |
| Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sections 4, 8 |
| Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | Section 5 |
| 15 ml polystyrene tubes | BD Falcon | 352095 | Section 5 |
| MagSepharose Protein G Xtra beads | GE Healthcare | 28-9670-66 | Section 6 |
| DynaMag-1.5ml Side Magnetic Rack | Invitrogen | 12321D | Sections 6-17, 22 |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sections 7, 22 |
| T4 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0203 | Section 9 |
| DNA Polymerase I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Section 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) | New England BioLabs | B7002 | Sections 9-11, 13, 15, 20 |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sections 9-16 |
| ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sections 9, 11, 13 |
| dNTPs | New England BioLabs | N0447 | Sections 9, 12, 19, 23 |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201 | Sections 9, 13 |
| dATP | New England BioLabs | N0440 | Sections 10, 20 |
| Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sections 10, 20 |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202 | Sections 11, 21 |
| Φ-29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269 | Sections 12, 19 |
| 10x Φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sections 12, 19 |
| Lambda Exonuclease | New England BioLabs | M0262 | Section 14 |
| 10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Section 14 |
| RecJf Exonuclease | New England BioLabs | M0264 | Section 15 |
| Proteinase K | Roche Life Science | 03115828001 | Section 16 |
| Glycogen | Roche Life Science | 010901393001 | Section 18 |
| 10x T4 Ligase Buffer | New England BioLabs | B0202 | Section 21 |
| AMPure XP (clean up) beads | Beckman Coulter | A63881 | Section 22 |
| Q5 Hot Start DNA Polymerase | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 25 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
| Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |
References
- Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
- Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
- Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
- Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
- Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
- Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
- Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035 (2015).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339 (2016).
- Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack–a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
- Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638 (2012).
- Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
- Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156 (2014).
- Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24 (2012).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147 (2013).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).
