칩 엑소 방법 : 가까운 자료 쌍의 정밀과 단백질 DNA 상호 작용을 확인
Summary
Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.
Abstract
크로 마틴 면역 침강 (칩)은 후성 유전학 및 특정 단백질 DNA 상호 작용을 분리 유전자 조절의 분야에서 필수적인 도구입니다. 높은 처리량 시퀀싱 (칩 서열)에 결합 된 칩은 일반적으로 염색질 상호 작용 단백질의 게놈 위치를 결정하기 위해 사용된다. 그러나, 칩 서열은 수백 염기쌍 비교적 낮은 매핑 해상도 및 높은 백그라운드 신호에 의해 방해된다. 칩 엑소 방법은 실질적으로 해상도 및 노이즈 모두 개선 한 칩 서열의 정제 된 버전이다. 칩 엑소 방법론의 키 차이는 효과적으로 왼쪽 풋 프린트 라이브러리 준비 워크 플로의 람다 엑소 뉴 클레아 제 소화의 설립 및 단백질 DNA의 가교 사이트의 오른쪽 5 'DNA 테두리입니다. 칩 엑소 라이브러리는 다음 높은 처리량 시퀀싱을 실시한다. 얻어진 데이터는 기능적 조직 O에 고유 초 고해상도 통찰력을 제공하기 위해 활용 될 수있다게놈 바. 여기, 우리는 우리가 최적화 및 포유류 시스템과 차세대 시퀀싱 합성에 의한 플랫폼 간소화 한 칩 – 엑소 방법을 설명합니다.
Introduction
크로 마틴 면역 침강 (칩)을 선택적으로 살아있는 세포에서 특정 단백질과 상호 작용하는 DNA 단편을 위해 농축에 의해 유전자 조절 메커니즘을 연구하는 강력한 방법이다. 기술은 높은 처리량 시퀀싱 (칩-SEQ) 1 올리고 뉴클레오티드 마이크로 어레이 (칩 – 칩)에 하이브리드에 하나의 궤적 (표준 칩-qPCR에) 검출에서 향상으로 칩 농축 DNA 단편의 검출 방법은 진화했다. 칩-서열이 광범위한 응용 프로그램, 염색질 이질성과 비특이적 DNA 상호 작용을 볼 수 있지만 오탐 (false positive)과 부정확 한 매핑 최고의 데이터 품질을 방해했다. 이러한 제한을 우회하기 위해, 박사 프랭크 퓨는 칩 – 엑소 방법 (2)를 개발했다. 칩 엑소의 두드러진 특징은 효율적으로 위치를 결합 전사 인자를 footprinting에, 엑소 뉴 클레아 '3', 5를 포함하고 있다는 것이다. 결과적으로, 칩 – 엑소 방법은 높은 해상도 detectio의 큰 동적 범위를 달성n 및 낮은 소음.
칩 – 엑소 좀 더 기술적으로 어려운 칩-서열보다 마스터하지만 연구는 다양한 생물학적 시스템 3-8를 사용하여 고유의 초 고해상도 통찰력을 확보하는 것을 목표로, 그것은 널리 채택되고있다. 실제로, 칩 엑소 성공적 박테리아, 효모, 마우스, 래트, 인간 세포 시스템에 적용되어왔다. 원리의 증거로, 칩 – 엑소는 원래 효모 전사의 소수는 2 요인에 대한 정확한 바인딩 모티브를 식별하는 데 사용되었다. 이 기술은 또한 전사 개시전 복합체의 구성을 연구하기 위해 다양한 히스톤 9,10 subnucleosomal의 구조를 해독 효모에 사용 하였다. 최근에, 우리는 인간의 발기인에 이벤트를 바인딩 인접 TFIIB와 폴 II를 해결하기 위해 칩 – 엑소을 활용, 별개의 개시 11 복합체에서 널리 발산 전사가 발생하는 것으로 나타났다.
여기에 제시된 워크 플로우 최적화의있다포유 동물 칩 – 엑소 (그림 1)에 대한 treamlined. 첫째, 생활 차 또는 조직 배양 세포를 공유 가교를 통해 생체 내 단백질 DNA 상호 작용에 보존하는 포름 알데히드로 처리됩니다. 세포 용균 및 염색질은 100 ~ 전단된다 – 500 염기쌍 크기 단편. 칩은 선택적으로 관심있는 단백질에 가교 결합 된 DNA 단편에 대한 풍부. 이 시점에서, 칩은 일반적 서열 라이브러리 본질적 수백 염기쌍 단편의 평균 크기를 검출 해상도를 제한하는 제조된다. 그러나, 칩 엑소 왼쪽 및 람다 엑소 뉴 클레아 제와 단백질의 DNA 가교 부위의 바로 5 'DNA 경계를 트리밍함으로써 이러한 제한을 극복한다. 아래에 설명 된대로 시퀀싱 라이브러리는 다음 엑소 뉴 클레아 제 소화 DNA로 구성되어있다. 얻어진 중첩 5 '테두리 단백질 DNA 상호 작용 (도 1, 스텝 14)의 생체 내 공간을 나타내고, 높은 처리량 시퀀싱에 의해 검출된다. Alt 키무릎이 칩 엑소 방법은 칩-서열보다 더 복잡 대부분의 단계 사이의 전환은 샘플 손실과 실험적인 변동성을 최소화 간단한 비드 세척을 필요로한다. 중요한 것은, 칩 – 엑소는 칩-SEQ, 또한 칩 – 엑소에 성공한다 칩-서열에 성공하는 샘플의 세련된 버전 때문이다.
칩 서열에서 근본적으로 구별되는 데이터 구조의 칩 엑소 결과 단백질 DNA의 상호 작용의 생체 배출량 측정. 공통 칩 서열 발신자가 가장 정확한 피크 호출을 수득 칩 엑소 데이터에 적용될 수 있지만, 우리는 특별히 염두 칩 엑소 데이터의 독특한 구조로 설계 정보학 도구를 추천한다. 이들은 Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla 및 ExoProfiler 12-15을 포함한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 염색질 근처 염기쌍 해상도 편견, 게놈 차원의 방식으로 단백질 상호 작용에 대한 정확한 결합 위치를 결정하기 위해 기능 유전체학 프로토콜을 제시한다. 면역 침전이 자성 수지에 남아있는 동안 근처 염기쌍 매핑 해상도를 얻기 위해 가장 중요한 단계는 칩 – 풍부 DNA의 엑소 뉴 클레아 제 처리이다. 표면 상, 단백질 복합체는 잠재적으로 주어진 서브 유닛 (예를 들어, 크로 마?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Venters Lab and members of the Molecular Physiology and Biophysics Department for helpful discussions. Special thanks to Frank Pugh for his guidance, mentoring, and many insightful discussions on the nuances of ChIP-exo while I was a post-doctoral fellow in his laboratory.
Materials
| 37% formaldehyde, methanol free, 10x10ml ampules | ThermoFisher Scientific | 28908 | Section 3 |
| Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sections 4, 8 |
| Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | Section 5 |
| 15 ml polystyrene tubes | BD Falcon | 352095 | Section 5 |
| MagSepharose Protein G Xtra beads | GE Healthcare | 28-9670-66 | Section 6 |
| DynaMag-1.5ml Side Magnetic Rack | Invitrogen | 12321D | Sections 6-17, 22 |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sections 7, 22 |
| T4 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0203 | Section 9 |
| DNA Polymerase I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Section 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) | New England BioLabs | B7002 | Sections 9-11, 13, 15, 20 |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sections 9-16 |
| ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sections 9, 11, 13 |
| dNTPs | New England BioLabs | N0447 | Sections 9, 12, 19, 23 |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201 | Sections 9, 13 |
| dATP | New England BioLabs | N0440 | Sections 10, 20 |
| Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sections 10, 20 |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202 | Sections 11, 21 |
| Φ-29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269 | Sections 12, 19 |
| 10x Φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sections 12, 19 |
| Lambda Exonuclease | New England BioLabs | M0262 | Section 14 |
| 10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Section 14 |
| RecJf Exonuclease | New England BioLabs | M0264 | Section 15 |
| Proteinase K | Roche Life Science | 03115828001 | Section 16 |
| Glycogen | Roche Life Science | 010901393001 | Section 18 |
| 10x T4 Ligase Buffer | New England BioLabs | B0202 | Section 21 |
| AMPure XP (clean up) beads | Beckman Coulter | A63881 | Section 22 |
| Q5 Hot Start DNA Polymerase | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 25 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
| Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |
References
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