ChIP-ekzo Yöntem: Base Çifti Hassas Protein-DNA Etkileşimleri belirlenmesi
Summary
Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.
Abstract
Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) epigenetik ve spesifik protein-DNA etkileşimlerini izolatlarının gen regülasyonu alanlarında vazgeçilmez bir araçtır. Yüksek verimli sekanslama (Chip seq) bağlı ChIP yaygın kromatin etkileşim proteinlerin genomik konumunu belirlemek için kullanılır. Ancak, ChIP-seq birkaç yüz baz çifti nispeten düşük haritalama çözünürlük ve yüksek arka plan sinyali tarafından engellenmektedir. ChIP-ekzo yöntemi esas çözünürlük ve gürültü hem geliştirir ChIP-seq bir rafine versiyonu. ChIP-ekzo metodolojisinin kilit ayrım etkili bir sol ayak izini kütüphane hazırlık iş akışında lambda eksonükleaz sindirim birleşme ve protein-DNA çapraz sitenin sağ 5 'DNA sınırları olduğunu. ChIP-ekso diziler daha sonra, yüksek sekanslama tabi tutulur. Elde edilen veriler fonksiyonel organizasyon o içine eşsiz ve ultra-yüksek çözünürlüklü bir anlayış sağlamak için kaldıraçlı olabilirgenom f. Burada, biz optimize edilmiş ve memeli sistemlerinde ve yeni nesil dizileme-by-sentez platformu için aerodinamik olan ChIP-exo yöntem açıklanmaktadır.
Introduction
Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) seçici canlı hücreler belirli bir protein ile etkileşime DNA fragmanlarının için zenginleştirerek gen regülasyonu mekanizmaları incelemek için güçlü bir yöntemdir. Teknolojisi, yüksek verimlilik sıralaması (ChIP-seq) 1 ila oligonükleotid array (ChIP-chip) üzerine melezleşme tek bir lokus (standart ChIP-qPCR) tespiti itibaren, iyileştikçe ChIP zenginleştirilmiş DNA parçalarının tespit yöntemleri geliştirmişlerdir. ChIP-seq yaygın bir uygulama, kromatin heterojeniteyi ve nonspesifik DNA etkileşimleri gördü rağmen yanlış pozitif ve kesin olmayan eşleme önde gelen veri kalitesi engel olmuştur. Bu sınırlamaları aşmak için, Dr. Frank Pugh ChIP-ekzo yöntemi 2 geliştirdi. ChIP-ekso belirgin özelliği etkin yerleri bağlayıcı transkripsiyon faktörü ayak izi, ekzonükleaz 'ila 3' 5 sahip olmasıdır. Sonuç olarak, ChIP-exo metodolojisi daha yüksek çözünürlük, gözetleme daha dinamik aralık elden ve alt arka plan gürültü.
ChIP-exo daha teknik açıdan zor ChIP-seq daha usta olmasına rağmen çalışmalar çeşitli biyolojik sistemler 3-8 kullanarak benzersiz ultra yüksek çözünürlüklü anlayışlar kazanmak amacı olarak, yaygın olarak kabul ediliyor. Gerçekten de, yonga-ekso başarılı bakteri, maya, fare, sıçan ve insan hücre sistemlerine uygulanmıştır. Prensip kanıtı olarak, ChIP-exo başlangıçta maya transkripsiyon bir avuç 2 faktörleri için kesin bağlayıcı motifi tanımlamak için kullanıldı. Bu teknik aynı zamanda, transkripsiyon, ön başlatma kompleksinin organizasyonunu çalışma ve çeşitli histon 9,10 subnucleosomal yapısını çözmek için maya kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, insan rehberleri etkinliklerde bağlama bitişik TFIIB ve Pol II gidermek için ChIP-exo kaldıraçlı ve farklı başlangıç 11 kompleksleri gelen yaygın farklı transkripsiyon ortaya gösterdi.
Burada sunulan iş akışı optimize ve sMemeli ChIP-ekso (Şekil 1) için treamlined. İlk olarak, canlı birincil ya da doku kültürü hücreleri, bir kovalent çapraz bağlanırlar in vivo protein-DNA etkileşim bölgesindeki korumak için formaldehit ile muamele edilir. Hücreler parçalanır ve kromatin ~ 100 makaslanmış – 500 baz çifti boyutu fragmanları. ChIP sonra seçici ilgili protein çapraz bağlanmış DNA parçaları için zenginleştirir. Bu noktada, yonga-DİZİ kütüphaneler doğal birkaç yüz baz çifti ortalama fragman büyüklüğü algılama çözünürlüğünü sınırlar hazırlanır. Ancak, ChIP-exo sol ve lambda eksonükleaz ile protein-DNA çapraz sitenin sağ 5 'DNA sınırları kırparak bu sınırlama üstesinden gelir. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi Ardışık kütüphaneleri eksonükleaz ile sindirilmiş DNA inşa edilir. Elde edilen iç içe geçmiş 5 'sınırları protein-DNA etkileşim (Şekil 1, aşama 14), bir in vivo ayak izi temsil eder ve yüksek sekanslama ile tespit edilir. Although ChIP-ekzo metodolojisi ChIP-seq daha katılır, çoğu adımlar arasındaki geçişler örnek kaybı ve deneysel değişkenliği en aza indirir basit boncuk yıkama gerektirir. Önemlisi, ChIP-ekzo ChIP-seq, aynı zamanda ChIP-exo başarılı olmalıdır ChIP-seq ile başarılı herhangi bir örnek bir rafine versiyonu beri.
ChIP-seq bir temelde farklı bir veri yapısında ChIP-ekzo sonuçları ile protein-DNA etkileşimleri in vivo ayak izi. Ortak ChIP-seq arayanlar en hassas zirve aramaları elde etmek için, ChIP-ekzo verilerine tatbik edilebilir ancak biz özellikle akılda ChIP-ekzo verilerin benzersiz yapısı ile tasarlanmış biyoinformatik araçlar öneriyoruz. Bunlar Genetrack, GEM, OKVO, Peakzilla ve ExoProfiler 12-15 arasındadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz kromatin yakın baz çifti çözünürlükte bir tarafsız, genom şekilde proteinlerin etkileşim için kesin bağlayıcı konumunu belirlemek için fonksiyonel genomik protokol mevcut. İmmüno manyetik reçine kalırken yakın baz çifti haritalama çözünürlük elde etmek için en kritik adım ChIP zenginleştirilmiş DNA eksonükleaz tedavi yöntemidir. Görünüşte, protein kompleksleri potansiyel herhangi bir alt birimi (örn kromatin remodeling kompleksleri veya nükleozom çekirdek parçac…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Venters Lab and members of the Molecular Physiology and Biophysics Department for helpful discussions. Special thanks to Frank Pugh for his guidance, mentoring, and many insightful discussions on the nuances of ChIP-exo while I was a post-doctoral fellow in his laboratory.
Materials
| 37% formaldehyde, methanol free, 10x10ml ampules | ThermoFisher Scientific | 28908 | Section 3 |
| Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sections 4, 8 |
| Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | Section 5 |
| 15 ml polystyrene tubes | BD Falcon | 352095 | Section 5 |
| MagSepharose Protein G Xtra beads | GE Healthcare | 28-9670-66 | Section 6 |
| DynaMag-1.5ml Side Magnetic Rack | Invitrogen | 12321D | Sections 6-17, 22 |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sections 7, 22 |
| T4 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0203 | Section 9 |
| DNA Polymerase I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Section 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) | New England BioLabs | B7002 | Sections 9-11, 13, 15, 20 |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sections 9-16 |
| ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sections 9, 11, 13 |
| dNTPs | New England BioLabs | N0447 | Sections 9, 12, 19, 23 |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201 | Sections 9, 13 |
| dATP | New England BioLabs | N0440 | Sections 10, 20 |
| Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sections 10, 20 |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202 | Sections 11, 21 |
| Φ-29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269 | Sections 12, 19 |
| 10x Φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sections 12, 19 |
| Lambda Exonuclease | New England BioLabs | M0262 | Section 14 |
| 10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Section 14 |
| RecJf Exonuclease | New England BioLabs | M0264 | Section 15 |
| Proteinase K | Roche Life Science | 03115828001 | Section 16 |
| Glycogen | Roche Life Science | 010901393001 | Section 18 |
| 10x T4 Ligase Buffer | New England BioLabs | B0202 | Section 21 |
| AMPure XP (clean up) beads | Beckman Coulter | A63881 | Section 22 |
| Q5 Hot Start DNA Polymerase | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 25 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
| Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |
References
- Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
- Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
- Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
- Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
- Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
- Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
- Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035 (2015).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339 (2016).
- Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack–a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
- Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638 (2012).
- Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
- Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156 (2014).
- Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24 (2012).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147 (2013).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).
