Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Estimering av plantebiomasse Lignin-innhold ved bruk av thioglykolsyre (TGA)

Published: July 24, 2021 doi: 10.3791/62055
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University, 2Fiber and Biopolymer Research Institute (FBRI), Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University

Summary

Her presenterer vi en modifisert TGA-metode for estimering av lignininnhold i urteaktig plantebiomasse. Denne metoden estimerer lignininnholdet ved å danne spesifikke thioetherbindinger med lignin og gir en fordel i forhold til Klason-metoden, da det krever et relativt lite utvalg for lignininnholdsestimering.

Abstract

Lignin er en naturlig polymer som er den nest mest tallrike polymeren på jorden etter cellulose. Lignin er hovedsakelig avsatt i plantens sekundære cellevegger og er en aromatisk heteropolymer som hovedsakelig består av tre monolignoler med betydelig industriell betydning. Lignin spiller en viktig rolle i plantevekst og utvikling, beskytter mot biotiske og abiotiske påkjenninger, og i kvaliteten på dyrefôr, tre og industrielle ligninprodukter. Nøyaktig estimering av lignininnhold er avgjørende for både grunnleggende forståelse av ligninbiosyntese og industrielle anvendelser av biomasse. Thioglykolsyremetoden (TGA) er en svært pålitelig metode for å estimere det totale lignininnholdet i plantebiomassen. Denne metoden estimerer lignininnholdet ved å danne tioethers med benzylalkoholgruppene av lignin, som er oppløselige i alkaliske forhold og uoppløselige i sure forhold. Det totale lignininnholdet er estimert ved hjelp av en standardkurve generert fra kommersiell bambus lignin.

Introduction

Lignin er en av de vitale bærende komponentene i plantecellevegger og den nest mest tallrike polymeren på jorden1. Kjemisk er lignin en krysskoblet heteropolymer som består av komplekse fenolforbindelser med høy molekylvekt som danner en naturlig fornybar kilde til aromatiske polymerer og syntese av biomaterialer2,3. Denne naturlige polymeren spiller betydelige roller i plantevekst, utvikling, overlevelse, mekanisk støtte, celleveggstivhet, vanntransport, mineraltransport, losjimotstand, vevs- og organutvikling, avsetning av energi og beskyttelse mot biotiske og abiotiske påkjenninger4,5,6,7. Lignin består hovedsakelig av tre forskjellige monolignoler: nåletyl, sinapyl og p-coumarylalkoholer som er avledet fra fenylpropanoidveien8,9. Mengden lignin og sammensetningen av monomerer varierer basert på plantearter, vev / organtype og forskjellige stadier av planteutvikling10. Lignin er bredt klassifisert i mykt tre, hardved og gress lignin basert på kilden og monolignolsammensetningen. Mykved består hovedsakelig av 95% nåletylalkohol med 4% p-coumaryl og 1% sinapylalkoholer. Hardved har nåletyl- og sinapylalkoholer i like store mengder, mens gress lignin består av ulike proporsjoner av nåletyl, sinapyl og p-coumarylalkoholer11,12. Sammensetningen av monomerer er kritisk da den bestemmer ligninstyrken, nedbrytningen og nedbrytningen av celleveggen, samt bestemmer molekylær struktur, forgrening og krysskobling med andre polysakkarider13,14.

Lignin forskning får betydning i foraging, tekstilindustrien, papirindustrien, og for bioetanol, biodrivstoff og bio-produkter på grunn av sin lave pris og høye overflod15,16. Ulike kjemiske metoder (f.eks. acetylkymid, syrevaskemidler, Klason og permanganatoksidasjon) sammen med instrumentelle metoder (f.eks. nær infrarød (NIR) spektroskopi, kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi og ultrafiolett (UV) spektrofotometri) ble brukt til lignin kvantifisering9,17. Analysemetodene for lignin er generelt klassifisert basert på elektromagnetisk stråling, gravimetri og løselighet. Prinsippet bak ligninestimering ved elektromagnetisk stråling var basert på lignins kjemiske egenskap der den absorberer lys ved spesifikke bølgelengder. Disse resultatene ble estimert basert på prinsippet om at lignin har en sterkere UV-absorbans enn karbohydrater. I 1962 brukte Bolker og Somerville kaliumkloridpellets for å estimere lignininnhold i tre18. Denne metoden har imidlertid ulemper ved estimering av lignininnhold fra urteaktige prøver på grunn av tilstedeværelsen av ikke-lignin fenolforbindelser og fravær av en passende utryddelseskoeffisient. I 1970 fant Fergus og Goring at guaiacyl og syringyl sammensatt absorpsjon maxima var på 280 nm og 270 nm, noe som korrigerte utryddelseskoeffisientproblemet til Bolker- og Somerville-metoden19. Senere ble infrarød spektroskopi, en svært følsom teknikk for karakterisering av fenolics, også brukt til ligninestimering med en liten mengde plantebiomasseprøver. Et eksempel på slik teknologi var diffus refleks Fourier transform spektrofotometri. Denne metoden mangler imidlertid en riktig standard som ligner på UV-metoden20. Senere ble lignininnholdet estimert av NIRS (nær infrarød spektroskopi) og NMR (kjernemagnetisk resonansspektroskopi). Selv om det er ulemper i disse metodene, endrer de ikke lignins kjemiske struktur, beholder renheten20.

Den gravimetriske Klason-metoden er en direkte og den mest pålitelige analytiske metoden for ligninestimering av treaktige stengler. Grunnlaget for gravimetrisk ligninestimering er hydrolyse/solubilisering av ikke-ligninforbindelser og innsamling av uoppløselig lignin for gravimetri21. I denne metoden fjernes karbohydrater ved hydrolyse av biomassen med konsentrert H2SO4 for å trekke ut ligninrester20,22. Lignininnholdet estimert ved denne metoden er kjent som syre uoppløselig lignin eller Klason lignin. Påføring av Klason-metoden avhenger av plantearter, vevstype og celleveggtype. Tilstedeværelsen av variable mengder ikke-ligninkomponenter som tanniner, polysakkarider og proteiner resulterer i proporsjonale forskjeller i estimering av syre uoppløselig / løselig lignininnhold. Derfor anbefales Klason-metoden bare for lignin-estimering av biomasse med høyt lignininnhold som treaktige stengler17,23. Løselighetsmetoder som acetylbromid (AcBr), syreoppløselig lignin og tioglykolsyre (TGA) er mest brukte metoder for estimering av lignininnholdet fra ulike plantebiomassekilder. Kim et al. etablerte to metoder for ligninutvinning ved solubilisering. Den første metoden trekker ut lignin som en uoppløselig rest ved å løse cellulose og hemicellulose, mens den andre metoden skiller lignin i den oppløselige fraksjonen, og etterlater cellulose og hemicellulose som den uoppløselige rester24.

Lignende metoder som brukes i lignin estimering basert på løselighet er tioglykolsyre (TGA) og acetylkymid (AcBr) metoder25. Både TGA og acetylbromidmetoder estimerer lignininnholdet ved å måle absorbansen av den solubiliserte lignin ved 280 nm; AcBr-metoden forringer imidlertid xylans under prosessen med lignin-solubilisering og viser en falsk økning i lignininnholdet26. Thioglycolate (TGA) metoden er den mer pålitelige metoden, da den avhenger av spesifikk binding med thioethergruppene av benzylalkoholgrupper av lignin med TGA. TGA bundet lignin er utfelt under sure forhold ved hjelp av HCl, og lignin innholdet er estimert ved hjelp av sin absorbans ved 280 nm27. TGA-metoden har ytterligere fordeler med mindre strukturelle modifikasjoner, en løselig form for lignin-estimering, mindre forstyrrelser fra ikke-ligninkomponenter og presis estimering av lignin på grunn av spesifikk binding med TGA.

Denne TGA-metoden er modifisert basert på typen plantebiomasseprøve som brukes til lignininnholdsestimering. Her modifiserte og tilpasset vi den raske TGA-metoden for risstrå27 til bomullsvev for å estimere lignininnholdet. Kort sagt ble de tørkede pulveriserte planteprøvene utsatt for proteinløselighetsbuffer og metanolutvinning for å fjerne proteiner og alkoholløselig brøkdel. De alkoholløselige rester ble behandlet med TGA og utfelt lignin under sure forhold. En lignin standardkurve ble generert ved hjelp av kommersiell bambus lignin og en regresjonslinje (y = mx + c) ble oppnådd. X-verdien bruker gjennomsnittlige absorbansverdier på lignin ved 280 nm, mens "m" og "c" ble angitt fra regresjonslinjen for å beregne ukjent ligninkonsentrasjon i biomasseprøver av bomullsanlegg. Denne metoden er delt inn i fem faser: 1) forberedelse av planteprøver; 2) vasking av prøvene med vann og metanol; 3) behandling av pellets med TGA og syre for å utfelle lignin; 4) nedbør av lignin; og 5) standard kurveforberedelse og lignininnholdsestimering av prøven. De to første fasene er primært fokusert på plantematerialepreparatet etterfulgt av vann, PSB (proteinløselighetsbuffer) og metanolutvinning for å oppnå alkoholløselig materiale. Deretter ble det behandlet med TGA (tioglykolsyre) og HCl for å danne et kompleks med lignin i tredje fase. På slutten ble HCl brukt til å utfelle lignin, som ble oppløst i natriumhydroksid for å måle absorbansen ved 280 nm28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av planteprøver

  1. Samle to måneder gamle bomullsplanter fra drivhuset (Figur 1A).
  2. Vend plantepottene forsiktig for å skille jord og røtter med intakte laterale røtter ved å løsne jorda rundt planten (Figur 1B).
  3. Vask de oppsamlede plantene grundig i skuffer fylt med vann for å fjerne alt smuss (for rotprøver) (Figur 1C).
  4. Bruk papirhåndklær til å tørke separert rot-, stamme- og bladvev, og merk dem (Figur 1D). Lufttørk i 2 dager ved romtemperatur for å forhindre soppkontaminering (Figur 1E).
  5. Overfør prøvevev til merkede beholdere/aluminiumsfolier og inkuber i en temperaturkontrollert inkubator ved 49 °C i 7 til 10 dager (figur 1F).
    MERK: Høyere temperaturer kan endre ligninstrukturen. Alternativt kan en frysetørker brukes til å tørke prøver i 1 til 2 dager uten å forårsake kjemiske endringer i plantebiomassen.
  6. Bruk et blad til å kutte inkubatoren tørket vev i 5 mm størrelse stykker eller alternativt bruke en biomasse grinder for å male plantevevet (Figur 1G, Figur 1H).
    MERK: Biomassekvernen/bladet må rengjøres etter at hver prøve er kuttet/malt.
  7. Overfør det kuttede vevet/biomassens jordede plantemateriale til slipehett og slip til fint pulver på 1 mm størrelse ved hjelp av en frysemølle eller kryogene slipemiddel med flytende N2.
  8. Grind prøver i tre sykluser med en hastighet på 10 CPS (hver syklusspenn på 2 min) i et ensartet pulver (Figur 1I, 1J, 1K).
    MERK: Eksperimentet kan settes på pause på dette punktet, og prøver kan lagres ved romtemperatur i lufttette beholdere for langvarig lagring.

2. Vaske prøver med vann, PSB og metanol

  1. Mål og registrer vekten av alle tomme 2 ml mikrofunksjonsrør som brukes til lignininnholdsestimering i laboratoriets bærbare PC.
  2. Overfør 20 mg av det malte prøvepulveret til det forhåndsveide røret. Vei røret med vev og vevspulver og registrer disse vektene i laboratoriets notatbok.
  3. Inkuber alle 2 ml mikrofugerør (med åpne lokk) med 20 mg vevspulver i en varmeblokk eller ovn ved 60 °C i 1 time.
  4. Etter inkubasjon, avkjøl prøver i 10 min ved romtemperatur (RT).
  5. Tilsett 1,8 ml vann til hvert mikrofugerør og bland ved virveling. Deretter sentrifugerer du ved 25 200 x g (15 000 o/min) i 10 minutter ved RT og kaster supernatanten (Figur 2).
  6. Tilsett 1,8 ml protein-solubiliseringsbuffer (PSB) (tabell 1) i hver beholdt pellets og bland ved virveling. Sentrifuger ved 25 200 x g (15 000 o/min) i 10 minutter ved RT og kast supernatanten.
  7. Gjenta trinn 2.6 på nytt for hvert utvalg.
  8. Tilsett 1,8 ml vann til hver pellets, bland ved virveling og sentrifuger ved 25 200 x g (15 000 o/min) i 10 minutter. Etter sentrifugering, lagre pellet og kast supernatanten.
  9. Til den beholdte pellets, tilsett 1,8 ml metanol og inkuber i en 60 °C varmeblokk i 20 minutter. Deretter sentrifugerer du ved 25 200 x g (15 000 o/min) i 10 minutter ved RT. Etter sentrifugering, kast supernatanten og behold pelletsen (Figur 2).
  10. Gjenta trinn 2.9 på nytt for hvert utvalg.
  11. Lufttørk pelletsen ved RT eller fortsett umiddelbart ved vakuumtørking. Støvsug tørr med vakuumtørker ved 30 °C i 2 til 3 timer eller til pelletsen er helt tørr.
    MERK: Eksperimentet kan settes på pause på dette tidspunktet ved å lufttørke over natten eller fortsette med vakuumtørking.
  12. Etter tørking, vei prøverør med tørket pellet og registrer vekten ved siden av den respektive tomme rørvekten i laboratoriets bærbare PC. Beregn pelletsvekten ved å trekke fra de to verdiene. Disse vektene vil bli brukt til lignin estimering på slutten av lignin utvinning prosessen.
  13. På dette punktet av lignin utvinning, inkludere kommersiell bambus lignin for generering av lignin standard kurve. Mål kommersiell bambus lignin i separate rør fra 0,5 mg til 5 mg i trinn på 0,5 mg (0,5 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 3 mg, 3,5 mg, 4 mg, 4,5 mg og 5,0 mg). Mål hver konsentrasjon tre ganger for tre tekniske repliker.
    MERK: Herfra ble standardene målt i trinnet ovenfor behandlet på samme måte som prøver som ble tørket.

3. Behandling av pellets med TGA og syre for å utfelle lignin

  1. Subjektbehandlede prøver fra ovenstående trinn, sammen med målte standarder, til TGA (tioglykolsyre) behandling.
  2. Tilsett 1 ml 3 N HCl (tabell 1) og 100 μL TGA i hver pellets.
  3. Virvel og inkuber i en 80 °C forvarmet varmeblokk i 3 timer i en avtrekkshette (Figur 2).
    MERK: Varmetrinnet ved 80 °C må overvåkes. Høytrykksoppbygging kan åpne lokkene og kan føre til kjemisk søl. Skruehettrør anbefales, men 2 ml rør kan løst kappes i løpet av dette trinnet som et alternativ for å forhindre slikt søl.
  4. Etter inkubasjon, kule rør på RT i 10-15 min og sentrifuge ved 25,200 x g (15,000 RPM) i 10 min på RT.
    MERK: Avfall generert fra syre og organiske løsemidler må separeres og oppbevares i glassbeholdere med ventilerte hetter. Bruk separate glassbeholdere for innsamling av TGA-syreavfall og syreavfall.
  5. Etter sentrifugering, kast supernatanten og behold pelletsen. Tilsett 1 ml vann, bland ved virveling og sentrifuger ved 25 200 x g (15 000 o/min) i 10 minutter ved RT.
  6. Etter sentrifugering, kast supernatanten og bland pelletsen i 1 N NaOH i 24 timer ved 37 °C shaker/termisk mikser ved lav hastighet (Figur 2).
    MERK: Denne inkubasjonstiden kan reduseres til 1 time7.
  7. Etter inkubasjon sentrifugerer du 2 ml mikrofunksjonsrør ved 25 200 x g (15 000 o/min) i 10 minutter ved RT. Behold supernatanten for følgende trinn.
    MERK: Prosedyren innebærer bruk av sterke syrer og andre kjemikalier som er etsende av natur. Derfor anbefales det å bruke riktig verneutstyr gjennom hele prosessen med lignin-estimering. TGA har en sterk ubehagelig lukt og er etsende i naturen. Derfor anbefales det å bare bruke i avtrekkshetten.

4. Nedbør av lignin

  1. Overfør supernatanten til et friskt mikrofunksjonsrør på 2 ml og tilsett 200 μL konsentrert HCl. Inkuber ved 4 °C i 4 timer eller over natten (figur 2).
    MERK: Ekstraksjonsprosessen kan settes på pause på dette tidspunktet ved å utvide kjøletrinnet til over natten.
  2. Sentrifuge ved 25 200 x g (15 000 o/min) i 10 min ved RT og oppløs pelletsen i 1 ml 1 N NaOH.
  3. Inkuber i shakeren på RT i 10 minutter for å suspendere pelletsen helt i NaOH.
  4. Til slutt måler du absorbansen av prøver ved 280 nm ved hjelp av et spektrofotometer og sammenligner med standard ligninkurve.
  5. Mål den ukjente konsentrasjonen av lignin ved hjelp av kalibreringskurvens regresjonslinjeverdier, og absorbanser av ekstraherte prøver ved 280 nm.

5. Standard kurveforberedelse og ligninestimering i prøven

  1. Behandle ligninstandarder på samme måte som eksperimentelle prøver fra TGA-behandling.
  2. Mål kommersielle bambus lignin standarder i 0,5 mg trinn fra 0,5 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 2,5 mg, 3,0 mg, 3,5 mg, 4,0 mg, 4,5 mg og 5 mg. Deretter oppløses prosessen med TGA, HCl, i 1 N NaOH etterfulgt av å måle absorbans ved 280 nm (Figur 3A).
  3. Bruk verdier for ligninkonsentrasjon og absorbansavlesninger til å generere et spredt plott av standard ligninkurve (figur 3B).
  4. Bruk regresjonslinjen, y = mx+c generert i det spredte plottet, for estimering av ukjent lignininnhold i forberedte prøver ved hjelp av "x" -verdier fra gjennomsnittlige absorbanser av ekstraherte prøver ved 280 nm- og "m" og "c" -verdier fra lignins standard regresjonslinje for kurver.
  5. Del lignininnholdet i den resulterende y-verdien ved totalvekt av vakuum/ lufttørket plantebiomasseprøve etter metanolutvinning i mg (ca. 15 mg) for å oppnå ligninkonsentrasjon per mg. Deretter multipliserer du denne verdien med 100 for å beregne ligninprosent per mg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

To forskjellige eksperimentelle bomullslinjer ble sammenlignet for forskjeller i deres lignininnhold i forskjellige vev. Det ekstraherte lignininnholdet i hver prøve ble målt til 280 nm og registrerte sine respektive absorbansverdier. De gjennomsnittlige absorbansverdiene for hver biologiske replikering ble sammenlignet med regresjonslinjen i lignin-standardkurven (Tabell 2, Figur 3C). Regresjonslinjen, y = mx + c, brukes til å beregne det ukjente lignininnholdet i de ekstraherte eksperimentelle linjene, prøve 1 og prøve 2. Resultatene av gjennomsnittlige OD-verdier ble erstattet i "x" mens "m" og "c" verdier ble plugget fra regresjonslinjen i lignin standardkurve for å oppnå ligninkonsentrasjon "y" i mg (Tabell 3, Figur 3B). I neste trinn, for å beregne per 1 mg lignininnhold, del "y" -verdien med vekten av prøven (15 mg) etter metanolutvinning. I det følgende trinnet, for å beregne per gram (= 1000 mg), ble y/15-verdien multiplisert med 1000. For å få % av lignin deler vi y/15-verdien med 1 000 og multipliserer med 100. Gjennomsnittet av lignin % for tre biologiske replikeringer (av hver linje, prøve 1 og prøve 2) ble sammenlignet mellom de to eksperimentelle linjene prøve 1 (11,7 %) og prøve 2 (10,3 %). Lignin-verdiene var konsistente blant biologiske repliker som antyder at TGA-metoden er en pålitelig metode og svært spesifikk for å måle lignininnholdet. Sammenligningsstudier ble også gjort mellom forskjellige vevstyper (rot, stamme og blader) av to eksperimentelle bomullslinjer, og begge linjene viste relativt lavere lignininnhold i blader (3,4%) sammenlignet med stilker (9,4 % til 9,9 %) og røtter (9,4 % til 9,2 %) (Tabell 4, figur 4).

Figure 1
Figur 1: Fremstilling av plantebiomasseprøve.  (A) Samlet bomull plantemateriale fra grønt hus. (B) Forsiktig vendt potter for å skille røtter. (C) Vasket grundig i vann for å fjerne alt smuss. (D) Separert rot-, stamme- og bladvev. (E) Lufttørket vev i 2 dager etter separering av vevet. (F) Lufttørket vev overføres til inkubatoren ved 49 °C i 10 dager. (G) Biomassekvern ble brukt til å male plantebiomasseprøver. (H) Jordplante biomasseprøver av rot, stamme og blad. (I) Jordingsprøver lastes inn i slipeglassene, plassert i frysemøllekammeret, jordet i frysefabrikken med en hastighet på 10 CPS i 3 sykluser. (J) Slipte hetteglass som viser finmalt vevspulver etter sliping i frysemøllen. (K) Finmalt vevspulver av rot, stamme og blad etter bruk av frysemølle til sliping. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kritiske trinn involvert i TGA mediert ligninutvinning. Strømningskart over kritiske trinn involvert i ligninutvinning fra plantebiomasse til lignininnholdsestimering ved hjelp av TGA-metode: 1. Fremstilling av planteprøver ved tilstrekkelig tørking og sliping i fint pulver ved hjelp av frysemølle; 2. 20 mg vevspulver ble utsatt for PSB, metanol og vannvask, tørket og ekstrahert alkohol uoppløselig materiale; 3. Ved hjelp av TGA og syre ble lignin utfelt; 4. Forberedelse av lignin standardkurve ved hjelp av kommersiell bambus lignin; 5. Estimering av lignininnhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Standard kurveforberedelse og ligninstimering i prøven. (A) Tabell som viser forskjellige konsentrasjoner av kommersiell bambus lignin som brukes til å generere lignin standardkurve fra absorbansavlesninger ved 280 nm. (B) Spredt plott generert med Excel-programmet ved hjelp av verdiene fra tabell A. (C) Stolpediagrammer som representerer det estimerte rotvevet lignin innhold i prøve 1 og prøve 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

løsning Nødvendige aksjer forberedelse
Protein-solubiliseringsbuffer (PSB) 1 M Tris HCl pH 8,8 og 0,5 M EDTA pH 8,0 For å forberede 100 ml arbeidsløsning av PSB med en endelig konsentrasjon på 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA og 10 % SDS, tilsett 5 ml 1 M Tris, 1 ml EDTA og 10 g SDS til 80 ml sterilt vann, bland, oppløs og utgjør det endelige volumet til 100 ml sterilt vann. Autoklav ved 121 °C, 15 psi trykk, i 30 min.
1 M Tris HCl For å forberede 100 ml 1 M Tris, tilsett 12,1 g Tris HCl (molekylvekt = 121,14 g) i 80 ml vann. Bland Tris HCl ved å røre på en magnetisk omrører, juster pH med NaOH til 8,8 og utgjør volumet til 100 ml med sterilt vann og autoklav ved 121 °C, 15 psi-trykk, i 30 minutter.
0,5 M EDTA (Etylendiamin tetraaceticacid) For å forberede 100 ml 0,5 M EDTA tilsett 18,6 g EDTA i 70 ml vann. Juster pH til 8,0 (EDTA oppløses helt ved pH 8.0) ved hjelp av natriumhydroksidpellets og utgjør volumet til 100 ml. Autoklaver oppløsningen ved 121 °C, 15 psi trykk, i 30 min.
3 N Saltsyre (HCL) For å forberede 100 ml 3 N HCl, tilsett 26 ml konsentrert HCL til 74 ml sterilt vann.
4 % natriumhydroksid (NaOH) Forbered 1 N natriumhydroksidoppløsning, tilsett 4 g natriumhydroksid i 90 ml sterilt vann, oppløs, utgjør volumet til 100 ml og autoklaver ved 121 °C, 15 psi-trykk, i 30 minutter.

Tabell 1: Utarbeidelse av løsninger som brukes i protokollen. Tabell som viser utarbeidelsen av ulike løsninger som brukes i protokollen.

Tabell 2: Lignins standardkurve fremstilt fra 0,5 mg til 3,5 mg industriell bambus lignin. Spredt graf med regresjonslinje som viser m- og c-verdier. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Lignin-mal som brukes til beregning av ukjent lignininnhold ved hjelp av absorbansavlesninger av prøver ved 280 nm (som x) og standard verdier for regresjon av kurve 'm' og 'c' fra standardkurven. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Lignininnhold fra forskjellige vev (rot, stamme og blader) av bomullsplante på postblomstringsstadiet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lignin spiller en betydelig rolle i plantevekst og utvikling og har nylig blitt grundig studert for biodrivstoff, bioenergi og bioproduktapplikasjoner. Lignin er rik på aromatiske forbindelser som er lagret i alle vaskulære plante sekundærcellevegger. Den har flere industrielle applikasjoner som trepanelprodukter, biodispergeringsmidler, flocculants, polyuretanskum og i harpikser av kretskort29,30,31. Det meste av lignin generert fra papir- og masseindustrien frigjøres som avfall eller brennes for varmeproduksjon. Således, hvis effektivt behandlet, lignin kan brukes som et alternativ til både fossilt brensel basert produkter32,33 og bioelektrisitet produksjon34. Derfor er presis estimering av lignininnhold og sammensetning avgjørende for industrielle applikasjoner, da sammensetningen varierer basert på plantearter samt planteorgantype. Hovedbegrensningen for lignin-estimering er forskjellen som oppstår fra metoden som er valgt for estimering av lignininnhold35. Estimeringsforskjellene mellom ulike metoder skyldes hovedsakelig forurensning med andre ikke-ligninkomponenter, variasjon i løselighet, tillegg av nye grupper til lignin, xylan nedbrytning / forurensning, innfødte strukturelle endringer og tap av noen ligninfraksjon under eliminering av andre komponenter. Videre er flertallet av ligninprotokoller opprinnelig utviklet basert på trekjemi27. Derfor er det et kritisk behov for å etablere ligninprotokoller for urteprøver ettersom flere avlinger / plantearter er rettet mot biodrivstoff og bioprodukter. TGA-metoden estimerer rent lignininnhold basert på spesifikk binding med TGA. Derfor gir lignin-estimatet av TGA lavere lignininnhold sammenlignet med Klason og acetylbromidmetoder35,36. Dette er på grunn av den spesifikke bindingen av lignin med TGA, samt tap av noe lignininnhold under lignin nedbør (uoppløselig del).

lignininnholdet som anslås ved hjelp av TGA-metoden, er reproduserbart og konsekvent. Resultatene oppnådd i denne studien var konsistente blant de biologiske replikeringene og viste en signifikant forskjell mellom to linjer, noe som tyder på påliteligheten til TGA-metoden for lignin-estimering. For datareroduserbarhet og presis estimering av lignininnhold er det viktig å følge trinnene og ta følgende forholdsregler. Inkludering av positive kontroller i forskjellige konsentrasjoner, alt fra 0,5 mg til 5 mg i tre repliker, og behandling av dem sammen med prøver fra TGA-trinnet vil unngå eksperimentelle feil og resulterer i presis estimering av lignininnholdet. Standardkurven må genereres for hvert sett med prøver, og regresjonslinjestatistikken R2 må falle i området 97 % til 99 %. Den nøyaktige vekten av det tomme røret og tørket metanol ekstrahert vev er avgjørende for nøyaktig lignininnholdsestimering. I tillegg vil ulike faktorer som bestemt stadium av planter, vekstforhold, genotyper, type vev og plantens alder påvirke lignininnholdet30,37,38. Derfor er det viktig å dyrke alle eksperimentelle linjer i samme miljø og høste samme type vev samtidig. Resultatene av den nåværende studien viste en forventet trend med lavere lignininnhold i bladene, høyere lignininnhold i stengler og røtter, og demonstrerte anvendelsen av denne metoden til ulike plantevev. Videre antydet mindre variasjon blant biologiske replikeringer at TGA kan estimere reproduserbart lignininnhold i alle plantevev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker Institutt for plante- og jordvitenskap og bomull inc. for deres delvise støtte til denne studien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioSpectrophotometer kinetic Eppendorf kinetic 6136000010 For measuring absorbance at 280 nm
Centrifuge Eppendorf 5424 For centrifuging  samples
Commercial bamboo lignin Aldrich 1002171289 Used in the preparation of the standard curve
Distilled water Fischer Scientific 16690382 Used in the protocol
Falcon tubes VWR 734-0448 Containers for solutions
Freezer mill Spex Sample Prep 68-701-15 For fine grinding of plant tissue samples
Heat block/ Thermal mixer Eppendorf 13527550 For temperature controlled steps during lignin extraction
Hotplate stirrer Walter WP1007-HS Used for preparation of solutions
Hydrochloric acid (HCL) Sigma 221677 Used in the protocol
Incubator Fisherbrand 150152633 For thorough drying of plant tissue samples
Measuring scale Mettler toledo 30243386 For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes
Methanol (100 %) Fischer Scientific 67-56-1 Used in the protocol
Microfuge tubes (2 mL) Microcentrifuge Z628034-500EA Containers for extraction of lignin
Plant biomass gerinder Hanchen Amazon Used for crushing dried samples
pH meter Fisher Scientific AE150 Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction
Temperature controlled incubator/oven Fisher Scientific 15-015-2633 Used in the protocol
Thioglycolic acid (TGA) Sigma Aldrich 68-11-1 Used in the protocol
Vacuum dryer Eppendorf 22820001 Used for drying samples
Vortex mixer Eppendorf 3340001 For proper mixing of samples

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freudenberg, K., Neish, A. C. Constitutionand Biosynthesis of Lignin. , Springer-Verlag Inc. New York, NY. 129 (1968).
  2. Chio, C., Sain, M., Qin, W. Lignin utilization: A review of lignin depolymerization from various aspects. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 107, 232-249 (2019).
  3. Sun, Z., Fridrich, B., de Santi, A., Elangovan, S., Barta, K. Bright Side of Lignin Depolymerization: Toward New Platform Chemicals. Chemical Reviews. 118, 614-678 (2018).
  4. Xu, F. Cereal Straw as a Resource for Sustainable Biomaterials and Biofuels. Sun, R. C. , Elsevier. 9-47 (2010).
  5. Liu, Q., Luo, L., Zheng, L. Lignins: Biosynthesis and Biological Functions in Plants. International Journal of Molecular Sciences. 19, 335 (2018).
  6. Ithal, N., et al. Developmental transcript profiling of cyst nematode feeding cells in soybean roots. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 510-525 (2007).
  7. Moura, J. C. M. S., et al. Abiotic and Biotic Stresses and Changes in the Lignin Content and Composition in Plants. Journal of Integrative Plant Biology. 52, 360-376 (2010).
  8. Vanholme, R., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin engineering. Current Opinion In Plant Biology. 11, 278-285 (2008).
  9. Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).
  10. Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
  11. Shrotri, A., Kobayashi, H., Fukuoka, A. Advances in Catalysis. Song, C. 60, Academic Press. 59-123 (2017).
  12. Brunow, G. Biorefineries-Industrial Processes and Products: Status Quo and Future Directions. 2, 151-163 (2008).
  13. Constant, S., et al. New insights into the structure and composition of technical lignins: a comparative characterisation study. Green Chemistry. , (2016).
  14. Shimada, N., Tsuyama, T., Kamei, I. Rapid Determination of Thioglycolic Acid Lignin for Various Biomass Samples. Mokuzai Gakkaishi. 65, 25-32 (2019).
  15. Li, X., Weng, J. K., Chapple, C. Improvement of biomass through lignin modification. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 54, 569-581 (2008).
  16. Ponnusamy, V. K., et al. A review on lignin structure, pretreatments, fermentation reactions and biorefinery potential. Bioresource Technology. 271, 462-472 (2019).
  17. Hatfield, R., Fukushima, R. S. Can Lignin Be Accurately Measured. Crop Science. 45, 832-839 (2005).
  18. Bolker, H., Somerville, N. Ultraviolet spectroscopicstudies of lignin in solid state. I. Isolated lignin preparations. Tappi Journal. 72, 826-829 (1962).
  19. Fergus, B. J., Goring, D. A. I. The distribution of lignin in birchwood as determined by ultraviolet microscopy. Holzforschung. 24, 118-124 (1970).
  20. Schultz, T. P., Templeton, M. C., McGinnis, G. D. Rapid determination of lignocellulose by diffuse reflectance Fourier transform infrared spectrometry. Analytical Chemistry. 57, 2867-2869 (1985).
  21. Dence, C. W. The Determination of Lignin. Methods in Lignin Chemistry. Lin, S. Y., Dence, C. W. , (1992).
  22. Adler, E. Lignin chemistry-past, present and future. Wood Science and Technology. 11, 169-218 (1977).
  23. Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. Comparison of different methods for lignin determination as a basis for calibration of near-infrared reflectance spectroscopy and implications of lignoproteins. Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).
  24. Pandey, M. P., Kim, C. S. Lignin Depolymerization and Conversion: A Review of Thermochemical Methods. Chemical Engineering & Technology. 34, 29-41 (2011).
  25. Moreira-Vilar, F. C., et al. The acetyl bromide method is faster, simpler and presents best recovery of lignin in different herbaceous tissues than Klason and thioglycolic acid methods. PLoS One. 9, 110000 (2014).
  26. Hatfield, R. D., Grabber, J., Ralph, J., Brei, K. Using the Acetyl Bromide Assay To Determine Lignin Concentrations in Herbaceous Plants: Some Cautionary Notes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47, 628-632 (1999).
  27. Suzuki, S., et al. High-throughput determination of thioglycolic acid lignin from rice. Plant Biotechnology. 26, 337-340 (2009).
  28. Nakatsubo, F., Tanahashi, M., Higuchi, T. Acidolysis of Bamboo Lignin II : Isolation and Identification of Acidolysis Products. Wood research. 53, 9-18 (1972).
  29. Aro, T., Fatehi, P. Production and Application of Lignosulfonates and Sulfonated Lignin. ChemSusChem. 10, 1861-1877 (2017).
  30. Frei, M. Lignin: Characterization of a Multifaceted Crop Component. The Scientific World Journal. 2013, 436517 (2013).
  31. Lora, J. H., Glasser, W. G. Recent Industrial Applications of Lignin: A Sustainable Alternative to Nonrenewable Materials. Journal of Polymers and the Environment. 10, 39-48 (2002).
  32. Wang, R., Zhou, B., Wang, Z. Study on the Preparation and Application of Lignin-Derived Polycarboxylic Acids. Journal of Chemistry. 2019, 5493745 (2019).
  33. Welker, C. M., et al. Engineering Plant Biomass Lignin Content and Composition for Biofuels and Bioproducts. Energies. 8, 7654-7676 (2015).
  34. Mendu, V., et al. Global bioenergy potential from high-lignin agricultural residue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4014-4019 (2012).
  35. Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. Comparison of Different Methods for Lignin Determination as a Basis for Calibration of Near-Infrared Reflectance Spectroscopy and Implications of Lignoproteins. Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).
  36. Moreira-Vilar, F. C., et al. The Acetyl Bromide Method Is Faster, Simpler and Presents Best Recovery of Lignin in Different Herbaceous Tissues than Klason and Thioglycolic Acid Methods. PLoS One. 9, 110000 (2014).
  37. Iwaasa, A. D., Beauchemin, K. A., Acharya, S. N., Buchanan-Smith, J. G. Effect of stage of maturity and growth cycle on shearing force and cell wall chemical constituents of alfalfa stems. Canadian Journal of Animal Science. 76, 321-328 (1996).
  38. Arai-Sanoh, Y., et al. Genotypic Variations in Non-Structural Carbohydrate and Cell-Wall Components of the Stem in Rice, Sorghum, and Sugar Vane. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. , 1105072478 (2011).

Tags

Biokjemi Utgave 173 Lignin monolignols Thioglykolsyre
Estimering av plantebiomasse Lignin-innhold ved bruk av thioglykolsyre (TGA)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu,… More

Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu, V. Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA). J. Vis. Exp. (173), e62055, doi:10.3791/62055 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter