Summary
该协议通过优化空气喷嘴的尺寸、鞘液压力、样品流压、电压、增益和触发阈值参数，为小细胞外囊泡提供了一种快速且尺寸特异性的分离方法。
Abstract
小细胞外囊泡（sEV）可以从所有细胞类型中释放出来，并携带蛋白质，DNA和RNA。信号分子是细胞生理和病理状态的指标。然而，sEV分离没有标准方法，这阻碍了下游生物标志物鉴定和药物干预研究。在本文中，我们提供了通过流通池分选仪分离和纯化50-200 nm sEV的详细方案。为此，选择了50 μm喷嘴和80 psi鞘液压力，以获得良好的分选率和稳定的侧流。标准尺寸的聚苯乙烯微球用于定位100、200和300 nm颗粒的群体。通过进一步优化电压、增益和前向散射（FSC）触发阈值，可以将sEV信号与背景噪声分离。这些优化提供了一个关键排序设置面板，使人们能够仅使用 FSC 与侧向散射 （SSC） 获得具有代表性的 sEV 群体。基于流式细胞术的分离方法不仅可以进行高通量分析，还可以基于生物标志物表达对sEV进行同步分类或蛋白质组分析，从而开辟了许多下游研究应用。
Introduction
细胞释放不同大小的细胞外囊泡（EV），产生信号分子和膜包涵体，这对细胞间通讯很重要1。不同大小的EV也起着不同的生物学作用，50-200nm sEV能够将RNA，DNA和蛋白质精确地分配到正确的细胞外位置。sEV还有助于确定其分泌机制，不仅涉及正常生理过程的调节，如免疫监视，干细胞维持，血液凝固和组织修复，还涉及肿瘤进展和转移等几种疾病的潜在病理学2，3。有效分离和分析sEV对于识别生物标志物和设计未来的药物干预措施至关重要。
随着sEV临床应用的不断研究，sEV的分离方法提出了更高的要求。由于sEV在大小、来源和含量上的异质性，以及它们在理化和生化性质上与其他EV的相似性，因此没有标准的方法进行sEV分离4，5。目前，超速离心、体积排阻色谱（SEC）、聚合物沉淀和免疫亲和捕获是最常见的sEV分离方法6。超速离心仍然是研究中sEV分离的金标准，尽管耗时，导致纯度低，尺寸分布为40-500 nm，并且在长期离心后对sEV造成重大机械损坏7，8，9。通常使用聚乙二醇（PEG）的聚合物沉淀在随后的功能分析中具有不可接受的纯度，同时细胞外蛋白质聚集体的沉淀和聚合物污染10，11。基于免疫亲和捕获的方法需要具有不同特异性的高成本抗体，并且存在处理量和产量低的问题12，13，14。粒径是评价分离sEV纯度的主要指标之一。尽管sEV纯度仍然是一个无法实现的目标，但SEC去除了相当数量的介质成分，并且通过SEC方法提取的sEV颗粒主要在50-200nm15的范围内。现有技术存在一些缺点，包括但不限于耗时、纯度低、产量低、重现性差、样品通量低以及sEV的潜在损害，这使得其与临床利用不兼容16。因此，适用于多种生物流体的快速、廉价且尺寸指定的sEV分离方法是多种研究和临床情况下的基本需求。
在流式细胞术中，以高通量、多参数的方式分析单个颗粒，并分选出亚群17.由于 EV 的异质性，单颗粒流式细胞术测量将是理想的，它已被用于按照细胞分析范式研究 EV，光散射和荧光标记用于识别生理学相关特征和蛋白质成分18，19，20。然而，传统的流式细胞术受到sEV体积小和表面生物标志物丰度低的挑战。无论使用前向散射（FSC）、侧向散射（SSC）还是荧光阈值触发参数19，都可以通过优化检测参数来区分背景噪声和sEV，从而提高流式细胞术的灵敏度。
使用本方案，使用荧光珠作为标准优化高分辨率流式细胞术分选设置。通过选择合适的喷嘴尺寸、护套流体压力、阈值触发参数和控制散射光强度的电压，我们能够从复杂的混合物中分离出 sEV 的特定子集。
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Protocol
1. 细胞培养
- 准备补充有10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）培养基。在75cm2 培养瓶中以1 x 106 个细胞/ mL的密度培养人胰腺癌细胞PANC-1。将培养物在37°C与5%CO2孵育。
- 当细胞密度在显微镜观察下达到75%-80%时，传代培养细胞。取出培养基，用 3-5 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS; 0.01 M， pH 7.2-7.4） 冲洗 2 次。
- 弃去溶液，加入1-2mL胰蛋白酶-EDTA溶液，让细胞分离，直到它们变圆并悬浮在显微镜下的培养基中。加入新鲜培养基，吸出并分散到装有 15 mL 培养基的 75 cm2 培养瓶中。使用1：2至1：4的亚种比例（推荐）。
注意：所有操作均在生物安全柜中进行，以避免细胞污染。
2. 培养基收集
- 将细胞在37°C下用5%CO2孵育48小时。在两个50mL离心管中收集细胞上清液（90mL），并在4°C下以300× g 离心10分钟。
- 将上清液转移到新的无菌管中，并在4°C下以2，000×g离心20分钟，10 000×g离心30分钟，12，000×g离心70分钟。
- 除去上清液，轻轻移液用 10 mL PBS 冲洗沉淀。再次在4°C下以12，000× g 离心70分钟，并将沉淀重悬于10mL的PBS缓冲液中以获得EV混合物。
- 执行纳米颗粒跟踪分析 （NTA） 以量化和定量 EV 混合物。根据仪器操作参考手册和参考文献21执行NTA分析。
3. 细胞分选
- 执行流通池分选仪的标准启动程序。按 启动 按钮打开机器。单击激光控制面板上的 激光功率 按钮。按下智能进样器子菜单中的 “更换储罐 ”按钮对流体进行加压。
注意：启动前，请确保废物箱是空的，并且护套罐已满。 - 使用超声波清洁的 50 μm 空气喷射喷嘴并将其安装到喷嘴组件上。在压力控制台上将鞘液的压力调节为 80 psi，将样品流量的压力调节为 80.3 psi。
- 按下“启动护套流”按钮以 启动护套流 。单击智能采样器子菜单中的 气泡按钮 以自动起泡 10 分钟，然后将其关闭。
注意：对于细胞分选，不同尺寸的空气喷嘴需要不同的鞘液压力来保持液体流动稳定性。在这种方法中，使用50μm的喷嘴，只有大于或等于80psi的鞘液压力才能产生稳定的侧流。样品流和鞘液之间的压差决定了分选的加载速度。在该方法的设定条件下（样品流与鞘液的压差为0.3-0.6 psi），液体流量相对稳定，对于压差小于0.3-0.6 psi，加载速度使分选效率从50%提高到80%。 - 对齐流并确定激光光斑。打开照明室灯以查看针孔上的溪流。调整上下、左右和前后千分尺，使流在针孔上居中并聚焦流。
- 选择 “激光和流拦截 ”选项卡。根据提示连续按下 绿色箭头 按钮，完成激光拦截和喷嘴对准校准过程。
- 访问精细的激光对准屏幕。选择 640-722/44 （H） 通道作为 X 轴参数，选择 405-448/59 （H） 通道作为 Y 轴参数。按下 触发参数选择器 并选择 488 nm 激光器的 SSC 参数 。打开所有激光快门。
注意： 选择的 X 轴和 Y 轴参数取决于系统的激光器配置。如果系统没有 640 nm 或 405 nm 激光器，则允许其他参数。为获得最佳效果，请选择针孔条上空间间距最大的激光器（不包括 355 nm 激光器）。 - 通过将一滴加入 1 mL 双蒸水中来稀释彩虹荧光颗粒，最终浓度为 1 x 106 颗珠/mL。打开样品室的门并装入一管制备的彩虹荧光颗粒。
- 按 “开始示例 ”按钮。调整上下千分尺以优化荧光强度，使每个信号尽可能强烈。按触摸屏控制面板上的 开始质量控制 （QC） 按钮以自动执行质量控制。
- 执行丢弃延迟。访问排序设置屏幕，然后选择放置延迟按钮。按 智能排序初始化 按钮。仪器自动调整液滴振荡的频率和振幅，以获得25±5的液滴延迟，并能够清晰地看到液滴的断裂点。按 维护 按钮。
- 选择管子作为排序输出类型。将 15 mL 管架放入分选室中。打开板电压并将板电压设置为大约 4000 V。
- 通过选择“ 流设置 ”按钮打开测试模式。调整充电相位滑块和偏转滑块，以确保流的图像与收集管对齐。选择 “复选标记 ”按钮。
- 在计算机上登录到 Summit 工作站。从文件主菜单创建新协议。通过选择 Summit 软件控制面板中的 直方 图选项卡来创建点图。
- 右键单击工作空间中新点图的轴，然后选择 FSC 作为 X 轴参数，选择 SSC 作为 Y 轴参数。以对数形式表示FSC和SSC。
- 选择“采集”选项卡并找到 “采集 参数”面板。启用启用参数子菜单中的所有信号。选择 FSC 作为触发参数，并将阈值设置为0.01。将FSC和SSC的电压和增益调整为250和0.6，以确保FSC与SSC图中的事件和群体是分开的。
注意：阈值设置等效于设置流式细胞术可以检测到的粒径。阈值越大，检测到的颗粒就越大，小颗粒将被阈值切断，无法检测到。在这种方法中，阈值设置为0.01，因此可以检测到所有大于电子噪声的粒子。
4. 分离 sEV
- 将荧光聚苯乙烯微球稀释至100nm，200nm和300nm的悬浮液。将 1 μL 微球加入 1 mL 双蒸水中。
- 依次加载微球悬浮液。在峰会软件的获取菜单下选择 “开始” ，记录20，000个事件。
注意：事件数是可选的。建议不少于5，000个事件以满足统计显著性。 - 右键单击 FSC 与 SSC 点图以创建矩形并拖动以调整电子噪声和 100 nm 微球群区域的大小和重新定位。右键单击区域以分别将其重命名为 R7 和 R4。重复上述步骤，依次用矩形框住200nm和300nm微球，并分别将其重命名为R5和R6。
- 最后，根据电子噪声和定义为R8的200 nm粒子的位置确定50-200 nm分选区域。
注意：50 nm 的检测下限位于流通池分选机的电子噪声正上方。因此，噪声和200 nm微球群之间的区域可以定义为50-200 nm之间。 - 在排序逻辑和统计信息面板中编辑排序决策。双击左侧 （L1） 流的空白字段。选择名为 R8 的区域以创建排序逻辑。选择 中止 纯度模式，并为 L1 流选择 1 滴的液滴包络。
- 从步骤 2.3 中加载 500 μL EV 混合物样品。按 Summit 中采集菜单下的 “ 开始”按钮获取数据，然后按排序菜单中的 “开始 ”将 50-200 nm sEV 收集到 15 mL 离心管中。
注意：无菌环境对于在任何过程中尽量减少污染是必要的。 - 通过透射电子显微镜（TEM）观察sEV的存在，并使用NTA验证sEV的粒径。进行蛋白质印迹（WB）分析以进一步确认CD9，CD63和CD81标志物的表达18。
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Representative Results
实验方案的流程图如图 1所示。该方法以标准尺寸聚苯乙烯微球作为粒径分布的参考标准品。在特定仪器参数条件下，使用对数形式可以清楚地将粒子信号与FSC与SSC图中的背景噪声区分开来。门控策略如图 2 所示。R4、R5 和 R6 分别指 100 nm、200 nm 和 300 nm 微球的位置。R7是50nm以下电子噪声的检测限，R8是50-200nm粒子的位置范围。
超速离心后，来自PANC-1电池的EVs混合物的粒径分布在40-400nm的宽范围内（图3）。为了分离和纯化50-200 nm sEV，根据标准微球的位置进行流式细胞术分选以获得特定尺寸的sEV（图4）。通过NTA验证了分离质量，发现分选后的sEV粒径范围在50-200 nm之间（ 如图5所示）。通过TEM进一步观察到sEV的存在， 如图6A中的红色箭头所示，并且通过WB分析确认分离的sEV含有CD9，CD63和CD81的标志物（图6B）。
图1.实验方案的流程图。 收集PANC-1细胞培养基并超速离心，得到EVs混合物。对50-200 nm sEV的分离纯化参数进行了优化，并通过NTA验证。 请点击此处查看此图的大图。
图2.标准尺寸聚苯乙烯微球的流式细胞术分析，以定位FSC与SSC图中的50-200 nm尺寸范围。 通过流式细胞仪加载并分析100 nm、200 nm和300 nm微球的稀释悬浮液，如FSC与SSC点图所示。R4、R5 和 R6 分别指 100 nm、200 nm 和 300 nm 粒子的位置。R7是电子噪声作为50 nm粒子的检测限，R8代表50-200nm粒子的位置范围。 请点击此处查看此图的大图。
图3.通过超速离心获得的EV粒度分布的NTA分析。 不同粒径的频率分布由数据表示为粒百分比与粒径的关系。 请点击此处查看此图的大图。
图4.收集的EV样品的流式细胞术分析。 FSC 与 SSC 点图显示了通过流式细胞仪加载和分析的收集的 EV 混合物样品。对R8区域内尺寸范围为50-200 nm的sEV进行分类。 请点击此处查看此图的大图。
图5.使用NTA分选后sEV的粒度分布验证。 代表性颗粒百分比与尺寸直方图显示了排序的sEV的尺寸分布。 请点击此处查看此图的大图。
图6.通过分选分离的sEV的表征。 （A）分类sEV的代表性TEM图像（用红色箭头表示）。比例尺 = 200 nm。（B）分选sEV中CD9、CD81和CD63标志物的蛋白质印迹分析。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该协议概述了使用流通池分选仪分离和纯化指定粒径为50-200 nm的sEV的优化方法，该方法已通过NTA验证。该方法解决了获得粒径均匀、纯度高的sEV的瓶颈问题，避免了包裹在大型EV中的无关生物分子的干扰22。流式细胞术可以进行快速、高通量分析，每秒可捕获 100，000 个颗粒，每秒做出 70，000 次分选决策17，大大减少了时间并反映了 sEV 颗粒的异质性。此外，这种基于流式细胞术的方案可以根据特定大小的EV亚群中的个体兴趣进行定制。替代门范围可用于识别和分离具有与上述设置相同的仪器参数的感兴趣群体，例如空气喷嘴、护套流体压力、样品流动压力和触发阈值参数。
这种方法的技术难点在于分离具有不同大小范围的种群，特别是与背景噪声区分开来。我们确定了关键排序设置的面板。首先，喷嘴的大小会影响分拣率。为了提高通过分选获得的sEV的浓度，该方法使用50μm喷嘴，并且需要80psi的鞘液压力来稳定侧流。随着鞘液压力的增加，下降频率增加，导致更高的事件发生率和更短的分拣时间23。然而，增加鞘液压力会衰减FSC和荧光信号的灵敏度，因为通过激光所需的时间减少，到达检测器的光子数量减少24。值得注意的是，在这种压力下很难保持侧流的稳定性，这需要喷嘴和管道的高清洁度。其次，强烈建议对喷嘴进行超声清洁和冲洗流式细胞术管道，以增加实验成功的可能性。最后，电压和增益对于群体分离至关重要，特别是对于小尺寸颗粒。在这里，250 V的电压和0.6的增益可以有效地分离50-200 nm处的sEV，FSC触发并以对数形式绘制。
该方法的一个警告是，在某些情况下，在分选过程中，sEV的浓度过高或sEV聚集体过高，因此难以实现单颗粒悬浮液。由于信号过放大，聚合的sEV将被丢弃。
总的来说，该方法具有流式细胞术高通量分析的优势，优化了喷嘴尺寸、鞘液压力、样品流动压力和触发阈值参数，从而成功分离了50-200 nm sEV。此外，该方法不仅可以分离特定尺寸的颗粒，还可以基于抗原表达对sEV进行同步分类或蛋白质组分析，开辟了许多下游研究应用。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
本工作得到了浙江中医药大学科研基金（2020ZG29）、浙江省基础公益研究项目（LGF19H150006，LTGY23B070001）、浙江省教育厅项目（Y202147028）和浙江大学实验科技项目（SJS201712，SYB202130）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
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