Summary
هنا ، نقدم خط أنابيب قياسي للحصول على أورام ATC الفئران بواسطة نماذج الفئران العفوية المعدلة وراثيا. علاوة على ذلك ، نقدم ديناميات الورم والمعلومات المرضية حول الآفات الأولية والمنتشرة. سيساعد هذا النموذج الباحثين على فهم تكوين الأورام وتسهيل اكتشاف الأدوية.
Abstract
سرطان الغدة الدرقية الكشمي (ATC) هو ورم خبيث نادر ولكنه مميت مع تشخيص كئيب. هناك حاجة ملحة لمزيد من البحث المتعمق حول التسرطن وتطوير ATC ، وكذلك الأساليب العلاجية ، حيث يتم استنفاد العلاجات القياسية بشكل أساسي في مرضى ATC. ومع ذلك ، فقد أعاق الانتشار المنخفض الدراسات السريرية الشاملة وجمع عينات الأنسجة ، لذلك لم يتم إحراز تقدم يذكر في إنشاء علاجات فعالة. استخدمنا الهندسة الوراثية لإنشاء نموذج فأر ATC قابل للتحفيز المشروط (mATC) في خلفية C57BL / 6. تم التنميط الجيني لنموذج الفئران ATC بواسطة TPO-cre / ERT2. برافCA / بالوزن ؛ Trp53ex2-10 / ex2-10 والناجم عن الحقن داخل الصفاق مع عقار تاموكسيفين. باستخدام نموذج الفئران ، قمنا بالتحقيق في ديناميكيات الورم (تراوح حجم الورم من 12.4 مم 2 إلى 32.5 مم2 بعد 4 أشهر من التحريض) ، والبقاء على قيد الحياة (كان متوسط فترة البقاء على قيد الحياة 130 يوما) ، وورم خبيث (حدثت نقائل الرئة في 91.6٪ من الفئران) منحنيات والسمات المرضية (تتميز ب Cd8 و Foxp3 و F4 / 80 و Cd206 و Ki67 و Caspase-3 تلطيخ كيميائي مناعي). أشارت النتائج إلى أن mATC العفوي يمتلك ديناميكيات ورم متشابهة للغاية وبيئة دقيقة مناعية لأورام ATC البشرية. في الختام ، مع التشابه الكبير في السمات الفيزيولوجية المرضية والأنماط الجينية الموحدة ، حل نموذج mATC النقص في أنسجة ATC السريرية وعدم تجانس العينة إلى حد ما. لذلك ، فإنه سيسهل الآلية والدراسات الانتقالية ل ATC ويوفر نهجا للتحقيق في إمكانات العلاج للعقاقير الجزيئية الصغيرة وعوامل العلاج المناعي ل ATC.
Introduction
سرطان الغدة الدرقية هو واحد من الأورام الخبيثة الغدد الصماءالأكثر شيوعا 1 ، والتي تنشأ من ظهارة الغدة الدرقية. في السنوات الأخيرة ، زاد معدل الإصابة بسرطان الغدة الدرقية بسرعة في جميع أنحاء العالم2. يمكن تقسيم سرطان الغدة الدرقية إلى أنواع متميزة وفقا لدرجة تمايز الخلايا السرطانية. على أساس السلوك السريري والأنسجة ، تنقسم سرطانات الغدة الدرقية إلى سرطانات متمايزة جيدا ، بما في ذلك سرطان الغدة الدرقية الحليمي (PTC) وسرطان الغدة الدرقية الجريبي (FTC) ، وسرطان ضعيف التمايز (PDTC) ، وسرطان الغدة الدرقية غير المتمايز أو الكشمي (ATC) 3. على عكس PTC ، وهو نوع شائع مع سلوك معتدل وتشخيص أفضل4 ، ATC هو ورم خبيث نادر وعدواني للغاية يمثل 2٪ إلى 3٪ من جميع أورام الغدة الدرقية5. على الرغم من أن ATC نادر الحدوث ، إلا أنه مسؤول عن حوالي 50٪ من الوفيات المرتبطة بسرطان الغدة الدرقية ، مع بقاء كئيب (6-8 أشهر)6,7. يتم تشخيص أكثر من 50٪ من حالات ATC على أنها ورم خبيث في الرئة8. بالإضافة إلى الطبيعة العدوانية ل ATC ، تم تطوير علاج فعال محدود في العيادة. لذلك ، فإن مرضى ATC لديهم تشخيص قاتم9،10،11. هذا يشير إلى أن هناك حاجة ماسة إلى مزيد من الدراسات المتعمقة حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطوير ATC والعلاج.
تكوين الورم في ATC هو عملية ديناميكية غير متمايزة. أعاقت صعوبة جمع عينات الورم البشري في كل مرحلة من مراحل الدراسات السريرية فهم آلية التطور من السرطانات المتمايزة جيدا إلى السرطانات غير المتمايزة. في المقابل ، فإن استخدام نماذج ATC الفئران (mATC) يفضل جمع عينات mATC في دورة تكوين الورم بأكملها. لذلك ، يمكننا أن نفهم بشكل أفضل آليات تكوين الورم من خلال تحليل العملية الديناميكية غير المتمايزة. بالإضافة إلى ذلك ، ساهم عدم تجانس عينات ATC السريرية أيضا في صعوبة فهم الآلية الجزيئية. ومع ذلك ، تشترك الفئران في نفس الخلفيات الجينية وتم الحفاظ عليها في بيئات معيشية مماثلة ، مما يضمن اتساق كل ورم. هذا يسهل استكشاف الدور العام لتطوير ATC12،13،14. بالإضافة إلى ذلك ، mATC هو نموذج ورم في الموقع يمكنه استعادة تأثير الموقع التشريحي والبيئة المكروية الخاصة بالأنسجة. على هذا النحو ، بالمقارنة مع الفئران التي تعاني من نقص المناعة شائعة الاستخدام ، فإن mATC هو نموذج فأر عفوي مع نظام مناعي سليم وبيئة دقيقة مناعية.
لذلك ، قمنا ببناء mATC المستحث بشكل مشروط مع سلالة C57BL / 6 ، وهو نموذج فأر قادر على إعادة إنتاج السمات المرضية لسرطان الغدة الدرقية غير المتمايز. بناء على هذا النموذج ، قدمنا لمحة موجزة عن الأساس الجزيئي وأفكار البناء والسمات المرضية وتطبيقات mATC. بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا وأبلغنا عن نمو الورم ، ووقت البقاء على قيد الحياة ، ورم خبيث ، والسمات المرضية ل mATC. نعتقد أن هذه ستكون نظرة عامة معلوماتية لمساعدة الباحثين الآخرين في استخدام هذا النموذج بشكل أسهل.
قمنا ببناء نموذج mATC الشرطي القابل للحث ، كما أبلغ عنه لأول مرة McFadden15 ؛ في البداية ، قمنا ببناء الفئران: TPO-cre / ERT2 و Braf flox / wt و Trp53flox / wt. على وجه التحديد ، تضمنت الفئران TPO-cre / ERT2 مروج بيروكسيديز الغدة الدرقية البشري (TPO) (مروج خاص بالغدة الدرقية) ، مما أدى إلى التعبير عن جين اندماج cre-ERT2 (وهو كري recombinase يندمج في مجال ربط ليجند مستقبلات هرمون الاستروجين البشري). عادة ما يقتصر Cre-ERT2 على السيتوبلازم ويدخل النواة فقط عند تعرضه لعقار تاموكسيفين ، مما يحفز cre على ممارسة نشاط الإنزيم المؤتلف. عندما يتم تهجين الفئران مع الفئران التي تحمل تسلسلات loxP المحاطة ، بعد تحريض عقار تاموكسيفين ، تقوم إعادة التركيب بوساطة الإنشاء بحذف التسلسلات المتخبطة في خلايا الغدة الدرقية لتحقيق الغرض من ضرب أو طرق جينات معينة.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن الفئران Braf flox / wt هي أليل غير قابل للضرب من Braf البشري بناء على نظام cre-loxP. يتم ترميز نسخة Brafflox / wt murine بواسطة exons الداخلية 1-14 و loxP المحاطة ب exons البشرية 15-18. بعد الاستئصال بوساطة الإنشاء للمناطق المتخبطة ، يتم استخدام exon 15 الطافر (المعدل باستبدال الأحماض الأمينية V600E المرتبط ب BrafV600E النشط بشكل أساسي في السرطانات البشرية) والإكسونات الداخلية 16-18 لتوليد النصوص. علاوة على ذلك ، فإن الفئران Trp53 flox / wt هي أليلات بالضربة القاضية من Trp53 البشري ولها مواقع loxP تحيط بالإكسونات 2-10 من Trp53. عند التقاطع مع الفئران مع cre recombinase ، فإن إعادة التركيب بوساطة cre تحذف التسلسل المتخبط لضرب Trp53. بعد ذلك ، تم تهجين الفئران TPO-cre / ERT2 و Braf flox / w و Trp53flox / wt للحصول على TB (TPO-cre/ ERT2; براففلوكس / بالوزن) الفئران و TBP (TPO-cre / ERT2; براففلوكس / بالوزن ؛ Trp53فلوكس / بالوزن) الفئران ، والتي يمكن استخدامها لتوليد PTC و ATC. بعد حوالي 8 أسابيع ، تم تحفيز الفئران عن طريق إعطاء 150 مجم / كجم من عقار تاموكسيفين داخل الصفاق (i.p) مذاب في زيت الذرة لإدارتين. يمكن مراقبة نمو الورم عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية عالية التردد (تم تسجيل النقطة الأولى للتصوير بالموجات فوق الصوتية في اليوم 0). تم إجراء التصوير بالموجات فوق الصوتية الأولية بعد 40 يوما من إدخال عقار تاموكسيفين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ الإجراءات الحيوانية الموصوفة هنا بموافقة لجنة أخلاقيات الحيوان في مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان ، تشنغدو ، سيتشوان ، الصين.
1. تحريض الفئران TBP
- تحديد النمط الجيني للفئران
- في حوالي 3 أسابيع ، افصل الفئران الإناث عن ذكور الفئران. في الوقت نفسه ، استخدم مشبك علامة الأذن لإصلاح علامة الأذن. ضع علامات الأذن في النصف السفلي وعلى الثلث الأوسط من الأذن ، مع التأكد من تجنب المنطقة ذات أعلى تركيز للشعيرات الدموية.
- كبح الفئران بلطف ولكن بشكل آمن. فهم بقوة في قاعدة ذيل الماوس. ضع الفئران على سطح يسمح لها بالإمساك بها.
- ضع اليد الحرة برفق ولكن بحزم على الكتفين ، ثم أمسك بسرعة قشرة الرقبة بين الإبهام والسبابة. امسك الذيل بالإصبع الصغير.
- مسحة الذيل مع الكحول. استخدم مقصا معقما لقص عينة الجلد <5 مم ووضعها في حاوية عينة نظيفة مع ملصق. ليس من الضروري إزالة فراء الفئران. ضغط الذيل مع الإسفنج المعقم لتحقيق الارقاء.
- بعد ذلك ، تحلل ذيل الفئران وتؤدي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لتحديد النمط الوراثي.
ملاحظة: بعد قطع ذيل فأر واحد ، يجب مسح سطح المقص بقطن الكحول لتجنب التلوث المتبادل للجينات بين ذيول الفئران. بعد وضعها في قفصها ، يجب مراقبة الفئران لمدة 5 دقائق للبحث عن أي علامات نزيف في موقع الجرح. راجع الجدول 1 للحصول على قائمة البادئات وإعدادات تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخدمة في هذه الدراسة.
- الفئران TBP التي يسببها عقار تاموكسيفين
- وزن 0.3 غرام من عقار تاموكسيفين وإذابته في 15 مل من زيت الذرة عن طريق الموجات فوق الصوتية (الطاقة = 20٪ ، المدة = 20 دقيقة ، درجة الحرارة = 4 درجة مئوية) ، بتركيز 20 مجم / مل. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
ملاحظة: تاموكسيفين حساس للضوء ويجب وضعه في وعاء بني. - في حوالي 8 أسابيع ، قم بوزن الفئران بموازين إلكترونية وأعطها حقنة i.p. من عقار تاموكسيفين بجرعة 150 مجم / كجم ، تدار مرتين بفاصل أسبوعي واحد.
- وزن 0.3 غرام من عقار تاموكسيفين وإذابته في 15 مل من زيت الذرة عن طريق الموجات فوق الصوتية (الطاقة = 20٪ ، المدة = 20 دقيقة ، درجة الحرارة = 4 درجة مئوية) ، بتركيز 20 مجم / مل. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
2. تشريح وتصوير أورام الغدة الدرقية للفأر والأورام النقيلية
- اعداد
- قم بإعداد أدوات التشريح: مقص وملقط معقم ، شفرة معقمة ، زجاجة رذاذ كحول 75٪ ، حافة مستقيمة 20 سم ، ملاقط رنية ، مناشف ورقية ، وقطن كحولي.
- محلول تثبيت أنسجة الفأر: تحضير محلول تثبيت الأنسجة بارافورمالدهايد بنسبة 4٪.
- نظف طبقا طوله 10 سم مملوءا بحوالي 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المعقم (PBS) لتخزين الأنسجة مؤقتا ، واغسل الدم على سطح الأنسجة.
- استخراج الغدة الدرقية
- القتل الرحيم للفئران بثاني أكسيد الكربون بمعدل تدفق 2.0 لتر / دقيقة لمدة 5 دقائق. إزالة الفئران من القفص وإجراء خلع عنق الرحم.
- ضع الماوس على لوح التشريح بحيث يكون الجانب البطني متجها لأعلى والرأس بعيدا عن المجرب ، وقم بتثبيت الأطراف على لوحة التشريح بإبر حقنة معقمة. لإزالة أنسجة الغدة الدرقية بشكل أكثر ملاءمة ، استخدم إبرة حقنة معقمة أخرى لإصلاح الرأس.
- تطهير الرقبة مع ثلاث جولات بالتناوب من فرك الكلورهيكسيدين أو البوفيدون اليود تليها 75 ٪ الكحول. ثم قم بعمل شق صغير فوق مركز الترقوة بمقص وملقط معقمة.
- استمر في شق خط الوسط حتى الفم. ابحث عن الغدة تحت الفك السفلي وقم بإزالتها لكشف الموقع التشريحي للغدة الدرقية ، والتي يتم وضعها بالقرب من غضروف الغدة الدرقية والقصبة الهوائية.
- ابحث عن الغدة الدرقية ، وقم بتشريح الغدة الدرقية بعناية من بقية منطقة الرقبة بمقص معقم ، ثم ضع الغدة الدرقية التي تمت إزالتها في طبق 10 سم مملوء ب 10 مل من برنامج تلفزيوني معقم.
ملاحظة: أثناء إزالة الغدة الدرقية ، كن لطيفا وبطيئا وتجنب قطع الأوعية الدموية في الرقبة. إذا تم قطع أوعية الرقبة ، ملء الرقبة على الفور بالدم ، ويجب إزالة الدم على الفور باستخدام إسفنج الكحول لفضح الموقع التشريحي للغدة الدرقية. قبل إزالة أنسجة الغدة الدرقية ، لاحظ بعناية خصائص الفص الأيسر والأيمن للغدة الدرقية (الحجم والشكل وما إلى ذلك) لتجنب عدم القدرة على التمييز بين الفصين الأيسر والأيمن للغدة الدرقية بعد الإزالة. - في برنامج تلفزيوني معقم ، قم بإزالة الدم من سطح أنسجة الغدة الدرقية بمقص معقم وقطع القصبة الهوائية بعناية. ثم ، ضع أنسجة الغدة الدرقية على قطعة قماش معقمة ، وقم بقياس حجم الفص الأيسر والأيمن من الغدة الدرقية باستخدام الفرجار الورني.
- قسم الفصوص اليسرى واليمنى من الغدة الدرقية إلى قسمين بشفرة معقمة. ضع جزءا واحدا في 2 مل من محلول بارافورمالدهايد 4٪ للتثبيت ، وضع الجزء الآخر في النيتروجين السائل لحفظه.
- استخراج الرئة والكبد
- تطهير البطن مع ثلاث جولات بالتناوب من فرك الكلورهيكسيدين أو البوفيدون اليود والكحول 75 ٪. ثم ، قرصة فوق قضيب الفأر مباشرة وجعل شق صغير ، وقطع على طول خط الوسط من البطن إلى عظم تحت الترقوة ، وكشف تجويف البطن.
- ابحث عن الكبد في الجزء العلوي من البطن وقم بإزالته بعناية. ضع الكبد في برنامج تلفزيوني معقم.
- قطع بعناية الحجاب الحاجز على طول الأضلاع لفضح التجويف الصدري. بعد ذلك ، أمسك بالقص واسحب لأعلى لتوسيع المساحة أكثر. العثور على الرئة وإزالتها. ضع الرئة التي تمت إزالتها في برنامج تلفزيوني معقم.
- لاحظ بشكل صارخ ما إذا كانت هناك نقائل في الرئة والكبد. احسب عدد النقائل وخذ سجلا رقميا. بعد ذلك ، استخدم شفرة معقمة لتقسيم أنسجة الرئة والكبد إلى قسمين. ضع جزءا واحدا في 3 مل من محلول بارافورمالدهيد 4٪ للتثبيت وجزء آخر في النيتروجين السائل للحفظ.
- جفاف الأنسجة
- ضع المناديل في صندوق الجفاف. ضع صندوق الجفاف في السلة عند تجفيف الكحول المتدرج على النحو التالي: 70٪ كحول لمدة 1 ساعة ؛ 80 ٪ الكحول لمدة 1 ساعة ؛ 95٪ كحول لمدة 30 دقيقة ؛ 95٪ كحول لمدة 30 دقيقة ؛ الإيثانول اللامائي الأول لمدة 30 دقيقة ؛ الإيثانول اللامائي II لمدة 30 دقيقة ؛ زيلين الأول لمدة 20 دقيقة ؛ زيلين II لمدة 20 دقيقة ؛ شمع البارافين الأول لمدة 30 دقيقة ؛ شمع البارافين الثاني لمدة 1 ساعة ؛ شمع البارافين الثالث لمدة 30 دقيقة.
- قم بتضمين المناديل المشبعة بالشمع في آلة التضمين.
- ضع الشمع المذاب في إطار التضمين أولا. قبل أن يصلب الشمع ، قم بإزالة المنديل من صندوق التجفيف وضعه في إطار التضمين ، ثم قم بإرفاق الملصق.
- اترك الشمع يبرد عند -20 درجة مئوية على طاولة التجميد. بعد أن يصلب الشمع ، قم بإزالة كتلة الشمع من إطار التضمين وقم بقصها.
- ضع كتلة الشمع المشذبة على قطاعة البارافين ، بسمك 5 ميكرومتر وحجم 2 سم × 2 سم. بعد التقسيم ، اترك الأقسام تطفو على مفرشة بالماء الدافئ عند 45 درجة مئوية لتسطيح الأنسجة. التقط المنديل بشريحة ، واخبز الشرائح في فرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- بعد أن يجف الماء ويذوب الشمع ، قم بإزالة الشريحة بالأنسجة واستخدمها في تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (HE) والكيمياء المناعية (IHC)16. تأكد من أن الأقسام ملتصقة بالشرائح للتلطيخ.
3. تلطيخ الورم الرئيسي والرئة
- إزالة الشمع
- ضع الشرائح مع الأقسام في الزيلين لمدة 10 دقائق.
- انتقل إلى الكحول اللامائي (100٪) (زجاجتان) لمدة 3 دقائق لكل منهما.
- انقله إلى 95٪ كحول (زجاجتان) لمدة 3 دقائق لكل منهما.
- انتقل إلى 80٪ كحول لمدة 3 دقائق.
- انتقل إلى 50٪ كحول لمدة 3 دقائق.
- انتقل إلى ماء الصنبور ، واغسل الكحول لمدة 1 دقيقة.
- تلطيخ
- انقل الشرائح إلى الهيماتوكسيلين لمدة 8 دقائق.
- نقل الشرائح في الماء لمدة 1 دقيقة لغسل الهيماتوكسيلين. يتغير النسيج من الأزرق إلى الأحمر.
- انقل الشرائح إلى كحول حمض الهيدروكلوريك بنسبة 1٪ لمدة 30 ثانية تقريبا.
- حرك الشرائح في الماء ، واغسلها لمدة 5 دقائق.
- انقل الشرائح إلى eosin لمدة 90 ثانية ، ثم اغسلها بالماء لمدة 5 دقائق.
- انقل الشرائح إلى 50٪ كحول ، 80٪ كحول ، 95٪ كحول (زجاجتان) ، وكحول لا مائي (100٪) (زجاجتان) ، لمدة 1 دقيقة لكل منهما.
- انقل الشرائح إلى الزيلين لمدة 5 دقائق.
- بعد أن تجف الشرائح ، أغلقها براتنج محايد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لقد حثثنا mATC على التحقيق في نمو الورم ، ووقت بقاء الفئران ، والخصائص المرضية. بعد الحث ، تم التضحية بالفئران على الفور ، وتم جمع العينات (الغدة الدرقية والرئة والكبد) بمجرد العثور على أحد الحالات التالية: 1) الضائقة التنفسية الناجمة عن ضغط الورم. 2) انخفاض الشهية والنطق غير الطبيعي. 3) الخمول بشكل غير عادي. و 4) فقدان وزن الجسم لأكثر من 20٪. أثناء عملية أخذ العينات ، وجدنا أن جميع الفئران (12/12) نجحت في تشكيل الأورام بعد التحريض. سجلنا وقت بقاء الفأر ، وميزات / حجم الورم ، والآفات المنتشرة.
بشكل صارخ ، لاحظنا ما يلي: 1) كانت الأورام طرية ، وكان حجم الأورام على الجانبين الأيسر والأيمن غير متسق. 2) كان لدى معظم الفئران (11/12) نقائل رئوية ، لكن لم يكن لدى أي منها نقائل كبدية. على وجه التحديد ، تم رصد حجم الورم بواسطة الموجات فوق الصوتية عالية التردد الحيوانية وأنظمة التصوير الضوئي الصوتي (Vevo®3100) طوال العملية برمتها17. بناء على بيانات الموجات فوق الصوتية ، تم رسم منحنى نمو الورم (الشكل 1 أ) لمراقبة التغيير الديناميكي لحجم الورم. علاوة على ذلك ، نمت الأورام ببطء في المرحلة المبكرة (متوسط حجم الورم يتراوح من 9.47 مم 2 إلى 11.75 مم 2 من اليوم 0 إلى اليوم 60) ، وأصبحت أسرع بشكل كبير في المرحلة المتأخرة (متوسط حجم الورم يتراوح من 11.75 مم 2 إلى 23.95 مم 2 (من اليوم 60 إلى اليوم 100). تم التضحية بمعظم الفئران في المرحلة المتأخرة. باختصار ، يجب مراقبة mATC مع فترة كمون معينة للورم عن كثب بعد 60 يوما لمنع الوفاة المرتبطة بالاختناق.
من ناحية أخرى ، تم تسجيل وقت بقاء الفئران ، وتم رسم منحنى البقاء على قيد الحياة (الشكل 1 ب). كان متوسط بقاء mATC 130 يوما ، يتراوح بين 56-166 يوما. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على ورم خبيث في الرئة في معظم mATC (حوالي 92 ٪) (الشكل 1C). لاحظنا أن فأرا واحدا فقط في هذه المجموعة لم يظهر نقائل رئوية في الفحص الإجمالي ، وكان لدى ستة فئران أكثر من آفة نقيلي رئوية واحدة. لم يتم العثور على ورم خبيث في الكبد. باختصار ، كانت هذه النتائج متسقة مع السلوك البيولوجي ل ATC ، والتي هي عرضة لورم خبيث في الرئة في العيادات.
علاوة على ذلك ، لمراقبة العملية الديناميكية ل mATC بشكل أفضل ، ضحينا بالفئران في نقطتين زمنيتين (1 شهر و 2 أشهر بعد الحث). أجرينا تلطيخ اعتلال الدماغ الكبدي على الأورام الأولية وأنسجة الرئة النقيلي في mATC (الشكل 1D). في 1 شهر الأنسجة المحرضة ، لاحظنا ميزات صلبة غير مكتملة والتعايش بين الهياكل المسامية والخلايا الخبيثة. اختفت الهياكل المسامية الغدة الدرقية ، وتصلب الورم تماما بعد تحريض 2 شهر. كشف تلطيخ الورم الرئيسي أن الخلايا السرطانية كانت متنوعة شكليا ، مع خلايا عملاقة متعددة الأشكال (يشار إليها بسهم أحمر) وخلايا على شكل مغزل (يشار إليها بسهم أصفر). كما أظهر تنوعا كبيرا في الحجم النووي ، والعديد من الخلايا تحتوي على نوى متعددة. شوهدت بؤر نقيلي واضحة (يشار إليها بدائرة) في الرئة. أظهر تلطيخ أنسجة الرئة النقيلي أن أنسجة الرئة الطبيعية كانت عبارة عن بنية شبكية ذات هياكل سنخية واضحة ومساحات جوية. ومع ذلك ، أظهرت النقائل الرئوية فقدان البنية الشبكية الطبيعية ، وسماكة تجويف الهواء ، وحمة الرئة.
وفي الوقت نفسه ، تم إجراء تلطيخ IHC لمزيد من التوصيف (Cd8 و Foxp3 و F4 / 80 و Cd206 و Ki67 و Caspase-3) أورام mATC لتحديد تكاثر الخلايا وموت الخلايا المبرمج ، والتحقيق في تسلل الخلايا الليمفاوية والخلايا التائية العادية (Treg) والخلايا النخاعية (الشكل 2A-D). كان التلوين المضاد ل Ki67 إيجابيا للغاية ، حيث تراوح من 86.9٪ إلى 95.07٪ ، مما يدل على درجة عالية من تكاثر الخلايا. تم استخدام الجسم المضاد للكاسباز -3 المضاد لاختبار معدل موت الخلايا المبرمج ، يتراوح من 5.2٪ إلى 51.9٪. على وجه التحديد ، قدم mATC تسلل واضح للخلايا التائية CD8 + ، تراوحت نسبته من 0.47٪ إلى 10.55٪ (يعني: 5.93٪). يشير هذا إلى أن mATC لم يكن ورما في الصحراء المناعية ، وهو ما كان متسقا مع عينات ATC. إلى جانب ذلك ، حدد تلطيخ Foxp3 خلايا Treg ، والتي تراوحت من 0.45٪ إلى 25.8٪. بالإضافة إلى الخلايا الليمفاوية ، تم استخدام F4 / 80 و Cd206 لتحديد الضامة والبلاعم M2 ، على التوالي. وجدنا أن الخلايا النخاعية تسللت على نطاق واسع إلى الأورام (معدل الخلايا الإيجابية F4 / 80 من 86.6٪ إلى 94.6٪. معدل الخلايا الإيجابية Cd206 من 40.4٪ إلى 67.7٪) ، وهو ما كان متسقا مع الأدبيات السابقة16. باختصار ، وجدنا خلايا سرطانية تكاثرية عالية ، وتسلل الخلايا الليمفاوية ، وتسلل واسع النطاق للخلايا النخاعية في mATC ، وهو ما كان متسقا مع العينات السريرية.
في الختام ، أظهرت عينات mATC تجانسا في ديناميكيات الورم ، ورم خبيث ، والسمات المرضية ، بما يتفق مع العينات السريرية. بالنظر إلى معدل تكوين الورم ، كان mATC نموذجا موثوقا به للفئران.
الشكل 1: ديناميات الورم والخصائص المرضية. (أ) منحنى نمو الورم للفئران (ن = 5). يمثل كل سطر فأرا: تتراوح المرحلة المبكرة من اليوم 0 إلى اليوم 60 ، وتتراوح المرحلة المتأخرة من اليوم 60 إلى اليوم 100. (ب) منحنيات بقاء الفئران (ن = 12). كان متوسط بقاء mATC 130 يوما ، يتراوح من 56 يوما إلى 166 يوما. (ج) منحنيات ورم خبيث في الرئة للفئران (ن = 12). صور تشريح تمثيلية للورم الخبيث في الغدة الدرقية والرئة. يشير السهم الأحمر إلى ورم الغدة الدرقية ، وتشير الدائرة البيضاء إلى ورم خبيث في الرئة. (د) تلطيخ الورم الرئيسي (1 شهر و 2 أشهر بعد التحريض) وورم خبيث في الرئة. يشير السهم الأحمر إلى الخلية العملاقة متعددة الأشكال ، ويشير السهم الأصفر إلى الخلية على شكل مغزل ، وتشير المنطقة المحاطة بدائرة إلى ورم خبيث في الرئة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: وصف موجز لتسلل الخلايا المناعية في mATC. (أ) التلوين المناعي الكيميائي لأورام الفئران الأولية ATC بالأجسام المضادة (Cd8 ، Foxp3). يشير السهم الأحمر إلى خلية موجبة CD8 ، ويشير السهم الأصفر إلى خلية موجبة Foxp3. (ب) التلوين المناعي الكيميائي لأورام الفئران الأولية ATC بالأجسام المضادة (Ki67 ، Caspase-3). (ج) التلوين المناعي الكيميائي لأورام الفئران الأولية ATC بالأجسام المضادة (F4/80 ، Cd206). (د) التحديد الكمي للمدينة العالمية للخدمات الإنسانية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: قائمة البادئات وإعدادات تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول تشريح ورم الغدة الدرقية
أثناء التشريح ، يجب فهم الموقع التشريحي للغدة الدرقية بشكل صحيح. الغدة الدرقية هي غدة على شكل فراشة تقع على الجانب الظهري من الغدة تحت الفك السفلي بالقرب من غضروف الغدة الدرقية والقصبة الهوائية. أثناء العملية ، تم تجنب قطع شرايين الدم على جانبي الرقبة بعناية.
تعديل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من سلالة mATC
ATC هو ورم خبيث نادر وعدواني للغاية. الخصائص السريرية لمرضى mATC و ATC لها بعض أوجه التشابه. على وجه التحديد ، السبب الرئيسي للوفاة في mATC هو الاختناق ، وهو ما يتوافق مع مرضى ATC. لذلك ، أثناء التجربة ، يجب ملاحظة ما يلي: 1) فهم الفئران بلطف والانتباه إلى تنفسها أثناء العملية ؛ 2) مراقبة عن كثب خلال المرحلة المتأخرة لمنع الموت المفاجئ والفشل في الحصول على عينات في الوقت المناسب ؛ 3) تتأثر أنسجة الغدة الدرقية والرئة بسهولة بالدم الموجود على سطح الأنسجة للمراقبة والتصوير الفوتوغرافي ، لذلك يمكن تقليل حجم دم الفئران عن طريق استئصال مقلة العين.
قيود استخدام mATC
إن حدوث وتطور ATC البشري معقد ومتغير ، لكن الخلفية الجينية ل mATC بسيطة نسبيا ، والتي لا يمكنها محاكاة سوى جزء من ATC البشري. على سبيل المثال ، تحتوي بعض أنسجة ATC على طفرات TERT و BRAF ، ورقم النسخة NOTCH2NL المتغير 18 ، بدلا من طفرات P53 ، والتي قد يكون لها آليات تكوين أورام مختلفة وخصائص مرضية سريرية7،19،20. بالإضافة إلى ذلك ، عادة ما يكون لدى ATC دورة زمنية طويلة قبل التشخيص ، ولكن mATC يحصل على تشخيص بعد تحريض 2 أشهر. لذلك ، هناك فروق متأصلة بين mATC وسرطان الغدة الدرقية البشري ، ولا يمكن للنماذج الحيوانية تقليد جميع خصائص سرطان الغدة الدرقية البشري بشكل كامل ، ولا يمكن تقييم العديد من العلاجات التي تقتصر على البشر على mATC. علاوة على ذلك ، على الرغم من أنه يمكن استخدام mATC للبحث في الآثار العلاجية لمختلف الأدوية الجزيئية الصغيرة ، يجب تصميم العديد من الأدوية البيولوجية (على سبيل المثال ، الأجسام المضادة أو الأدوية ذات الصلة بالأجسام المضادة) للفئران على وجه التحديد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العملية الكاملة لبناء الفئران بالضربة القاضية الشرطية ثم الحصول على النمط الوراثي المستهدف للفئران عن طريق التهجين تستغرق وقتا طويلا وتتطلب شروطا معينة لتربية الفئران وتكلف21,22.
أهمية استخدام mATC في أبحاث سرطان الغدة الدرقية
إن عدم تجانس السكان البشريين وندرة ATC البشري يعيقان استكشاف الآليات المحتملة والخيارات العلاجية ل ATC. كنموذج فأر موثوق به ، يسهل mATC جمع أنسجة ATC ويثري تجمع عينات أنسجة ATC. يمكن أيضا استخدام mATC لدراسة تأثيرات وظائف جينية محددة على ATC ، ودراسة الآليات الخلوية والجزيئية لتطوير ATC ، وفهم آليات تطور ورم الغدة الدرقية ومقاومة الأدوية ، وفي النهاية تحسين تشخيص مرضى ATC16.
التطبيقات المستقبلية ل mATC
يمكن استخدام mATC للبحث في جوانب مختلفة من العلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي والعلاج الجيني والعلاج المناعي والعلاج الموجه. يمكن أيضا استخدام mATC لاستكشاف الآثار العلاجية والآثار الضارة للأنظمة ، مثل التوليفات بين الأدوية المختلفة أو مع العلاج الإشعاعي. استخدمنا بعد ذلك mATC للتحقيق في الآثار العلاجية للعلاج الإشعاعي جنبا إلى جنب مع العلاج المناعي والأدوية المثبطة للجزيئات الصغيرة على ATC. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام mATC للتحقيق في آثار طرق أو طرق التسليم المختلفة على التأثيرات المضادة للأورام للأدوية لتطوير أنظمة توصيل الأدوية مع تعزيز النشاط المضاد للأورام. في التطبيقات السريرية المستقبلية ، نأمل في تقليل معدل التكرار ومعدل الوفيات لمرضى سرطان الغدة الدرقية وبالتالي تحسين معدل بقاء المرضى.
نتوقع أن يتم تطوير المزيد من نماذج الفئران ATC في المستقبل ، بالإضافة إلى المزيد من التحليلات المتعمقة ل ATC في خلفيات جينية مختلفة ، مثل PTEN و P13K23. ستكشف هذه بشكل أكثر شمولا عن الآلية الجزيئية لتكوين ورم ATC وتطوره ، وتتنبأ بنتائج علاج ATC ، ويمكن أن توفر للمرضى أهدافا علاجية محتملة24،25،26،27،28. نأمل أنه من خلال المزيد من الاستكشاف التجريبي ، يمكننا تحسين طريقة النمذجة لنموذج الماوس وتقصير وقت النمذجة لتقديم المزيد من المساهمات في البحث الأساسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني لتطوير البحوث الرئيسية في الصين (2021YFA1301203) ؛ المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82103031 ، 82103918 ، 81973408 ، 82272933) ؛ مشروع حضانة البحوث السريرية ، مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان (22HXFH019) ؛ مشروع التعاون الدولي لمكتب العلوم والتكنولوجيا لبلدية تشنغدو (2020-GH02-00017-HZ) ؛ مؤسسة العلوم الطبيعية في سيتشوان ، 2022NSFSC1314 ؛ "مشروع 1.3.5 لتخصصات التميز ، مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان" (ZYJC18035 ، ZYJC18025 ، ZYYC20003 ، ZYJC18003) ؛ وبرنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا (2023YFS0098).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
| 50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
| CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
| Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
| Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
| Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
| Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Parenti, R., Salvatorelli, L., Magro, G. Anaplastic thyroid carcinoma: Current treatments and potential new therapeutic options with emphasis on TfR1/CD71. International Journal of Endocrinology. 2014, 685396 (2014).
- Baldini, E., et al. In vitro and in vivo effects of the urokinase plasminogen activator inhibitor WX-340 on anaplastic thyroid cancer cell lines. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 3724 (2022).
- Haugen, B. R. American Thyroid Association Management guidelines for adult patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer: what is new and what has changed. Cancer. 123 (3), 372-381 (2015).
- O'Neill, J. P., Shaha, A. R.
- Simoes-Pereira, J., Capitao, R., Limbert, E., Leite, V. Anaplastic thyroid cancer: Clinical picture of the last two decades at a single oncology referral centre and novel therapeutic options. Cancers. 11 (8), 1188 (2019).
- Fagin, J. A., Wells, S. A. Biologic and clinical perspectives on thyroid cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (11), 1054-1067 (2016).
- Neff, R. L., Farrar, W. B., Kloos, R. T., Burman, K. D.
- Lareau, C. A., et al. Droplet-based combinatorial indexing for massive-scale single-cell chromatin accessibility. Nature Biotechnology. 37 (8), 916-924 (2019).
- Guo, H., et al. Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing. Genome Research. 23 (12), 2126-2135 (2013).
- Mooijman, D., Dey, S. S., Boisset, J. -C., Crosetto, N., van Oudenaarden, A. Single-cell 5hmC sequencing reveals chromosome-wide cell-to-cell variability and enables lineage reconstruction. Nature Biotechnology. 34 (8), 852-856 (2016).
- Smallridge, R. C., Marlow, L. A., Copland, J. A. Anaplastic thyroid cancer: molecular pathogenesis and emerging therapies. Endocrine-Related Cancer. 16 (1), 17-44 (2009).
- Charles, R. -P. Overview of genetically engineered mouse models of papillary and anaplastic thyroid cancers: enabling translational biology for patient care improvement. Current Protocols in Pharmacology. 69, 1-14 (2015).
- Tuttle, R. M., Haugen, B., Perrier, N. D. Updated American joint committee on cancer/tumor-nodemetastasis staging system for differentiated and anaplastic thyroid cancer (8th Edition): What changed and why. Thyroid. 27 (6), 751-756 (2017).
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Protocols of the National Academy of Sciences. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Gunda, V., et al. Combinations of BRAF inhibitor and anti-PD-1/PD-L1 antibody improve survival and tumour immunity in an immunocompetent model of orthotopic murine anaplastic thyroid cancer. British Journal of Cancer. 119 (10), 1223-1232 (2018).
- He, Y., et al. High-resolution ultrasonography for the analysis of orthotopic ATC tumors in a genetically engineered mouse model. Journal of Visualized Experiments. (188), e64615 (2022).
- Zhang, L., et al. Novel recurrent altered genes in Chinese patients with anaplastic thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (4), 988-998 (2021).
- Luo, H., et al. Pan-cancer single-cell analysis reveals the heterogeneity and plasticity of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Nature Communications. 13 (1), 6619 (2022).
- Luo, H., et al. Characterizing dedifferentiation of thyroid cancer by integrated analysis. Science Advances. 7 (31), (2021).
- Knostman, K. A. B., Jhiang, S. M., Capen, C. C. Genetic alterations in thyroid cancer: the role of mouse models. Veterinary Pathology. 44 (1), 1-14 (2007).
- Kim, C. S., Zhu, X. Lessons from mouse models of thyroid cancer. Thyroid. 19 (12), 1317-1331 (2009).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Cabanillas, M. E., Ryder, M., Jimenez, C. Targeted therapy for advanced thyroid cancer: kinase inhibitors and beyond. Endocrine Reviews. 40 (6), 1573-1604 (2019).
- Ljubas, J., Ovesen, T., Rusan, M. A systematic review of phase II targeted therapy clinical trials in anaplastic thyroid cancer. Cancers. 11 (7), 943 (2019).
- Huang, N. -S., et al. An update of the appropriate treatment strategies in anaplastic thyroid cancer: a population-based study of 735 patients. International Journal of Endocrinology. 2019, 8428547 (2019).
- Subbiah, V., et al. Dabrafenib and trametinib treatment in patients with locally advanced or metastatic BRAF V600-mutant anaplastic thyroid cancer. Journal of Clinical Oncology. 36 (1), 7-13 (2018).
- Baldini, E., et al. Effects of selective inhibitors of Aurora kinases on anaplastic thyroid carcinoma cell lines. Endocrine-Related Cancer. 21 (5), 797-811 (2014).
