Summary
Aquí, presentamos una tubería estándar para obtener tumores murinos ATC mediante modelos espontáneos de ratón genéticamente modificados. Además, presentamos la dinámica tumoral y la información patológica sobre las lesiones primarias y metastástasis. Este modelo ayudará a los investigadores a comprender la tumorigénesis y facilitar los descubrimientos de fármacos.
Abstract
El cáncer anaplásico de tiroides (ATC) es una neoplasia maligna rara pero letal con un pronóstico sombrío. Existe una necesidad urgente de una investigación más profunda sobre la carcinogénesis y el desarrollo de ATC, así como métodos terapéuticos, ya que los tratamientos estándar se agotan esencialmente en pacientes con ATC. Sin embargo, la baja prevalencia ha obstaculizado estudios clínicos exhaustivos y la recolección de muestras de tejido, por lo que se ha avanzado poco en la creación de tratamientos efectivos. Utilizamos ingeniería genética para crear un modelo murino ATC condicionalmente inducible (mATC) en un fondo C57BL/6. El modelo murino ATC fue genotipado por TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 ex2-10/ex2-10 e inducido por inyección intraperitoneal con tamoxifeno. Con el modelo murino, investigamos la dinámica tumoral (el tamaño del tumor varió de 12,4 mm 2 a 32,5 mm2 después de 4 meses de inducción), la supervivencia (la mediana del período de supervivencia fue de 130 días) y metástasis (las metástasis pulmonares ocurrieron en el 91,6% de los ratones) curvas y características patológicas (caracterizadas por tinción inmunohistoquímica Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 y Caspasa-3). Los resultados indicaron que el mATC espontáneo posee una dinámica tumoral y un microambiente inmunológico muy similares a los tumores ATC humanos. En conclusión, con una alta similitud en las características fisiopatológicas y genotipos unificados, el modelo mATC resolvió la escasez de tejido clínico ATC y la heterogeneidad de la muestra hasta cierto punto. Por lo tanto, facilitaría el mecanismo y los estudios traslacionales de ATC y proporcionaría un enfoque para investigar el potencial de tratamiento de fármacos moleculares pequeños y agentes de inmunoterapia para ATC.
Introduction
El cáncer de tiroides es una de las neoplasias endocrinas más comunes1, que se origina en el epitelio tiroideo. En los últimos años, la incidencia de cáncer de tiroides ha aumentado rápidamente en todo el mundo2. El cáncer de tiroides se puede dividir en distintos tipos según el grado de diferenciación de las células tumorales. Sobre la base del comportamiento clínico y la histología, los carcinomas de tiroides se dividen en carcinomas bien diferenciados, incluyendo carcinoma papilar de tiroides (PTC) y carcinoma folicular de tiroides (FTC), carcinoma pobremente diferenciado (PDTC) y carcinoma indiferenciado o anaplásico de tiroides (ATC)3. A diferencia del PTC, que es un tipo común con comportamiento leve y mejor pronóstico4, el ATC es una neoplasia maligna rara y altamente agresiva que representa del 2% al 3% de todos los tumores tiroideos5. Aunque el ATC es raro, es responsable de aproximadamente el 50% de las muertes relacionadas con el cáncer de tiroides, con una supervivencia sombría (6-8 meses)6,7. Más del 50% de los casos de ATC se diagnostican como metástasis pulmonar8. Además de la naturaleza agresiva del ATC, se ha desarrollado un tratamiento efectivo limitado en la clínica. Por lo tanto, los pacientes con ATC tienen un pronóstico sombrío 9,10,11. Esto sugiere que se necesitan urgentemente más estudios en profundidad sobre los mecanismos moleculares subyacentes al desarrollo del ATC y el tratamiento.
La tumorigénesis del ATC es un proceso dinámico desdiferenciado. La dificultad para recolectar muestras de tumores humanos en cada etapa de los estudios clínicos ha dificultado la comprensión del mecanismo de desarrollo de carcinomas bien diferenciados a indiferenciados. En contraste, el uso de modelos murinos de ATC (mATC) favorece la recolección de muestras de mATC en todo el curso de la tumorigénesis. Por lo tanto, podemos comprender mejor los mecanismos de formación de tumores analizando el proceso dinámico desdiferenciado. Además, la heterogeneidad de las muestras clínicas de ATC también ha contribuido a la dificultad de comprender el mecanismo molecular. Sin embargo, los ratones compartían los mismos antecedentes genéticos y se mantuvieron en entornos de vida similares, asegurando la consistencia de cada tumor. Esto facilita explorar el papel generalizado del desarrollo de ATC12,13,14. Además, mATC es un modelo tumoral in situ que puede restaurar la influencia de la ubicación anatómica y el microambiente específico del tejido. Como tal, en comparación con los ratones inmunodeficientes de uso común, mATC es un modelo murino espontáneo con un sistema inmune intacto y un microambiente inmune.
Por lo tanto, construimos mATC inducido condicionalmente con la cepa C57BL/6, que es un modelo murino capaz de reproducir las características patológicas del carcinoma tiroideo desdiferenciado. Con base en este modelo, dimos una breve descripción de las bases moleculares, ideas de construcción, características patológicas y aplicaciones de mATC. Además, observamos e informamos el crecimiento tumoral, el tiempo de supervivencia, la metástasis y las características patológicas de mATC. Creemos que esta será una visión general informática para ayudar a otros investigadores a usar este modelo más fácilmente.
Construimos un modelo mATC inducible condicional, como se informó por primera vez en McFadden15; inicialmente, construimos ratones: TPO-cre / ERT2, Braf flox / wt y Trp53flox / wt. Específicamente, los ratones TPO-cre / ERT2 incluyeron el promotor de la peroxidasa tiroidea humana (TPO) (un promotor específico de la tiroides), impulsando la expresión de un gen de fusión cre-ERT2 (una recombinasa cre fusionada a un dominio de unión al ligando del receptor de estrógeno humano). Cre-ERT2 generalmente se limita al citoplasma y entra en el núcleo solo cuando se expone al tamoxifeno, que induce a cre a ejercer actividad enzimática recombinante. Cuando los ratones se cruzan con ratones portadores de secuencias flanqueadas por loxP, después de la inducción de tamoxifeno, la recombinación mediada por cre elimina las secuencias floxed en las células tiroideas para lograr el propósito de eliminar o golpear genes específicos.
Además, los ratones Braf flox/wt son un alelo knock-in de Braf humano basado en el sistema cre-loxP. La transcripción murina Brafflox/wt está codificada por los exones endógenos 1-14 y los exones humanos flanqueados por loxP 15-18. Después de la escisión mediada por cre de las regiones floxed, el exón mutante 15 (modificado con una sustitución de aminoácidos V600E vinculada con BrafV600E constitutivamente activo en cánceres humanos) y los exones endógenos 16-18 se utilizan para generar las transcripciones. Además, los ratones Trp53 flox/wt son alelos knockout de Trp53 humano y tienen sitios loxP flanqueando los exones 2-10 de Trp53. Cuando se cruza con ratones con una recombinasa cre, la recombinación mediada por cre elimina la secuencia floxed para eliminar Trp53. Luego, se cruzaron ratones TPO-cre/ERT2, Braf flox/w y Trp53flox/wt para obtener TB (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt) ratones y TBP (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt; Trp53flox/wt) ratones, que podrían usarse para generar PTC y ATC. Después de aproximadamente 8 semanas, los ratones fueron inducidos por una administración intraperitoneal (i.p.) de 150 mg / kg de tamoxifeno disuelto en aceite de maíz durante dos administraciones. El crecimiento tumoral podría controlarse mediante ecografía de alta frecuencia (el primer punto de tiempo de la ecografía se registró como el Día 0). La ecografía inicial se realizó 40 días después de la introducción del tamoxifeno.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Los procedimientos con animales descritos aquí se realizaron con la aprobación del Comité de Ética Animal del Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan, Chengdu, Sichuan, China.
1. Inducción de ratones TBP
- Identificar el genotipo de los ratones
- Alrededor de las 3 semanas, separe los ratones hembra de los ratones machos. Al mismo tiempo, use una abrazadera de marca auricular para arreglar una marca auricular. Coloque las marcas auriculares en la mitad inferior y en el tercio medio de la oreja, asegurándose de evitar el área con la mayor concentración de capilares.
- Sujete suavemente pero con seguridad a los ratones. Agarre firmemente la base de la cola del ratón. Coloque los ratones sobre una superficie que les permita agarrarse.
- Coloque suavemente pero con firmeza la mano libre sobre los hombros, luego agarre rápidamente el cuello entre el pulgar y el índice. Sostenga la cola con el dedo meñique.
- Frotar la cola con alcohol. Use tijeras estériles para cortar la muestra de piel <5 mm y colóquela en un recipiente de muestra limpio con una etiqueta. No es necesario quitar el pelaje de los ratones. Comprimir la cola con esponjas estériles para lograr la hemostasia.
- A continuación, lisar la cola murina y realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para identificar el genotipo.
NOTA: Después de cortar una cola murina, la superficie de las tijeras debe limpiarse con algodón alcohólico para evitar la contaminación mutua de genes entre las colas murinas. Después de colocarlos en su jaula, los ratones deben ser observados durante 5 minutos para buscar cualquier signo de sangrado en el sitio de la herida. Consulte la Tabla 1 para obtener la lista de cebadores y los ajustes de PCR utilizados en este estudio.
- Ratones TBP inducidos por tamoxifeno
- Pesar 0,3 g de tamoxifeno y disolverlo en 15 ml de aceite de maíz por ultrasonido (potencia = 20%, duración = 20 min, temperatura = 4 °C), a una concentración de 20 mg / ml. Conservar a 4 °C.
NOTA: El tamoxifeno es sensible a la luz y debe colocarse en un recipiente marrón. - Alrededor de las 8 semanas, pesar a los ratones con balanzas electrónicas y administrarles una inyección i.p. de tamoxifeno a una dosis de 150 mg / kg, administrada dos veces con un intervalo de 1 semana.
- Pesar 0,3 g de tamoxifeno y disolverlo en 15 ml de aceite de maíz por ultrasonido (potencia = 20%, duración = 20 min, temperatura = 4 °C), a una concentración de 20 mg / ml. Conservar a 4 °C.
2. Disección e imágenes de tumores tiroideos de ratón y tumores metastásicos
- Preparación
- Prepare las herramientas de disección: tijeras y pinzas estériles, cuchilla estéril, botella de spray de alcohol al 75%, borde recto de 20 cm, pinzas vernier, toallas de papel y algodón con alcohol.
- Solución de fijación de tejido de ratón: prepare una solución de fijación de tejido de paraformaldehído al 4%.
- Limpie un plato de 10 cm lleno de aproximadamente 10 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) para el almacenamiento temporal de tejido, y lave la sangre en la superficie del tejido.
- Extracción de tiroides
- Eutanasia a los ratones con dióxido de carbono a un caudal de 2,0 L/min durante 5 min. Retire los ratones de la jaula y realice la dislocación cervical.
- Coloque el ratón en la tabla de disección con el lado ventral hacia arriba y la cabeza alejada del experimentador, y fije las extremidades en la tabla de disección con agujas de jeringa estériles. Para una extracción más conveniente del tejido tiroideo, use otra aguja de jeringa estéril para fijar la cabeza.
- Desinfecte el cuello con tres rondas alternas de un exfoliante de clorhexidina o povidona yodada seguido de alcohol al 75%. Luego, haga una pequeña incisión por encima del centro de la clavícula con tijeras y fórceps estériles.
- Continúe la incisión en la línea media hasta la boca. Encuentre la glándula submandibular y retírela para exponer la ubicación anatómica de la tiroides, que se coloca cerca del cartílago tiroides y la tráquea.
- Encuentre la tiroides, diseccione cuidadosamente la tiroides del resto de la región del cuello con tijeras estériles, luego coloque la tiroides extirpada en un plato de 10 cm lleno de 10 ml de PBS estéril.
NOTA: Durante la extirpación de la glándula tiroides, sea suave y lento y evite cortar los vasos sanguíneos del cuello. Si se cortan los vasos del cuello, el cuello se llenará inmediatamente de sangre, y la sangre debe eliminarse rápidamente con esponjas de alcohol para exponer la ubicación anatómica de la tiroides. Antes de extraer el tejido tiroideo, observe cuidadosamente las características de los lóbulos izquierdo y derecho de la tiroides (tamaño, forma, etc.) para evitar no poder distinguir entre los lóbulos izquierdo y derecho de la tiroides después de la extracción. - En PBS estéril, retire la sangre de la superficie del tejido tiroideo con tijeras estériles y corte cuidadosamente la tráquea. Luego, coloque el tejido tiroideo en un paño estéril y mida el tamaño de los lóbulos izquierdo y derecho de la glándula tiroides con calibradores vernier.
- Divida los lóbulos izquierdo y derecho de la glándula tiroides en dos partes con una cuchilla estéril. Ponga una parte en 2 ml de solución de paraformaldehído al 4% para la fijación, y ponga la otra parte en nitrógeno líquido para su conservación.
- Extracción de pulmón e hígado
- Desinfecte el abdomen con tres rondas alternas de un exfoliante de clorhexidina o povidona yodada y alcohol al 75%. Luego, pellizque justo por encima del pene del ratón y haga una pequeña incisión, corte a lo largo de la línea media del abdomen hasta el hueso subclavio y exponga la cavidad abdominal.
- Encuentra el hígado en la parte superior del abdomen y retíralo con cuidado. Coloque el hígado en PBS estéril.
- Corte con cuidado el diafragma a lo largo de las costillas para exponer la cavidad torácica. A continuación, agarre el esternón y tire hacia arriba para ampliar aún más el espacio. Encuentra el pulmón y extráigalo. Coloque el pulmón extirpado en PBS estéril.
- Observe groseramente si hay metástasis en el pulmón y el hígado. Cuente el número de metástasis y tome un registro digital. Después de eso, use una cuchilla estéril para dividir los tejidos pulmonares y hepáticos en dos partes. Ponga una parte en 3 ml de solución de paraformaldehído al 4% para la fijación y otra parte en nitrógeno líquido para su conservación.
- Deshidratación tisular
- Coloque los pañuelos en la caja de deshidratación. Coloque la caja de deshidratación en la cesta en el degradado de deshidratación de alcohol de la siguiente manera: 70% de alcohol durante 1 h; 80% de alcohol durante 1 h; 95% de alcohol durante 30 min; 95% de alcohol durante 30 min; etanol anhidro I durante 30 min; etanol anhidro II durante 30 min; xileno I durante 20 min; xileno II durante 20 min; cera de parafina I durante 30 min; cera de parafina II durante 1 h; cera de parafina III durante 30 min.
- Incruste los tejidos impregnados de cera en la máquina de incrustación.
- Coloque primero la cera derretida en el marco de incrustación. Antes de que la cera se solidifique, retire el tejido de la caja de deshidratación y colóquelo en el marco de incrustación, luego coloque la etiqueta.
- Dejar enfriar la cera a -20 °C en la mesa de congelación. Después de que la cera se solidifique, retire el bloque de cera del marco de incrustación y recórtelo.
- Coloque el bloque de cera recortado en una cortadora de parafina, fijada a un grosor de 5 μm y un tamaño de 2 cm x 2 cm. Después de seccionar, deje que las secciones floten en un esparcidor con agua tibia a 45 ° C para aplanar el tejido. Recoger el pañuelo con un portaobjetos y hornear las rodajas en un horno a 65 °C durante 2 h.
- Después de que el agua se seque y la cera se derrita, retire el portaobjetos con el tejido y úselo para la tinción de hematoxilina y eosina (HE) e inmunohistoquímica (IHC)16. Asegúrese de que las secciones estén adheridas a las diapositivas para teñirlas.
3. Tinción HE del tumor primario y pulmón
- Desparafinado
- Coloque las diapositivas con las secciones en xileno durante 10 min.
- Pase al alcohol anhidro (100%) (dos botellas) durante aproximadamente 3 minutos cada una.
- Pase al 95% de alcohol (dos botellas) durante aproximadamente 3 minutos cada una.
- Pase al 80% de alcohol durante unos 3 minutos.
- Pasar al 50% de alcohol durante unos 3 minutos.
- Muévase al agua del grifo y lave el alcohol durante aproximadamente 1 minuto.
- Tinción
- Mueva los portaobjetos a hematoxilina durante 8 min.
- Mueva los portaobjetos en el agua durante 1 minuto para lavar la hematoxilina; El tejido cambia de azul a rojo.
- Mueva los portaobjetos en alcohol de ácido clorhídrico al 1% durante aproximadamente 30 s.
- Mueva los toboganes al agua, lavando durante 5 minutos.
- Mueva los portaobjetos a eosina durante 90 s, luego lávelos con agua durante 5 minutos.
- Mueva las diapositivas al 50% de alcohol, 80% de alcohol, 95% de alcohol (dos botellas) y alcohol anhidro (100%) (dos botellas), durante 1 minuto cada una.
- Mueva los portaobjetos al xileno durante 5 minutos.
- Después de que los portaobjetos estén secos, séllelos con resina neutra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inducimos mATC para investigar el crecimiento tumoral, el tiempo de supervivencia del ratón y las características patológicas. Después de la inducción, los ratones fueron sacrificados inmediatamente y se recolectaron muestras (tiroides, pulmón e hígado) una vez que se encontró una de las siguientes afecciones: 1) dificultad respiratoria causada por compresión tumoral; 2) disminución del apetito y vocalización anormal; 3) letargo inusualmente irritable; y 4) pérdida de peso corporal de más del 20%. Durante el proceso de muestreo, encontramos que todos los ratones (12/12) formaron tumores con éxito después de la inducción. Registramos el tiempo de supervivencia del ratón, las características / tamaño del tumor y las lesiones metastatizadas.
Groseramente observamos lo siguiente: 1) los tumores estaban sensibles, y el tamaño de los tumores en los lados izquierdo y derecho era inconsistente; 2) la mayoría de los ratones (11/12) tenían metástasis pulmonares, pero ninguno tenía metástasis hepáticas. Específicamente, el tamaño del tumor fue monitoreado por ultrasonido de alta frecuencia animal y sistemas de imagen fotoacústica (Vevo®3100) durante todo el proceso17. Con base en los datos de ultrasonido, se trazó la curva de crecimiento tumoral (Figura 1A) para observar la alteración dinámica del tamaño del tumor. Además, los tumores crecieron lentamente en la etapa temprana (el tamaño promedio del tumor varió de 9.47 mm 2 a 11.75 mm 2 desde el Día 0 hasta el Día 60), y se volvieron dramáticamente más rápidos en la etapa tardía (el tamaño promedio del tumor varió de 11.75 mm 2 a 23.95 mm 2 (desde el Día 60 hasta el Día 100). La mayoría de los ratones fueron sacrificados en la etapa tardía. En resumen, el mATC con un cierto período de latencia tumoral debe ser monitoreado de cerca después de 60 días para prevenir la muerte relacionada con la asfixia.
Por otro lado, se registró el tiempo de supervivencia de los ratones y se trazó una curva de supervivencia (Figura 1B). La mediana de supervivencia de mATC fue de 130 días, con una variación de 56 a 166 días. Además, se encontró metástasis pulmonar en la mayoría de los ATCm (aproximadamente 92%) (Figura 1C). Observamos que solo un ratón en esta cohorte no mostró metástasis pulmonares en el examen macroscópico, y seis ratones tenían más de una lesión metastásica pulmonar. No se encontró metástasis hepáticas. En resumen, estos resultados fueron consistentes con el comportamiento biológico de ATC, que son propensos a metástasis pulmonares en clínicas.
Además, para observar mejor el proceso dinámico de mATC, sacrificamos los ratones en dos puntos de tiempo (1 mes y 2 meses después de la inducción). Se realizó tinción HE en los tumores primarios y tejidos pulmonares metastásicos de mATC (Figura 1D). En tejido inducible de 1 mes, observamos características solidificadas incompletas y la coexistencia de estructuras foliculares y células malignas. Las estructuras foliculares tiroideas desaparecieron y el tumor se solidificó completamente después de una inducción de 2 meses. La tinción HE del tumor primario reveló que las células tumorales eran morfológicamente diversas, con células gigantes pleomórficas (indicadas por una flecha roja) y células en forma de huso (indicadas por una flecha amarilla). También mostró una amplia variedad en el tamaño nuclear, y muchas células contenían múltiples núcleos. Se observaron focos metastásicos claros (indicados por un círculo) en el pulmón. La tinción HE de tejidos pulmonares metastásicos mostró que el tejido pulmonar normal era una estructura reticular con estructuras alveolares y espacios aéreos claros. Sin embargo, las metástasis pulmonares mostraron una pérdida de la estructura reticular normal, engrosamiento de la cavidad aérea y parénquima pulmonar.
Mientras tanto, se realizó tinción IHQ para caracterizar aún más (Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 y Caspasa-3) los tumores mATC para cuantificar la proliferación celular y la apoptosis, e investigar la infiltración de linfocitos, células T-regular (Treg) y células mieloides (Figura 2A-D). La tinción anti-Ki67 fue altamente positiva, variando de 86,9% a 95,07%, demostrando un alto grado de proliferación celular. Se utilizó el anticuerpo anti-caspasa-3 activado para probar la tasa de apoptosis, que osciló entre el 5,2% y el 51,9%. En concreto, el ATCm presentó una evidente infiltración de linfocitos T CD8+, cuyo cociente osciló entre el 0,47% y el 10,55% (media: 5,93%). Esto indicó que mATC no era un tumor del desierto inmunitario, lo cual era consistente con las muestras de ATC. Además, la tinción de Foxp3 definió las células Treg, que variaron de 0,45% a 25,8%. Además de los linfocitos, se utilizaron F4/80 y Cd206 para definir macrófagos y macrófagos M2, respectivamente. Se encontró que las células mieloides infiltraron ampliamente los tumores (tasa de células positivas F4/80 de 86,6% a 94,6%; Tasa celular positiva de CD206 de 40,4% a 67,7%), lo que fue consistente con la literatura previa16. En resumen, encontramos células tumorales altamente proliferativas, infiltración de linfocitos e infiltración extensa de células mieloides en mATC, lo que fue consistente con muestras clínicas.
En conclusión, las muestras de mATC mostraron homogeneidad en la dinámica tumoral, metástasis y características patológicas, consistente con las muestras clínicas. Teniendo en cuenta la tasa de formación de tumores, mATC fue un modelo murino confiable.
Figura 1: Dinámica tumoral y características patológicas. (A) Curva de crecimiento tumoral de ratones (n = 5). Cada línea representa un ratón: la etapa inicial va del día 0 al día 60, y la etapa tardía va del día 60 al día 100. (B) Curvas de supervivencia de ratones (n = 12). La mediana de supervivencia del ATCm fue de 130 días, con una variación de 56 días a 166 días. (C) Curvas de metástasis pulmonar de ratones (n = 12). Imágenes de disección representativas de metástasis tiroideas y pulmonares. La flecha roja indica el tumor tiroideo y el círculo blanco indica metástasis en el pulmón. (D) tinción HE del tumor primario (1 mes y 2 meses después de la inducción) y metástasis pulmonar. La flecha roja indica la célula gigante pleomórfica, la flecha amarilla indica la célula en forma de huso y el área en círculo indica una metástasis en el pulmón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Breve descripción de la infiltración de células inmunes en mATC. (A) Tinción inmunohistoquímica de tumores primarios murinos ATC con anticuerpos (Cd8, Foxp3). La flecha roja indica una celda positiva CD8, la flecha amarilla indica una celda positiva Foxp3. (B) Tinción inmunohistoquímica de tumores primarios murinos ATC con anticuerpos (Ki67, Caspasa-3). (C) Tinción inmunohistoquímica de tumores primarios murinos ATC con anticuerpos (F4/80, Cd206). d) La cuantificación de la CIH. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: La lista de cebadores y los ajustes de PCR utilizados en este estudio. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pasos críticos dentro del protocolo para la disección de tumores tiroideos
Durante la disección, la ubicación anatómica de la glándula tiroides debe entenderse correctamente. La glándula tiroides es una glándula en forma de mariposa ubicada en el lado dorsal de la glándula submandibular cerca del cartílago tiroides y la tráquea. Durante el procedimiento, se evitó cuidadosamente cortar las arterias sanguíneas en ambos lados del cuello.
Modificación y solución de problemas de la raza mATC
ATC es una neoplasia maligna rara y altamente agresiva. Las características clínicas de los pacientes con mATC y ATC tienen ciertas similitudes. Específicamente, la principal causa de muerte en el ATCm es la asfixia, que es consistente con los pacientes con ATC. Por lo tanto, durante el experimento, se debe tener en cuenta lo siguiente: 1) agarre suavemente a los ratones y preste atención a su respiración durante la operación; 2) vigilar de cerca durante la etapa tardía para evitar la muerte súbita y la falta de obtención de muestras a tiempo; 3) Los tejidos tiroideos y pulmonares se ven fácilmente afectados por la sangre en la superficie de los tejidos para la observación y la fotografía, por lo que el volumen de sangre de los ratones puede reducirse mediante la enucleación del globo ocular.
Limitaciones del uso de mATC
La aparición y el desarrollo del ATC humano es complejo y cambiante, pero el trasfondo genético de mATC es relativamente simple, lo que solo puede simular una parte del ATC humano. Por ejemplo, algunos tejidos ATC albergaban mutaciones TERT y BRAF, la variante 18 del número de copias NOTCH2NL, en lugar de mutaciones P53, que pueden tener diferentes mecanismos de tumorigénesis y características patológicas clínicas 7,19,20. Además, el ATC generalmente tiene un curso de tiempo largo antes del diagnóstico, pero mATC obtiene un diagnóstico después de una inducción de 2 meses. Por lo tanto, existen distinciones inherentes entre mATC y el cáncer de tiroides humano, los modelos animales no pueden imitar completamente todas las características del cáncer de tiroides humano, y muchas terapias que están restringidas a humanos no pueden evaluarse en mATC. Además, aunque mATC se puede usar para investigar los efectos terapéuticos de varios medicamentos de moléculas pequeñas, se deben diseñar varios productos biológicos (por ejemplo, anticuerpos o medicamentos relacionados con anticuerpos) específicamente para ratones. Además, todo el proceso de construcción de ratones knockout condicionales y luego obtener el genotipo objetivo de ratones mediante cruzamiento lleva mucho tiempo y requiere ciertas condiciones de cultivo de ratones y costos21,22.
Importancia del uso de mATC en la investigación del cáncer de tiroides
La heterogeneidad de la población humana y la rareza del ATC humano dificultan la exploración de posibles mecanismos y opciones terapéuticas para ATC. Como modelo de ratón fiable, mATC facilita la recolección de tejidos ATC y enriquece el conjunto de muestras de tejido ATC. mATC también puede ser utilizado para estudiar los efectos de funciones genéticas específicas en ATC, estudiar los mecanismos celulares y moleculares del desarrollo de ATC, comprender los mecanismos de progresión del tumor tiroideo y resistencia a los medicamentos, y finalmente mejorar el pronóstico de los pacientes con ATC16.
Aplicaciones futuras de mATC
mATC se puede utilizar para la investigación sobre diversos aspectos de la radioterapia, la quimioterapia, la terapia génica, la inmunoterapia y la terapia dirigida. mATC también se puede utilizar para explorar los efectos terapéuticos y los efectos adversos de los regímenes, como las combinaciones entre diferentes fármacos o con radioterapia. Posteriormente, utilizamos mATC para investigar los efectos terapéuticos de la radioterapia combinada con inmunoterapia y fármacos inhibidores de moléculas pequeñas sobre ATC. Además, mATC se puede utilizar para investigar los efectos de diversas modalidades o vías de administración sobre los efectos antitumorales de los medicamentos para desarrollar sistemas de administración de fármacos con mayor actividad antitumoral. En futuras aplicaciones clínicas, esperamos minimizar la tasa de recurrencia y la tasa de mortalidad de los pacientes con cáncer de tiroides y, por lo tanto, mejorar la tasa de supervivencia de los pacientes.
Esperamos que se desarrollen más modelos murinos ATC en el futuro, así como análisis más profundos de ATC en diferentes orígenes genéticos, como PTEN y P13K23. Estos revelarán de manera más completa el mecanismo molecular de la tumorigénesis y progresión del ATC, predecirán el resultado del tratamiento con ATC y podrían proporcionar a los pacientes posibles objetivos terapéuticos 24,25,26,27,28. Esperamos que a través de una mayor exploración experimental, podamos mejorar el método de modelado del modelo de ratón y acortar el tiempo de modelado para hacer más contribuciones a la investigación básica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Desarrollo de Investigación Clave de China (2021YFA1301203); la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); el Proyecto de Incubación de Investigación Clínica, Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan (22HXFH019); el Proyecto de Cooperación Internacional de la Oficina Municipal de Ciencia y Tecnología de Chengdu (2020-GH02-00017-HZ); Fundación de Ciencias Naturales de Sichuan, 2022NSFSC1314; el "1.3.5 proyecto para disciplinas de excelencia, Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan" (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); y Programa de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2023YFS0098).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
| 50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
| CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
| Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
| Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
| Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
| Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Parenti, R., Salvatorelli, L., Magro, G. Anaplastic thyroid carcinoma: Current treatments and potential new therapeutic options with emphasis on TfR1/CD71. International Journal of Endocrinology. 2014, 685396 (2014).
- Baldini, E., et al. In vitro and in vivo effects of the urokinase plasminogen activator inhibitor WX-340 on anaplastic thyroid cancer cell lines. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 3724 (2022).
- Haugen, B. R. American Thyroid Association Management guidelines for adult patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer: what is new and what has changed. Cancer. 123 (3), 372-381 (2015).
- O'Neill, J. P., Shaha, A. R.
- Simoes-Pereira, J., Capitao, R., Limbert, E., Leite, V. Anaplastic thyroid cancer: Clinical picture of the last two decades at a single oncology referral centre and novel therapeutic options. Cancers. 11 (8), 1188 (2019).
- Fagin, J. A., Wells, S. A. Biologic and clinical perspectives on thyroid cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (11), 1054-1067 (2016).
- Neff, R. L., Farrar, W. B., Kloos, R. T., Burman, K. D.
- Lareau, C. A., et al. Droplet-based combinatorial indexing for massive-scale single-cell chromatin accessibility. Nature Biotechnology. 37 (8), 916-924 (2019).
- Guo, H., et al. Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing. Genome Research. 23 (12), 2126-2135 (2013).
- Mooijman, D., Dey, S. S., Boisset, J. -C., Crosetto, N., van Oudenaarden, A. Single-cell 5hmC sequencing reveals chromosome-wide cell-to-cell variability and enables lineage reconstruction. Nature Biotechnology. 34 (8), 852-856 (2016).
- Smallridge, R. C., Marlow, L. A., Copland, J. A. Anaplastic thyroid cancer: molecular pathogenesis and emerging therapies. Endocrine-Related Cancer. 16 (1), 17-44 (2009).
- Charles, R. -P. Overview of genetically engineered mouse models of papillary and anaplastic thyroid cancers: enabling translational biology for patient care improvement. Current Protocols in Pharmacology. 69, 1-14 (2015).
- Tuttle, R. M., Haugen, B., Perrier, N. D. Updated American joint committee on cancer/tumor-nodemetastasis staging system for differentiated and anaplastic thyroid cancer (8th Edition): What changed and why. Thyroid. 27 (6), 751-756 (2017).
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Protocols of the National Academy of Sciences. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Gunda, V., et al. Combinations of BRAF inhibitor and anti-PD-1/PD-L1 antibody improve survival and tumour immunity in an immunocompetent model of orthotopic murine anaplastic thyroid cancer. British Journal of Cancer. 119 (10), 1223-1232 (2018).
- He, Y., et al. High-resolution ultrasonography for the analysis of orthotopic ATC tumors in a genetically engineered mouse model. Journal of Visualized Experiments. (188), e64615 (2022).
- Zhang, L., et al. Novel recurrent altered genes in Chinese patients with anaplastic thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (4), 988-998 (2021).
- Luo, H., et al. Pan-cancer single-cell analysis reveals the heterogeneity and plasticity of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Nature Communications. 13 (1), 6619 (2022).
- Luo, H., et al. Characterizing dedifferentiation of thyroid cancer by integrated analysis. Science Advances. 7 (31), (2021).
- Knostman, K. A. B., Jhiang, S. M., Capen, C. C. Genetic alterations in thyroid cancer: the role of mouse models. Veterinary Pathology. 44 (1), 1-14 (2007).
- Kim, C. S., Zhu, X. Lessons from mouse models of thyroid cancer. Thyroid. 19 (12), 1317-1331 (2009).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Cabanillas, M. E., Ryder, M., Jimenez, C. Targeted therapy for advanced thyroid cancer: kinase inhibitors and beyond. Endocrine Reviews. 40 (6), 1573-1604 (2019).
- Ljubas, J., Ovesen, T., Rusan, M. A systematic review of phase II targeted therapy clinical trials in anaplastic thyroid cancer. Cancers. 11 (7), 943 (2019).
- Huang, N. -S., et al. An update of the appropriate treatment strategies in anaplastic thyroid cancer: a population-based study of 735 patients. International Journal of Endocrinology. 2019, 8428547 (2019).
- Subbiah, V., et al. Dabrafenib and trametinib treatment in patients with locally advanced or metastatic BRAF V600-mutant anaplastic thyroid cancer. Journal of Clinical Oncology. 36 (1), 7-13 (2018).
- Baldini, E., et al. Effects of selective inhibitors of Aurora kinases on anaplastic thyroid carcinoma cell lines. Endocrine-Related Cancer. 21 (5), 797-811 (2014).
