Summary
כאן, אנו מציגים צינור סטנדרטי להשגת גידולי ATC מורין על ידי מודלים עכבריים מהונדסים גנטית ספונטניים. יתר על כן, אנו מציגים דינמיקה של הגידול ומידע פתולוגי על הנגעים הראשוניים והגרורות. מודל זה יסייע לחוקרים להבין גידולים ולהקל על תגליות תרופות.
Abstract
סרטן בלוטת התריס אנפלסטי (ATC) הוא ממאירות נדירה אך קטלנית עם פרוגנוזה עגומה. יש צורך דחוף במחקר מעמיק יותר על הקרצינוגנזה ופיתוח של ATC, כמו גם שיטות טיפוליות, שכן טיפולים סטנדרטיים הם למעשה מדולדלים בחולי ATC. עם זאת, שכיחות נמוכה הקשתה על מחקרים קליניים יסודיים ואיסוף דגימות רקמות, ולכן הושגה התקדמות מועטה ביצירת טיפולים יעילים. השתמשנו בהנדסה גנטית כדי ליצור מודל ATC מורין מותנה (mATC) על רקע C57BL/6. מודל ATC murine עבר גנוטיפ על ידי TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 ex2-10/ex2-10 ומושרה על ידי הזרקה intraperitoneal עם טמוקסיפן. בעזרת מודל מורין חקרנו את דינמיקת הגידול (גודל הגידול נע בין 12.4 מ"מ 2 ל-32.5 מ"מ2 לאחר 4 חודשים של זירוז), הישרדות (תקופת ההישרדות החציונית הייתה 130 יום), גרורות (גרורות ריאה התרחשו ב-91.6% מהעכברים), עקומות ומאפיינים פתולוגיים (המאופיינים בצביעה אימונוהיסטוכימית של Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 וקספאז-3). התוצאות הצביעו על כך של-mATC ספונטני יש דינמיקה של גידולים דומים מאוד ומיקרו-סביבה אימונולוגית לגידולי ATC אנושיים. לסיכום, עם דמיון רב בתכונות פתופיזיולוגיות וגנוטיפים מאוחדים, מודל mATC פתר במידה מסוימת את המחסור ברקמת ATC קלינית ובהטרוגניות דגימה. לכן, זה יקל על המנגנון ומחקרים תרגומיים של ATC ולספק גישה לחקור את פוטנציאל הטיפול של תרופות מולקולריות קטנות וחומרים אימונותרפיה עבור ATC.
Introduction
סרטן בלוטת התריס הוא אחד הממאירויות האנדוקריניות הנפוצות ביותר1, שמקורו באפיתל בלוטת התריס. בשנים האחרונות, שכיחות סרטן בלוטת התריס עלתה במהירות ברחבי העולם2. ניתן לחלק את סרטן בלוטת התריס לסוגים שונים בהתאם למידת התמיינות תאי הגידול. על בסיס התנהגות קלינית והיסטולוגיה, קרצינומה של בלוטת התריס מחולקת לקרצינומה ממוינת היטב, כולל קרצינומה פפילרית של בלוטת התריס (PTC) וקרצינומה פוליקולרית של בלוטת התריס (FTC), קרצינומה ממוינת גרוע (PDTC), וקרצינומה לא ממוינת או אנפלסטית של בלוטת התריס (ATC)3. בניגוד ל-PTC, שהוא סוג נפוץ עם התנהגות קלה ופרוגנוזה טובה יותר4, ATC הוא ממאירות נדירה ואגרסיבית מאוד המהווה 2% עד 3% מכלל גידולי בלוטת התריס5. למרות ATC הוא נדיר, הוא אחראי על כ 50% של מקרי מוות הקשורים לסרטן בלוטת התריס, עם הישרדות עגומה (6-8 חודשים)6,7. מעל 50% ממקרי ATC מאובחנים כגרורות ריאה8. בנוסף לאופי האגרסיבי של ATC, פותח טיפול יעיל מוגבל במרפאה. לכן, לחולי ATC יש פרוגנוזה עגומה 9,10,11. זה מצביע על כך שיש צורך דחוף במחקרים מעמיקים נוספים על המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הפיתוח של ATC וטיפול.
הגידול של ATC הוא תהליך דינמי dedifferentiated. הקושי באיסוף דגימות גידול אנושי בכל שלב במחקרים קליניים פגע בהבנת מנגנון ההתפתחות מקרצינומה ממוינת היטב לבלתי מובחנת. לעומת זאת, השימוש במודלים של מורין ATC (mATC) מעדיף את איסוף דגימות mATC בכל קורס הגידול. לכן, אנו יכולים להבין טוב יותר את מנגנוני היווצרות הגידול על ידי ניתוח התהליך הדינמי dedifferentiated. בנוסף, ההטרוגניות של דגימות ATC קליניות תרמה גם היא לקושי בהבנת המנגנון המולקולרי. עם זאת, עכברים חלקו את אותו רקע גנטי והוחזקו בסביבות חיים דומות, מה שהבטיח את עקביותו של כל גידול. זה מאפשר לחקור את התפקיד הכללי של פיתוח ATC12,13,14. בנוסף, mATC הוא מודל גידול באתרו שיכול לשחזר את ההשפעה של המיקום האנטומי והמיקרו-סביבה הספציפית לרקמה. ככזה, בהשוואה לעכברים מדוכאי חיסון נפוצים, mATC הוא מודל מורין ספונטני עם מערכת חיסון שלמה ומיקרו-סביבה חיסונית.
לכן, בנינו mATC מושרה מותנה עם זן C57BL/6, שהוא מודל מורין המסוגל לשחזר את התכונות הפתולוגיות של קרצינומה של בלוטת התריס dedifferentiated. בהתבסס על מודל זה, נתנו סקירה קצרה של הבסיס המולקולרי, רעיונות בנייה, תכונות פתולוגיות ויישומים של mATC. בנוסף, צפינו ודיווחנו על צמיחת גידולים, זמן הישרדות, גרורות ומאפיינים פתולוגיים של mATC. אנו מאמינים שזו תהיה סקירה אינפורמטיבית שתסייע לחוקרים אחרים להשתמש במודל זה ביתר קלות.
בנינו מודל mATC מושרה מותנה, כפי שדווח לראשונה על ידי McFadden15; בתחילה בנינו עכברים: TPO-cre/ERT2, Braf flox/wt ו-Trp53flox/wt. באופן ספציפי, עכברי TPO-cre/ERT2 כללו את מקדם הפרוקסידז האנושי של בלוטת התריס (TPO) (מקדם ספציפי לבלוטת התריס), המניע את הביטוי של גן היתוך cre-ERT2 (cre recombinase המאוחה לתחום קשירת ליגנד קולטן אסטרוגן אנושי). Cre-ERT2 מוגבל בדרך כלל לציטופלסמה ונכנס לגרעין רק כאשר הוא נחשף לטמוקסיפן, אשר גורם ל-CRE להפעיל פעילות אנזים רקומביננטי. כאשר מוצלבים את העכברים עם עכברים הנושאים רצפי loxP, לאחר השראת טמוקסיפן, רקומבינציה בתיווך cre מוחקת את הרצפים floxed בתאי בלוטת התריס כדי להשיג את המטרה של נוקאאוט או דפיקה של גנים ספציפיים.
בנוסף, עכברי Braf flox/wt הם אלל נוק-אין של Braf אנושי המבוסס על מערכת cre-loxP. תעתיק Brafflox/wt murine מקודד על ידי אקסונים אנדוגניים 1-14 ואקסונים אנושיים צמודים loxP 15-18. לאחר כריתה בתיווך cre-mediated של האזורים floxed, אקסון מוטנטי 15 (שונה עם תחליף חומצת אמינו V600E מקושר עם BrafV600E פעיל באופן מכונן בסרטן אנושי) ואת exons אנדוגניים 16-18 משמשים כדי ליצור את התמלילים. יתר על כן, עכברי Trp53 flox/wt הם אללי נוקאאוט של Trp53 אנושי ויש להם אתרי loxP הצמודים לאקסונים 2-10 של Trp53. כאשר חוצים אותו עם עכברים עם cre recombinase, רקומבינאז בתיווך cre מוחק את הרצף floxed כדי להסתיר את Trp53. לאחר מכן, עכברי TPO-cre/ERT2, Braf flox/w ו-Trp53flox/wt נחצו כדי לקבל שחפת (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt) עכברים ו-TBP (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt; Trp53flox/wt) עכברים, אשר יכול לשמש ליצירת PTC ו- ATC. לאחר כ-8 שבועות, העכברים הושרו על ידי מתן תוך-צפקי (כלומר ) של 150 מ"ג/ק"ג טמוקסיפן מומס בשמן תירס במשך שני נתינים. ניתן היה לעקוב אחר צמיחת הגידול על ידי אולטרה-סאונד בתדירות גבוהה (נקודת הזמן הראשונה של אולטרה-סאונד נרשמה כיום 0). אולטרה-סאונד ראשוני בוצע 40 יום לאחר הכנסת הטמוקסיפן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ההליכים בבעלי חיים המתוארים כאן בוצעו באישור ועדת האתיקה של בעלי חיים בבית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן, צ'נגדו, סצ'ואן, סין.
1. השראת עכברי TBP
- זיהוי גנוטיפ עכברים
- בסביבות 3 שבועות, להפריד את נקבות העכברים מן העכברים הזכרים. במקביל, השתמש במהדק תג אוזן כדי לתקן תג אוזן. הניחו את תגי האוזן בחצי התחתון ובשליש האמצעי של האוזן, והקפידו להימנע מהאזור עם ריכוז הנימים הגבוה ביותר.
- בעדינות אך בבטחה לרסן את העכברים. אחזו בחוזקה בבסיס זנב העכבר. הניחו את העכברים על משטח שיאפשר להם לאחוז בהם.
- הניחו בעדינות אך בחוזקה את היד החופשית על הכתפיים, ואז תפסו במהירות את קשקוש הצוואר בין האגודל לאצבע. החזיקו את הזנב עם האצבע הקטנה.
- ספוג את הזנב עם אלכוהול. השתמש מספריים סטריליים כדי לחתוך את דגימת העור <5 מ"מ ולשים אותו במיכל דגימה נקי עם תווית. אין צורך להסיר את הפרווה של העכברים. דחסו את הזנב עם ספוגים סטריליים כדי להשיג המוסטאזיס.
- לאחר מכן, ליז את זנב מורין ולבצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי לזהות את הגנוטיפ.
הערה: לאחר חיתוך זנב מורין אחד, יש לנגב את פני השטח של המספריים עם כותנה אלכוהולית כדי למנוע זיהום הדדי של גנים בין זנבות מורין. לאחר הכנסתם לכלוב, יש להשגיח על העכברים במשך 5 דקות כדי לחפש סימני דימום באתר הפצע. עיין בטבלה 1 לקבלת רשימת הפריימרים והגדרות ה-PCR שבהן נעשה שימוש במחקר זה.
- עכברי TBP הנגרמים מטמוקסיפן
- שוקלים 0.3 גרם טמוקסיפן וממיסים אותו ב 15 מ"ל של שמן תירס על ידי אולטרסאונד (כוח = 20%, משך = 20 דקות, טמפרטורה = 4 ° C), בריכוז של 20 מ"ג / מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
הערה: טמוקסיפן רגיש לאור ויש למקם אותו במיכל חום. - בסביבות 8 שבועות, לשקול את העכברים עם מאזניים אלקטרוניים ולתת להם i.p. זריקה של טמוקסיפן במינון של 150 מ"ג / ק"ג, מנוהל פעמיים עם מרווח של שבוע.
- שוקלים 0.3 גרם טמוקסיפן וממיסים אותו ב 15 מ"ל של שמן תירס על ידי אולטרסאונד (כוח = 20%, משך = 20 דקות, טמפרטורה = 4 ° C), בריכוז של 20 מ"ג / מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
2. דיסקציה והדמיה של גידולי בלוטת התריס בעכבר וגידולים גרורתיים
- הכנה
- מכינים את כלי הדיסקציה: מספריים ומלקחיים סטריליים, להב סטרילי, בקבוק ספריי 75% אלכוהול, ישר 20 ס"מ, קליפרים ורנייר, מגבות נייר וכותנה אלכוהולית.
- פתרון תיקון רקמות עכבר: להכין 4% paraformaldehyde תמיסת תיקון רקמות.
- נקו צלחת בקוטר 10 ס"מ מלאה בכ-10 מ"ל מלח חוצץ פוספט סטרילי (PBS) לאחסון זמני של רקמות, ושטפו את הדם על פני הרקמה.
- מיצוי בלוטת התריס
- הרדימו את העכברים עם פחמן דו חמצני בקצב זרימה של 2.0 ליטר/דקה למשך 5 דקות. הוציאו את העכברים מהכלוב ובצעו פריקת צוואר הרחם.
- הניחו את העכבר על לוח הניתוח כאשר הצד הגחוני פונה כלפי מעלה והראש הרחק מהנסיין, וקיבעו את הגפיים על לוח הניתוח באמצעות מחטי מזרק סטריליות. להסרה נוחה יותר של רקמת בלוטת התריס, השתמש במחט מזרק סטרילית אחרת כדי לתקן את הראש.
- יש לחטא את הצוואר בשלושה סיבובים לסירוגין של פילינג כלורהקסידין או פובידון-יוד ולאחר מכן 75% אלכוהול. לאחר מכן, בצע חתך קטן מעל מרכז עצם הבריח עם מספריים סטריליים ומלקחיים.
- ממשיכים את קו האמצע של החתך עד לפה. מצא את בלוטת submandibular ולהסיר אותו כדי לחשוף את המיקום האנטומי של בלוטת התריס, אשר ממוקם ליד סחוס בלוטת התריס קנה הנשימה.
- מצא את בלוטת התריס, לנתח בזהירות את בלוטת התריס משאר אזור הצוואר עם מספריים סטריליים, ולאחר מכן לשים את בלוטת התריס הוסר בצלחת 10 ס"מ מלא 10 מ"ל של PBS סטרילי.
הערה: במהלך הסרת בלוטת התריס, היו עדינים ואיטיים והימנעו מחיתוך כלי הדם בצוואר. אם כלי הצוואר נחתכים, הצוואר יתמלא מיד בדם, ויש להסיר את הדם מיד עם ספוגי אלכוהול כדי לחשוף את המיקום האנטומי של בלוטת התריס. לפני הסרת רקמת בלוטת התריס, בזהירות לבחון את המאפיינים של האונות השמאלית והימנית של בלוטת התריס (גודל, צורה, וכו ') כדי למנוע חוסר יכולת להבחין בין האונות השמאלית והימנית של בלוטת התריס לאחר הסרה. - ב PBS סטרילי, להסיר את הדם מפני השטח של רקמת בלוטת התריס עם מספריים סטריליים לחתוך בזהירות את קנה הנשימה. לאחר מכן, לשים את רקמת בלוטת התריס על בד סטרילי, ולמדוד את גודל האונות השמאלית והימנית של בלוטת התריס עם קליפרים vernier.
- מחלקים את האונות השמאלית והימנית של בלוטת התריס לשני חלקים עם להב סטרילי. הכניסו חלק אחד לתוך 2 מ"ל של תמיסת 4% פרפורמלדהיד לקיבוע, והכניסו את החלק השני לחנקן נוזלי לשימור.
- מיצוי ריאות וכבד
- יש לחטא את הבטן בשלושה סבבים לסירוגין של פילינג כלורהקסידין או פובידון-יוד ו-75% אלכוהול. לאחר מכן, צבטו ממש מעל איבר המין של העכבר ועשו חתך קטן, חתכו לאורך קו האמצע של הבטן לעצם התת-קרקעית, וחשפו את חלל הבטן.
- מצא את הכבד בחלק העליון של הבטן בזהירות להסיר אותו. הכניסו את הכבד ל-PBS סטרילי.
- בזהירות לחתוך את הסרעפת לאורך הצלעות כדי לחשוף את חלל החזה. לאחר מכן, אחזו בעצם החזה ומשכו למעלה כדי להרחיב את החלל עוד יותר. מצא את הריאה והסר אותה. הכניסו את הריאה שהוסרה ל-PBS סטרילי.
- שימו לב באופן גס אם יש גרורות בריאה ובכבד. ספרו את מספר הגרורות וקחו רשומה דיגיטלית. לאחר מכן, השתמש להב סטרילי כדי לחלק את רקמות הריאה והכבד לשני חלקים. שים חלק אחד לתוך 3 מ"ל של 4% תמיסת paraformaldehyde לקיבוע וחלק אחר לתוך חנקן נוזלי לשימור.
- התייבשות רקמות
- הכניסו את הרקמות לקופסת ההתייבשות. הכניסו את קופסת ההתייבשות לסלסלה בהתייבשות אלכוהול הדרגתית כדלקמן: 70% אלכוהול למשך שעה; 80% אלכוהול במשך 1 שעות; 95% אלכוהול במשך 30 דקות; 95% אלכוהול במשך 30 דקות; אתנול נטול מים I במשך 30 דקות; אתנול נטול מים II במשך 30 דקות; קסילן I במשך 20 דקות; קסילן II למשך 20 דקות; שעוות פרפין I במשך 30 דקות; שעוות פרפין II במשך 1 שעות; שעוות פרפין III למשך 30 דקות.
- הטמע את הרקמות ספוגות השעווה במכונת ההטבעה.
- הכניסו תחילה את השעווה המומסת למסגרת ההטבעה. לפני שהשעווה מתמצקת, הסר את הרקמה מקופסת ההתייבשות והכנס אותה למסגרת ההטבעה, ולאחר מכן צרף את התווית.
- מניחים לשעווה להתקרר בטמפרטורה של -20°C על שולחן ההקפאה. לאחר שהשעווה מתמצקת, מסירים את גוש השעווה ממסגרת ההטבעה וקוצצים אותו.
- מניחים את גוש השעווה הגזוז על פרוסת פרפין, בעובי של 5 מיקרומטר ובגודל של 2X2 ס"מ. לאחר החיתוך, לאפשר את החלקים לצוף על מפזר עם מים חמים ב 45 ° C כדי לשטח את הרקמה. להרים את הטישו עם שקופית, ואופים את הפרוסות בתנור ב 65 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות.
- לאחר שהמים מתייבשים והשעווה נמסה, הסירו את המגלשה עם הרקמה והשתמשו בה לצביעת המטוקסילין ואאוזין (HE) ואימונוהיסטוכימיקל (IHC)16. יש לוודא שהקטעים צמודים לשקופיות לצורך צביעה.
3. הכתמת הגידול הראשוני והריאה
- דיואקסינג
- שים את השקופיות עם המקטעים בקסילן למשך 10 דקות.
- יש לעבור לאלכוהול נטול מים (100%) (שני בקבוקים) למשך כ-3 דקות כל אחד.
- מעבירים ל-95% אלכוהול (שני בקבוקים) למשך כ-3 דקות כל אחד.
- עברו ל-80% אלכוהול למשך כ-3 דקות.
- עברו ל-50% אלכוהול למשך כ-3 דקות.
- מעבירים למי הברז ושוטפים את האלכוהול למשך כדקה.
- צביעה
- העבירו את המגלשות להמטוקסילין למשך 8 דקות.
- העבר את המגלשות למים למשך דקה אחת כדי לשטוף את המטוקסילין; הרקמה משתנה מכחול לאדום.
- העבירו את המגלשות ל-1% חומצה הידרוכלורית למשך כ-30 שניות.
- מעבירים את המגלשות למים, שוטפים במשך 5 דקות.
- העבר את המגלשות לתוך eosin במשך 90 שניות, ולאחר מכן לשטוף אותם עם מים במשך 5 דקות.
- העבירו את המגלשות ל-50% אלכוהול, 80% אלכוהול, 95% אלכוהול (שני בקבוקים) ואלכוהול נטול מים (100%) (שני בקבוקים), למשך דקה אחת כל אחד.
- העבירו את המגלשות לקסילן למשך 5 דקות.
- לאחר שהשקופיות יבשות, אטמו אותן בשרף ניטרלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
גרמנו ל-mATC לחקור את גדילת הגידול, זמן הישרדות עכברים ומאפיינים פתולוגיים. לאחר הזירוז, העכברים הוקרבו מיד, ודגימות (בלוטת התריס, הריאות והכבד) נאספו לאחר שנמצא אחד מהמצבים הבאים: 1) מצוקה נשימתית הנגרמת כתוצאה מדחיסת הגידול; 2) ירידה בתיאבון וקולות חריגים; 3) עייפות יוצאת דופן; ו-4) ירידה במשקל הגוף של מעל 20%. במהלך תהליך הדגימה מצאנו שכל העכברים (12/12) יצרו בהצלחה גידולים לאחר הזירוז. רשמנו את זמן ההישרדות של העכבר, תכונות / גודל הגידול ונגעים גרורתיים.
באופן גס, ראינו את הדברים הבאים: 1) הגידולים היו רכים, וגודל הגידולים בצד שמאל וימין לא היה עקבי; 2) לרוב העכברים (11/12) היו גרורות ריאה, אך לאף אחד מהם לא היו גרורות בכבד. באופן ספציפי, גודל הגידול נוטר על ידי אולטרסאונד בתדר גבוה של בעלי חיים ומערכות הדמיה פוטואקוסטית (Vevo®3100) לאורך כל התהליך17. בהתבסס על נתוני האולטרסאונד, עקומת גדילת הגידול (איור 1A) תוכננה כדי לצפות בשינוי הדינמי של גודל הגידול. יתר על כן, הגידולים גדלו לאט בשלב מוקדם (גודל הגידול הממוצע השתנה בין 9.47 מ"מ 2 ל 11.75 מ"מ 2 מיום 0 ליום 60), והפכו מהירים באופן דרמטי בשלב מאוחר (גודל הגידול הממוצע השתנה מ 11.75 מ"מ 2 ל 23.95 מ"מ 2 (מיום 60 ליום 100). רוב העכברים הוקרבו בשלב מאוחר. בקיצור, mATC עם תקופת חביון מסוימת של הגידול צריך להיות במעקב צמוד לאחר 60 יום כדי למנוע מוות הקשור לחנק.
מצד שני, זמן ההישרדות של העכברים תועד ועקומת הישרדות (איור 1B). ההישרדות החציונית של mATC הייתה 130 ימים, בין 56-166 ימים. נוסף על כך, גרורות ריאתיות נמצאו ברוב ה-mATC (כ-92%) (איור 1C). ראינו שרק עכבר אחד בקבוצה זו לא הראה גרורות ריאה בבדיקה גסה, ולשישה עכברים היה יותר מנגע גרורתי ריאתי אחד. לא נמצאו גרורות בכבד. בקצרה, תוצאות אלה היו עקביות עם ההתנהגות הביולוגית של ATC, אשר נוטים גרורות ריאות במרפאות.
יתר על כן, כדי לבחון טוב יותר את התהליך הדינמי של mATC, הקרבנו את העכברים בשתי נקודות זמן (חודש וחודשיים לאחר הזירוז). ביצענו צביעת HE על גידולים ראשוניים ורקמות ריאה גרורתיות של mATC (איור 1D). ברקמה המושרה של חודש אחד, ראינו תכונות מוצקות חלקיות ודו-קיום של מבנים פוליקולריים ותאים ממאירים. המבנים הפוליקולריים של בלוטת התריס נעלמו, והגידול התמצק לחלוטין לאחר זירוז של חודשיים. צביעת הגידול הראשוני גילתה כי תאי הגידול היו מגוונים מורפולוגית, עם תאי ענק פלאומורפיים (מסומנים על ידי חץ אדום) ותאים בצורת ציר (מסומנים על ידי חץ צהוב). הוא גם הראה מגוון רחב של גודל גרעיני, ותאים רבים הכילו גרעינים מרובים. מוקדים גרורתיים ברורים (מסומנים בעיגול) נראו בריאה. צביעת רקמות ריאה גרורתיות הראתה כי רקמת הריאה הרגילה היא מבנה רשתית עם מבנים מכתשית ברורים וחללי אוויר. עם זאת, גרורות ריאה הראו אובדן של מבנה הרשתית התקין, עיבוי חלל האוויר ופרנכימה של הריאות.
בינתיים, צביעת IHC בוצעה כדי להמשיך ולאפיין (Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 ו-Caspase-3) גידולי mATC כדי לכמת התפשטות תאים ואפופטוזיס, ולחקור את החדירה של לימפוציטים, תאי T-רגילים (Treg) ותאים מיאלואידים (איור 2A-D). צביעה נגד Ki67 הייתה חיובית מאוד, בין 86.9% ל-95.07%, מה שמעיד על רמה גבוהה של התפשטות תאים. נוגדן קספאז-3 אנטי-פעיל שימש לבדיקת שיעור אפופטוזיס, שנע בין 5.2% ל-51.9%. באופן ספציפי, mATC הציג חדירה ברורה של תאי CD8+ T, שהיחס ביניהם נע בין 0.47% ל -10.55% (ממוצע: 5.93%). זה הצביע על כך ש-mATC לא היה גידול מדברי חיסוני, מה שעלה בקנה אחד עם דגימות ATC. מלבד זאת, צביעת Foxp3 הגדירה תאי Treg, שנעו בין 0.45% ל-25.8%. בנוסף ללימפוציטים, F4/80 ו- Cd206 שימשו להגדרת מקרופאגים ומקרופאגים M2, בהתאמה. מצאנו כי תאים מיאלואידים חדרו באופן נרחב לגידולים (שיעור תאים חיוביים F4/80 מ-86.6% ל-94.6%; Cd206 שיעור תאים חיוביים מ 40.4% ל 67.7%), אשר היה עקבי עם הספרות הקודמת16. בקצרה, מצאנו תאים סרטניים בעלי שגשוג רב, חדירת לימפוציטים והסננה נרחבת של תאים מיאלואידים ב-mATC, מה שעלה בקנה אחד עם דגימות קליניות.
לסיכום, דגימות mATC הראו הומוגניות בדינמיקה של הגידול, גרורות ומאפיינים פתולוגיים, בהתאם לדגימות הקליניות. בהתחשב בקצב היווצרות הגידול, mATC היה מודל מורין אמין.
איור 1: דינמיקה של גידולים ומאפיינים פתולוגיים. (A) עקומת גדילה של עכברים (n = 5). כל שורה מייצגת עכבר: השלב המוקדם נע בין יום 0 ליום 60, והשלב המאוחר נע בין יום 60 ליום 100. (B) עקומות הישרדות של עכברים (n = 12). ההישרדות החציונית של mATC הייתה 130 ימים, שנעו בין 56 ימים ל-166 ימים. (C) עקומות גרורות ריאה של עכברים (n = 12). תמונות דיסקציה מייצגות של גרורות בלוטת התריס והריאות. החץ האדום מציין את הגידול בבלוטת התריס, והעיגול הלבן מציין גרורות בריאה. (D) צביעת הגידול הראשוני (חודש וחודשיים לאחר הזירוז) וגרורות ריאתיות. החץ האדום מציין את תא הענק הפליאומורפי, החץ הצהוב מציין את התא בצורת ציר, והאזור המעוגל מציין גרורות בריאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תיאור קצר של חדירת תאי מערכת החיסון ב-mATC. (A) צביעה אימונוהיסטוכימית של גידולים ראשוניים ATC murine עם נוגדנים (Cd8, Foxp3). החץ האדום מציין תא חיובי CD8, החץ הצהוב מציין תא חיובי Foxp3. (B) צביעה אימונוהיסטוכימית של גידולים ראשוניים ATC murine עם נוגדנים (Ki67, Caspase-3). (C) צביעה אימונוהיסטוכימית של גידולים ראשוניים מסוג ATC murine עם נוגדנים (F4/80, Cd206). (ד) כימות IHC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: רשימת הפריימרים והגדרות ה-PCR ששימשו במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול לדיסקציה של גידול בבלוטת התריס
במהלך דיסקציה, המיקום האנטומי של בלוטת התריס צריך להיות מובן כראוי. בלוטת התריס היא בלוטה בצורת פרפר הממוקמת בצד הגבי של הבלוטה התת-לסתית ליד סחוס בלוטת התריס וקנה הנשימה. במהלך ההליך נמנעה בזהירות קטיעת עורקי הדם משני צידי הצוואר.
שינוי ופתרון בעיות של גזע mATC
ATC היא ממאירות נדירה ואגרסיבית ביותר. למאפיינים הקליניים של חולי mATC ו- ATC יש קווי דמיון מסוימים. באופן ספציפי, סיבת המוות העיקרית ב- mATC היא חנק, אשר עולה בקנה אחד עם חולי ATC. לכן, במהלך הניסוי, יש לציין את הדברים הבאים: 1) לתפוס בעדינות את העכברים ולשים לב לנשימה שלהם במהלך הניתוח; 2) לעקוב מקרוב בשלב מאוחר כדי למנוע מוות פתאומי ואי קבלת דגימות בזמן; 3) רקמות בלוטת התריס והריאה מושפעות בקלות מהדם על פני השטח של הרקמות לצורך תצפית וצילום, כך שניתן להקטין את נפח הדם של עכברים על ידי שאיבת גלגל העין.
מגבלות השימוש ב-mATC
ההתרחשות וההתפתחות של ATC אנושי היא מורכבת וניתנת לשינוי, אך הרקע הגנטי של mATC הוא פשוט יחסית, שיכול לדמות רק חלק מה-ATC האנושי. לדוגמה, חלק מרקמות ATC הכילו מוטציות TERT ו-BRAF, מספר העתק NOTCH2NL גרסה 18, במקום מוטציות P53, שעשויות להיות בעלות מנגנוני גידולים שונים ומאפיינים פתולוגיים קלינייםשונים 7,19,20. בנוסף, ATC בדרך כלל יש קורס זמן רב לפני האבחון, אבל mATC מקבל אבחנה לאחר זירוז של 2 חודשים. לכן, ישנן הבחנות מובנות בין mATC לבין סרטן בלוטת התריס האנושי, מודלים של בעלי חיים אינם יכולים לחקות באופן מלא את כל המאפיינים של סרטן בלוטת התריס האנושי, וטיפולים רבים המוגבלים לבני אדם אינם ניתנים להערכה על mATC. יתר על כן, למרות שניתן להשתמש ב- mATC כדי לחקור את ההשפעות הטיפוליות של תרופות שונות במולקולות קטנות, מספר תרופות ביולוגיות (למשל, נוגדנים או תרופות הקשורות לנוגדנים) צריכות להיות מתוכננות במיוחד עבור עכברים. בנוסף, כל התהליך של בניית עכברי נוקאאוט מותנים ולאחר מכן השגת גנוטיפ המטרה של עכברים על ידי הכלאה לוקח זמן רב ודורש תנאי תרבית עכברים מסוימים ועלויות21,22.
משמעות השימוש ב-mATC בחקר סרטן בלוטת התריס
ההטרוגניות של האוכלוסייה האנושית והנדירות של ATC אנושי מעכבים את חקירת המנגנונים הפוטנציאליים והאפשרויות הטיפוליות עבור ATC. כמודל עכבר אמין, mATC מקל על איסוף רקמות ATC ומעשיר את מאגר דגימות רקמות ה- ATC. mATC יכול לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות של תפקודי גנים ספציפיים על ATC, לחקור את המנגנונים התאיים והמולקולריים של התפתחות ATC, להבין את המנגנונים של התקדמות גידולי בלוטת התריס ועמידות לתרופות, ובסופו של דבר לשפר את הפרוגנוזה של חולי ATC16.
יישומים עתידיים של mATC
mATC יכול לשמש למחקר על היבטים שונים של הקרנות, כימותרפיה, ריפוי גנטי, אימונותרפיה וטיפול ממוקד. mATC יכול לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות הטיפוליות ואת ההשפעות השליליות של משטרים, כגון שילובים בין תרופות שונות או עם הקרנות. לאחר מכן השתמשנו ב-mATC כדי לחקור את ההשפעות הטיפוליות של רדיותרפיה בשילוב עם אימונותרפיה ותרופות מעכבות מולקולות קטנות על ATC. בנוסף, mATC יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של שיטות משלוח שונות או מסלולים על ההשפעות האנטי סרטניות של תרופות לפתח מערכות אספקת תרופות עם פעילות אנטי סרטנית מוגברת. ביישומים קליניים עתידיים, אנו מקווים למזער את שיעור ההישנות והתמותה של חולי סרטן בלוטת התריס ובכך לשפר את שיעור ההישרדות של החולים.
אנו צופים כי מודלים נוספים של ATC murine יפותחו בעתיד, כמו גם ניתוחים מעמיקים יותר של ATC ברקע גנטי שונה, כגון PTEN ו-P13K23. אלה יחשפו באופן מקיף יותר את המנגנון המולקולרי של גידולי ATC והתקדמותם, ינבאו את תוצאות הטיפול ב- ATC, ויוכלו לספק לחולים מטרות טיפוליות פוטנציאליות 24,25,26,27,28. אנו מקווים שבאמצעות חקירה ניסיונית יותר, נוכל לשפר את שיטת המידול של מודל העכבר ולקצר את זמן המידול כדי לתרום יותר למחקר בסיסי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית הלאומית לפיתוח מחקר מפתח של סין (2021YFA1301203); הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); פרויקט הדגירה של המחקר הקליני, בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן (22HXFH019); פרויקט שיתוף הפעולה הבינלאומי של לשכת המדע והטכנולוגיה העירונית של צ'נגדו (2020-GH02-00017-HZ); הקרן למדעי הטבע של סצ'ואן, 2022NSFSC1314; "פרויקט 1.3.5 לדיסציפלינות של מצוינות, בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן" (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); ותוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן (2023YFS0098).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
| 50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
| CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
| Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
| Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
| Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
| Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Parenti, R., Salvatorelli, L., Magro, G. Anaplastic thyroid carcinoma: Current treatments and potential new therapeutic options with emphasis on TfR1/CD71. International Journal of Endocrinology. 2014, 685396 (2014).
- Baldini, E., et al. In vitro and in vivo effects of the urokinase plasminogen activator inhibitor WX-340 on anaplastic thyroid cancer cell lines. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 3724 (2022).
- Haugen, B. R. American Thyroid Association Management guidelines for adult patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer: what is new and what has changed. Cancer. 123 (3), 372-381 (2015).
- O'Neill, J. P., Shaha, A. R.
- Simoes-Pereira, J., Capitao, R., Limbert, E., Leite, V. Anaplastic thyroid cancer: Clinical picture of the last two decades at a single oncology referral centre and novel therapeutic options. Cancers. 11 (8), 1188 (2019).
- Fagin, J. A., Wells, S. A. Biologic and clinical perspectives on thyroid cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (11), 1054-1067 (2016).
- Neff, R. L., Farrar, W. B., Kloos, R. T., Burman, K. D.
- Lareau, C. A., et al. Droplet-based combinatorial indexing for massive-scale single-cell chromatin accessibility. Nature Biotechnology. 37 (8), 916-924 (2019).
- Guo, H., et al. Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing. Genome Research. 23 (12), 2126-2135 (2013).
- Mooijman, D., Dey, S. S., Boisset, J. -C., Crosetto, N., van Oudenaarden, A. Single-cell 5hmC sequencing reveals chromosome-wide cell-to-cell variability and enables lineage reconstruction. Nature Biotechnology. 34 (8), 852-856 (2016).
- Smallridge, R. C., Marlow, L. A., Copland, J. A. Anaplastic thyroid cancer: molecular pathogenesis and emerging therapies. Endocrine-Related Cancer. 16 (1), 17-44 (2009).
- Charles, R. -P. Overview of genetically engineered mouse models of papillary and anaplastic thyroid cancers: enabling translational biology for patient care improvement. Current Protocols in Pharmacology. 69, 1-14 (2015).
- Tuttle, R. M., Haugen, B., Perrier, N. D. Updated American joint committee on cancer/tumor-nodemetastasis staging system for differentiated and anaplastic thyroid cancer (8th Edition): What changed and why. Thyroid. 27 (6), 751-756 (2017).
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Protocols of the National Academy of Sciences. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Gunda, V., et al. Combinations of BRAF inhibitor and anti-PD-1/PD-L1 antibody improve survival and tumour immunity in an immunocompetent model of orthotopic murine anaplastic thyroid cancer. British Journal of Cancer. 119 (10), 1223-1232 (2018).
- He, Y., et al. High-resolution ultrasonography for the analysis of orthotopic ATC tumors in a genetically engineered mouse model. Journal of Visualized Experiments. (188), e64615 (2022).
- Zhang, L., et al. Novel recurrent altered genes in Chinese patients with anaplastic thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (4), 988-998 (2021).
- Luo, H., et al. Pan-cancer single-cell analysis reveals the heterogeneity and plasticity of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Nature Communications. 13 (1), 6619 (2022).
- Luo, H., et al. Characterizing dedifferentiation of thyroid cancer by integrated analysis. Science Advances. 7 (31), (2021).
- Knostman, K. A. B., Jhiang, S. M., Capen, C. C. Genetic alterations in thyroid cancer: the role of mouse models. Veterinary Pathology. 44 (1), 1-14 (2007).
- Kim, C. S., Zhu, X. Lessons from mouse models of thyroid cancer. Thyroid. 19 (12), 1317-1331 (2009).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Cabanillas, M. E., Ryder, M., Jimenez, C. Targeted therapy for advanced thyroid cancer: kinase inhibitors and beyond. Endocrine Reviews. 40 (6), 1573-1604 (2019).
- Ljubas, J., Ovesen, T., Rusan, M. A systematic review of phase II targeted therapy clinical trials in anaplastic thyroid cancer. Cancers. 11 (7), 943 (2019).
- Huang, N. -S., et al. An update of the appropriate treatment strategies in anaplastic thyroid cancer: a population-based study of 735 patients. International Journal of Endocrinology. 2019, 8428547 (2019).
- Subbiah, V., et al. Dabrafenib and trametinib treatment in patients with locally advanced or metastatic BRAF V600-mutant anaplastic thyroid cancer. Journal of Clinical Oncology. 36 (1), 7-13 (2018).
- Baldini, E., et al. Effects of selective inhibitors of Aurora kinases on anaplastic thyroid carcinoma cell lines. Endocrine-Related Cancer. 21 (5), 797-811 (2014).
