Summary
Hier stellen wir eine Standard-Pipeline vor, um murine ATC-Tumore durch spontane gentechnisch veränderte Mausmodelle zu erhalten. Des Weiteren präsentieren wir die Tumordynamik und pathologische Informationen über die primären und metastasierten Läsionen. Dieses Modell wird den Forschern helfen, die Tumorentstehung zu verstehen und die Entdeckung von Medikamenten zu erleichtern.
Abstract
Das anaplastische Schilddrüsenkarzinom (ATC) ist eine seltene, aber tödliche bösartige Erkrankung mit einer düsteren Prognose. Es besteht ein dringender Bedarf an tiefergehender Forschung zur Karzinogenese und Entwicklung von ATC sowie zu therapeutischen Methoden, da die Standardbehandlungen bei ATC-Patienten im Wesentlichen erschöpft sind. Die geringe Prävalenz hat jedoch gründliche klinische Studien und die Entnahme von Gewebeproben behindert, so dass bei der Entwicklung wirksamer Behandlungen nur geringe Fortschritte erzielt wurden. Mit Hilfe der Gentechnik haben wir ein bedingt induzierbares ATC-Mausmodell (mATC) in einem C57BL/6-Hintergrund erstellt. Das ATC-Mausmodell wurde mittels TPO-cre/ERT2 genotypisiert; BrafCA/wt; Trp53 ex2-10/ex2-10 und durch intraperitoneale Injektion mit Tamoxifen induziert. Mit dem Mausmodell untersuchten wir die Tumordynamik (die Tumorgröße reichte von 12,4 mm2 bis 32,5mm2 nach 4 Monaten Induktion), das Überleben (die mediane Überlebenszeit betrug 130 Tage) und die Metastasierung (Lungenmetastasen traten bei 91,6% der Mäuse auf) und pathologische Merkmale (charakterisiert durch immunhistochemische Färbung von Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 und Caspase-3). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das spontane mATC eine sehr ähnliche Tumordynamik und immunologische Mikroumgebung wie humane ATC-Tumore aufweist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das mATC-Modell mit hoher Ähnlichkeit in pathophysiologischen Merkmalen und einheitlichen Genotypen den Mangel an klinischem ATC-Gewebe und Probenheterogenität bis zu einem gewissen Grad auflöste. Daher würde es den Mechanismus und die translationalen Studien von ATC erleichtern und einen Ansatz zur Untersuchung des Behandlungspotenzials von niedermolekularen Medikamenten und Immuntherapeutika für ATC bieten.
Introduction
Schilddrüsenkrebs ist eine der häufigsten endokrinen Malignome1 und hat seinen Ursprung im Schilddrüsenepithel. In den letzten Jahren hat die Inzidenz von Schilddrüsenkrebs weltweit rapide zugenommen2. Schilddrüsenkrebs kann je nach Grad der Differenzierung der Tumorzellen in verschiedene Typen unterteilt werden. Auf der Grundlage des klinischen Verhaltens und der Histologie werden Schilddrüsenkarzinome in gut differenzierte Karzinome unterteilt, darunter das papilläre Schilddrüsenkarzinom (PTC) und das follikuläre Schilddrüsenkarzinom (FTC), das schlecht differenzierte Karzinom (PDTC) und das undifferenzierte oder anaplastische Karzinom der Schilddrüse (ATC)3. Im Gegensatz zur PTC, die eine häufige Form mit mildem Verhalten und besserer Prognose ist 4,ist die ATC eine seltene und hochaggressive bösartige Erkrankung, die 2 % bis 3 % aller Schilddrüsentumoren ausmacht5. Obwohl ATC selten ist, ist es für etwa 50 % der Todesfälle im Zusammenhang mit Schilddrüsenkrebs verantwortlich, mit einer düsteren Überlebensrate (6-8 Monate)6,7. Über 50 % der ATC-Fälle werden als Lungenmetastasen diagnostiziert8. Zusätzlich zu der aggressiven Natur der ATC wurde in der Klinik eine begrenzt wirksame Behandlung entwickelt. Daher haben ATC-Patienten eine düstere Prognose 9,10,11. Dies deutet darauf hin, dass weitere eingehende Studien zu den molekularen Mechanismen, die der Entwicklung von ATC und der Behandlung zugrunde liegen, dringend erforderlich sind.
Die Tumorgenese der ATC ist ein dynamischer dedifferenzierter Prozess. Die Schwierigkeit, menschliche Tumorproben in jedem Stadium klinischer Studien zu entnehmen, hat das Verständnis des Entstehungsmechanismus von gut differenzierten zu undifferenzierten Karzinomen erschwert. Im Gegensatz dazu begünstigt die Verwendung von murinen ATC-Modellen (mATC) die Entnahme von mATC-Proben im gesamten Tumorentstehungsverlauf. Daher können wir die Mechanismen der Tumorentstehung besser verstehen, indem wir den dynamischen dedifferenzierten Prozess analysieren. Darüber hinaus hat auch die Heterogenität der klinischen ATC-Proben dazu beigetragen, dass es schwierig ist, den molekularen Mechanismus zu verstehen. Nichtsdestotrotz hatten die Mäuse den gleichen genetischen Hintergrund und wurden in ähnlichen Lebensumgebungen gehalten, um die Konsistenz jedes Tumors zu gewährleisten. Dies erleichtert die Untersuchung der verallgemeinerten Rolle der ATC-Entwicklung12,13,14. Darüber hinaus ist mATC ein In-situ-Tumormodell, das den Einfluss der anatomischen Lokalisation und der gewebespezifischen Mikroumgebung wiederherstellen kann. Im Vergleich zu häufig verwendeten immundefizienten Mäusen ist mATC ein spontanes Mausmodell mit einem intakten Immunsystem und einer immunen Mikroumgebung.
Daher haben wir mit dem Stamm C57BL/6 eine bedingt induzierte mATC konstruiert, die in der Lage ist, die pathologischen Merkmale eines dedifferenzierten Schilddrüsenkarzinoms zu reproduzieren. Basierend auf diesem Modell gaben wir einen kurzen Überblick über die molekularen Grundlagen, Konstruktionsideen, pathologischen Eigenschaften und Anwendungen von mATC. Darüber hinaus beobachteten und berichteten wir über Tumorwachstum, Überlebenszeit, Metastasierung und pathologische Merkmale von mATC. Wir glauben, dass dies ein informatischer Überblick sein wird, um anderen Forschern zu helfen, dieses Modell einfacher zu verwenden.
Wir konstruierten ein bedingt induzierbares mATC-Modell, wie zuerst von McFadden15 beschrieben; Zunächst konstruierten wir Mäuse: TPO-cre/ERT2, Braf flox/wt und Trp53flox/wt. Konkret enthielten TPO-cre/ERT2-Mäuse den humanen Schilddrüsenperoxidase (TPO)-Promotor (ein schilddrüsenspezifischer Promotor), der die Expression eines cre-ERT2-Fusionsgens (eine cre-Rekombinase, die mit einer humanen Östrogenrezeptor-Liganden-Bindungsdomäne fusioniert) antreibt. Cre-ERT2 ist in der Regel auf das Zytoplasma beschränkt und dringt nur dann in den Zellkern ein, wenn es Tamoxifen ausgesetzt wird, das cre dazu veranlasst, rekombinante Enzymaktivität auszuüben. Wenn die Mäuse mit Mäusen gekreuzt werden, die loxP-flankierte Sequenzen tragen, werden nach der Tamoxifen-Induktion durch cre-vermittelte Rekombination die gefloxten Sequenzen in den Schilddrüsenzellen gelöscht, um den Zweck zu erreichen, bestimmte Gene auszuschalten oder einzuschalten.
Darüber hinaus sind Braf flox/wt-Mäuse ein Knock-in-Allel des menschlichen Braf, das auf dem cre-loxP-System basiert. Das murineBraf-Flox/wt-Transkript wird von endogenen Exons 1-14 und loxP-flankierten humanen Exons 15-18 kodiert. Nach der cre-vermittelten Exzision der gefloxten Regionen werden das mutierte Exon 15 (modifiziert mit einer V600E-Aminosäuresubstitution, die mit konstitutiv aktivem BrafV600E in humanen Karzinomen verknüpft ist) und die endogenen Exons 16-18 zur Generierung der Transkripte verwendet. Darüber hinaus sind Trp53 flox/wt Mäuse Knockout-Allele von humanem Trp53 und haben loxP-Stellen, die die Exons 2-10 von Trp53 flankieren. Bei der Kreuzung mit Mäusen mit einer cre-Rekombinase wird durch die cre-vermittelte Rekombination die gefloxte Sequenz gelöscht, um Trp53 auszuschalten. Anschließend wurden TPO-cre/ERT2-, Braf flox/w- und Trp53flox/wt-Mäuse gekreuzt, um TB zu erhalten (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt) Mäuse und TBP (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt; Trp53flox/wt) Mäuse, die zur Erzeugung von PTC und ATC verwendet werden könnten. Nach ca. 8 Wochen wurden die Mäuse durch eine intraperitoneale (i.p.) Verabreichung von 150 mg/kg Tamoxifen, gelöst in Maisöl, für zwei Verabreichungen induziert. Das Tumorwachstum konnte mittels Hochfrequenz-Ultraschall überwacht werden (der erste Zeitpunkt der Sonographie wurde als Tag 0 aufgezeichnet). Die erste Sonographie wurde 40 Tage nach der Einführung von Tamoxifen durchgeführt.
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Protocol
Die hier beschriebenen tierexperimentellen Eingriffe wurden mit Genehmigung der Tierethikkommission des West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan, China durchgeführt.
1. Induktion von TBP-Mäusen
- Identifizierung des Genotyps von Mäusen
- Trennen Sie nach etwa 3 Wochen die weiblichen Mäuse von den männlichen Mäusen. Verwenden Sie gleichzeitig die Ohrmarkenklemme, um eine Ohrmarke zu befestigen. Platzieren Sie die Ohrmarken in der unteren Hälfte und im mittleren Drittel des Ohrs und achten Sie darauf, den Bereich mit der höchsten Kapillarkonzentration zu vermeiden.
- Halten Sie die Mäuse vorsichtig, aber sicher zurück. Fassen Sie fest an der Basis des Mausschwanzes. Legen Sie die Mäuse auf eine Oberfläche, auf der sie greifen können.
- Legen Sie die freie Hand sanft, aber bestimmt auf die Schultern und fassen Sie dann schnell das Genick zwischen Daumen und Zeigefinger. Halte den Schwanz mit dem kleinen Finger fest.
- Tupfen Sie den Schwanz mit Alkohol ab. Schneiden Sie die Hautprobe mit einer sterilen Schere <5 mm ab und geben Sie sie in einen sauberen Probenbehälter mit Etikett. Es ist nicht notwendig, das Fell der Mäuse zu entfernen. Komprimieren Sie den Schwanz mit sterilen Schwämmen, um eine Hämostase zu erreichen.
- Als nächstes wird der Mausschwanz lysiert und eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt, um den Genotyp zu identifizieren.
HINWEIS: Nach dem Schneiden eines Mausschwanzes muss die Oberfläche der Schere mit Alkoholbaumwolle abgewischt werden, um eine gegenseitige Kontamination der Gene zwischen den Mäuseschwänzen zu vermeiden. Nachdem sie in ihren Käfig gesetzt wurden, müssen die Mäuse 5 Minuten lang beobachtet werden, um nach Anzeichen von Blutungen an der Wundstelle zu suchen. In Tabelle 1 finden Sie eine Liste der Primer und die in dieser Studie verwendeten PCR-Einstellungen.
- Tamoxifen-induzierte TBP-Mäuse
- Wiegen Sie 0,3 g Tamoxifen ab und lösen Sie es in 15 ml Maisöl durch Ultraschall (Leistung = 20%, Dauer = 20 min, Temperatur = 4 °C) in einer Konzentration von 20 mg/ml. Bei 4 °C lagern.
Anmerkungen: Tamoxifen ist lichtempfindlich und muss in einen braunen Behälter gegeben werden. - Nach etwa 8 Wochen werden die Mäuse mit einer elektronischen Waage gewogen und ihnen eine intravenöse Injektion von Tamoxifen in einer Dosis von 150 mg/kg verabreicht, die zweimal im Abstand von 1 Woche verabreicht wird.
- Wiegen Sie 0,3 g Tamoxifen ab und lösen Sie es in 15 ml Maisöl durch Ultraschall (Leistung = 20%, Dauer = 20 min, Temperatur = 4 °C) in einer Konzentration von 20 mg/ml. Bei 4 °C lagern.
2. Präparation und Bildgebung von Schilddrüsentumoren und metastasierenden Tumoren der Maus
- Präparat
- Bereiten Sie die Sezierwerkzeuge vor: sterile Schere und Pinzette, sterile Klinge, Sprühflasche mit 75 % Alkohol, 20 cm Lineal, Messschieber, Papiertücher und alkoholische Baumwolle.
- Fixierlösung für Mausgewebe: Bereiten Sie eine 4%ige Paraformaldehyd-Gewebefixierlösung vor.
- Reinigen Sie eine 10-cm-Schale, die mit etwa 10 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt ist, um das Gewebe vorübergehend aufzubewahren, und waschen Sie das Blut auf der Oberfläche des Gewebes.
- Schilddrüsenextraktion
- Euthanasieren Sie die Mäuse mit Kohlendioxid bei einer Durchflussrate von 2,0 l/min für 5 min. Nehmen Sie die Mäuse aus dem Käfig und führen Sie eine Zervixluxation durch.
- Legen Sie die Maus mit der Bauchseite nach oben und dem Kopf vom Experimentator weg auf das Sezierbrett und fixieren Sie die Gliedmaßen mit sterilen Spritzennadeln auf dem Sezierbrett. Für eine bequemere Entfernung von Schilddrüsengewebe verwenden Sie eine andere sterile Spritzennadel, um den Kopf zu fixieren.
- Desinfizieren Sie den Hals mit drei abwechselnden Runden eines Chlorhexidin- oder Povidon-Jod-Peelings, gefolgt von 75%igem Alkohol. Machen Sie dann mit einer sterilen Schere und Pinzette einen kleinen Schnitt über der Mitte des Schlüsselbeins.
- Setzen Sie den Schnitt in der Mittellinie bis zum Mund fort. Suchen Sie die Unterkieferdrüse und entfernen Sie sie, um die anatomische Lage der Schilddrüse freizulegen, die sich in der Nähe des Schildknorpels und der Luftröhre befindet.
- Suchen Sie die Schilddrüse, präparieren Sie die Schilddrüse vorsichtig mit einer sterilen Schere vom Rest der Halsregion und legen Sie dann die entfernte Schilddrüse in eine 10-cm-Schale, die mit 10 ml sterilem PBS gefüllt ist.
Anmerkungen: Seien Sie bei der Entfernung der Schilddrüse vorsichtig und langsam und vermeiden Sie es, die Blutgefäße des Halses zu durchtrennen. Wenn die Halsgefäße durchtrennt werden, wird der Hals sofort mit Blut gefüllt, und das Blut muss sofort mit Alkoholschwämmen entfernt werden, um die anatomische Lage der Schilddrüse freizulegen. Bevor Sie das Schilddrüsengewebe entfernen, beobachten Sie sorgfältig die Eigenschaften des linken und rechten Schilddrüsenlappens (Größe, Form usw.), um zu vermeiden, dass Sie nach der Entfernung nicht mehr zwischen dem linken und dem rechten Schilddrüsenlappen unterscheiden können. - Bei sterilem PBS wird das Blut mit einer sterilen Schere von der Oberfläche des Schilddrüsengewebes entfernt und die Luftröhre vorsichtig abgeschnitten. Legen Sie dann das Schilddrüsengewebe auf ein steriles Tuch und messen Sie die Größe des linken und rechten Schilddrüsenlappens mit Messschiebern.
- Teilen Sie den linken und rechten Schilddrüsenlappen mit einer sterilen Klinge in zwei Teile. Geben Sie einen Teil zur Fixierung in 2 ml 4%ige Paraformaldehydlösung und legen Sie den anderen Teil zur Konservierung in flüssigen Stickstoff.
- Extraktion von Lunge und Leber
- Desinfizieren Sie den Bauch mit drei abwechselnden Runden eines Chlorhexidin- oder Povidon-Jod-Peelings und 75%igem Alkohol. Kneifen Sie dann direkt über den Penis der Maus und machen Sie einen kleinen Schnitt, schneiden Sie entlang der Mittellinie des Bauches bis zum Schlüsselbeinknochen und legen Sie die Bauchhöhle frei.
- Suchen Sie die Leber im oberen Teil des Bauches und entfernen Sie sie vorsichtig. Legen Sie die Leber in steriles PBS.
- Schneiden Sie das Zwerchfell vorsichtig entlang der Rippen, um die Brusthöhle freizulegen. Fassen Sie als Nächstes das Brustbein und ziehen Sie es nach oben, um den Raum noch weiter zu erweitern. Finde die Lunge und entferne sie. Legen Sie die entfernte Lunge in steriles PBS.
- Beobachten Sie grob, ob Metastasen in Lunge und Leber vorhanden sind. Zählen Sie die Anzahl der Metastasen und machen Sie eine digitale Aufzeichnung. Verwenden Sie danach eine sterile Klinge, um das Lungen- und Lebergewebe in zwei Teile zu teilen. Geben Sie einen Teil zur Fixierung in 3 ml 4%ige Paraformaldehydlösung und einen anderen Teil zur Konservierung in flüssigen Stickstoff.
- Austrocknung des Gewebes
- Legen Sie die Taschentücher in die Dehydrierungsbox. Stellen Sie die Dehydrierungsbox bei der Gradientenalkoholdehydrierung wie folgt in den Korb: 70% Alkohol für 1 h; 80% Alkohol für 1 Stunde; 95% Alkohol für 30 Minuten; 95% Alkohol für 30 Minuten; wasserfreies Ethanol I für 30 min; wasserfreies Ethanol II für 30 min; Xylol I für 20 min; Xylol II für 20 min; Paraffinwachs I für 30 min; Paraffinwachs II für 1 h; Paraffinwachs III für 30 min.
- Betten Sie die wachsimprägnierten Tücher in die Einbettmaschine ein.
- Geben Sie zuerst das geschmolzene Wachs in den Einbettrahmen. Bevor sich das Wachs verfestigt, nehmen Sie das Tuch aus der Dörrbox und legen Sie es in den Einbettrahmen, dann bringen Sie das Etikett an.
- Das Wachs auf dem Gefriertisch bei -20 °C abkühlen lassen. Nachdem sich das Wachs verfestigt hat, entfernen Sie den Wachsblock vom Einbettrahmen und schneiden Sie ihn ab.
- Legen Sie den beschnittenen Wachsblock auf einen Paraffinhobel, der auf eine Dicke von 5 μm und eine Größe von 2 cm x 2 cm eingestellt ist. Lassen Sie die Schnitte nach dem Abteilen auf einem Spreizer mit 45 °C warmem Wasser schwimmen, um das Gewebe zu glätten. Das Tuch mit einer Folie aufnehmen und die Scheiben im Ofen bei 65 °C 2 h backen.
- Nachdem das Wasser getrocknet und das Wachs geschmolzen ist, entfernen Sie den Objektträger mit dem Gewebe und verwenden Sie ihn für die Hämatoxylin- und Eosin- (HE) und immunhistochemische (IHC)Färbung 16. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte zum Färben auf die Objektträger geklebt werden.
3. HE-Färbung des Primärtumors und der Lunge
- Entwachsen
- Legen Sie die Objektträger mit den Abschnitten für 10 Minuten in Xylol.
- In wasserfreien Alkohol (100%) (zwei Flaschen) für jeweils ca. 3 Minuten geben.
- In 95%igen Alkohol (zwei Flaschen) für jeweils ca. 3 Minuten wechseln.
- Für ca. 3 Minuten in 80%igen Alkohol einsteigen.
- Für ca. 3 Min. in 50%igen Alkohol einsteigen.
- In das Leitungswasser geben und den Alkohol ca. 1 Minute lang wegspülen.
- Färbung
- Schieben Sie die Objektträger für 8 Minuten in das Hämatoxylin.
- Bewegen Sie die Objektträger für 1 Minute ins Wasser, um das Hämatoxylin wegzuspülen. Das Gewebe verfärbt sich von blau nach rot.
- Schieben Sie die Objektträger für ca. 30 s in 1%igen Salzsäurealkohol.
- Schieben Sie die Objektträger ins Wasser und waschen Sie sie 5 Minuten lang.
- Legen Sie die Objektträger 90 s lang in Eosin und waschen Sie sie dann 5 Minuten lang mit Wasser.
- Schieben Sie die Objektträger für jeweils 1 Minute in 50 % Alkohol, 80 % Alkohol, 95 % Alkohol (zwei Flaschen) und wasserfreien Alkohol (100 %) (zwei Flaschen).
- Schieben Sie die Objektträger für 5 Minuten in Xylol.
- Nachdem die Objektträger getrocknet sind, versiegeln Sie sie mit neutralem Harz.
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Representative Results
Wir induzierten mATC, um das Tumorwachstum, die Überlebenszeit der Maus und pathologische Eigenschaften zu untersuchen. Nach der Induktion wurden die Mäuse sofort getötet und Proben (Schilddrüse, Lunge und Leber) entnommen, sobald eine der folgenden Erkrankungen festgestellt wurde: 1) Atemnot durch Tumorkompression; 2) verminderter Appetit und abnorme Lautäußerungen; 3) ungewöhnliche Lethargie; und 4) Körpergewichtsverlust von über 20%. Während des Probenahmeprozesses stellten wir fest, dass alle Mäuse (12/12) nach der Induktion erfolgreich Tumore bildeten. Wir zeichneten die Überlebenszeit der Maus, die Tumormerkmale/-größe und die metastasierten Läsionen auf.
Grob beobachteten wir Folgendes: 1) Die Tumore waren empfindlich und die Größe der Tumore auf der linken und rechten Seite war uneinheitlich; 2) Die meisten Mäuse (11/12) hatten Lungenmetastasen, aber keine hatte Lebermetastasen. Insbesondere wurde die Tumorgröße während des gesamten Prozesses durch tierische Hochfrequenz-Ultraschall- und photoakustische Bildgebungssysteme (Vevo®3100) überwacht17. Basierend auf den Ultraschalldaten wurde die Tumorwachstumskurve (Abbildung 1A) aufgetragen, um die dynamische Veränderung der Tumorgröße zu beobachten. Darüber hinaus wuchsen die Tumoren im Frühstadium langsam (die durchschnittliche Tumorgröße variierte von 9,47 mm2 bis 11,75 mm2 von Tag 0 bis Tag 60) und wurden im Spätstadium dramatisch schneller (die durchschnittliche Tumorgröße variierte von 11,75 mm2 bis 23,95mm2 (von Tag 60 bis Tag 100). Die meisten Mäuse wurden im Spätstadium geopfert. Kurz gesagt, mATC mit einer bestimmten Tumorlatenzzeit muss nach 60 Tagen engmaschig überwacht werden, um einen erstickungsbedingten Tod zu verhindern.
Zum anderen wurde die Überlebenszeit der Mäuse aufgezeichnet und eine Überlebenskurve (Abbildung 1B) aufgetragen. Die mediane Überlebenszeit von mATC betrug 130 Tage und lag zwischen 56 und 166 Tagen. Darüber hinaus wurden bei den meisten mATC Lungenmetastasen (ca. 92 %) festgestellt (Abbildung 1C). Wir beobachteten, dass nur eine Maus in dieser Kohorte bei grober Untersuchung keine Lungenmetastasen aufwies und sechs Mäuse mehr als eine Lungenmetastasierung aufwiesen. Es wurden keine Lebermetastasen gefunden. Kurz gesagt, diese Ergebnisse stimmten mit dem biologischen Verhalten von ATC überein, die in Kliniken anfällig für Lungenmetastasen sind.
Um den dynamischen Prozess von mATC besser beobachten zu können, haben wir die Mäuse zu zwei Zeitpunkten (1 Monat und 2 Monate nach Induktion) geopfert. Wir führten HE-Färbungen an den Primärtumoren und metastasierten Lungengeweben von mATC durch (Abbildung 1D). In 1 Monat induzierbarem Gewebe beobachteten wir unvollständige verfestigte Merkmale und die Koexistenz von follikulären Strukturen und malignen Zellen. Die follikulären Strukturen der Schilddrüse verschwanden und der Tumor verfestigte sich nach einer 2-monatigen Induktion vollständig. Die HE-Färbung des Primärtumors zeigte, dass die Tumorzellen morphologisch vielfältig waren, mit pleomorphen Riesenzellen (gekennzeichnet durch einen roten Pfeil) und spindelförmigen Zellen (gekennzeichnet durch einen gelben Pfeil). Es zeigte auch eine große Vielfalt an Kerngrößen, und viele Zellen enthielten mehrere Kerne. In der Lunge waren deutliche metastasierende Herde (durch einen Kreis gekennzeichnet) zu sehen. Die HE-Färbung von metastasiertem Lungengewebe zeigte, dass es sich bei dem normalen Lungengewebe um eine retikuläre Struktur mit klaren alveolären Strukturen und Lufträumen handelte. Nichtsdestotrotz zeigten die Lungenmetastasen einen Verlust der normalen retikulären Struktur, eine Verdickung der Lufthöhle und ein Lungenparenchym.
Währenddessen wurde eine IHC-Färbung durchgeführt, um mATC-Tumore weiter zu charakterisieren (Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 und Caspase-3), um die Zellproliferation und Apoptose zu quantifizieren und die Infiltration von Lymphozyten, T-regulären (Treg) Zellen und myeloiden Zellen zu untersuchen (Abbildung 2A-D). Die Anti-Ki67-Färbung war sehr positiv und reichte von 86,9 % bis 95,07 %, was einen hohen Grad an Zellproliferation zeigte. Antiaktivierte Caspase-3-Antikörper wurden verwendet, um die Apoptoserate zu testen, die zwischen 5,2 % und 51,9 % lag. Insbesondere zeigte mATC eine offensichtliche CD8+ T-Zell-Infiltration, deren Verhältnis zwischen 0,47 % und 10,55 % (Mittelwert: 5,93 %) lag. Dies deutete darauf hin, dass es sich bei mATC nicht um einen Immunwüstentumor handelte, was mit ATC-Proben übereinstimmte. Außerdem definierte die Foxp3-Färbung Treg-Zellen, die zwischen 0,45 % und 25,8 % variierten. Zusätzlich zu den Lymphozyten wurden F4/80 und Cd206 verwendet, um Makrophagen bzw. M2-Makrophagen zu definieren. Wir fanden heraus, dass myeloide Zellen extensiv Tumore infiltrierten (F4/80 positive Zellrate von 86,6% bis 94,6%; Cd206-positive Zellrate von 40,4 % auf 67,7 %), was mit der bisherigen Literatur übereinstimmte16. Kurz gesagt, wir fanden hochproliferative Tumorzellen, Lymphozyteninfiltration und ausgedehnte Infiltration myeloider Zellen in mATC, was mit klinischen Proben übereinstimmte.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die mATC-Proben eine Homogenität in Bezug auf Tumordynamik, Metastasierung und pathologische Merkmale zeigten, die mit den klinischen Proben übereinstimmte. Unter Berücksichtigung der Tumorbildungsrate war mATC ein zuverlässiges Mausmodell.
Abbildung 1: Tumordynamik und pathologische Charakteristika (A) Tumorwachstumskurve von Mäusen (n = 5). Jede Zeile stellt eine Maus dar: Die frühe Phase reicht von Tag 0 bis Tag 60 und die späte Phase von Tag 60 bis Tag 100. (B) Überlebenskurven von Mäusen (n = 12). Die mediane Überlebenszeit von mATC betrug 130 Tage, wobei die Spanne zwischen 56 und 166 Tagen lag. (C) Lungenmetastasenkurven von Mäusen (n = 12). Repräsentative Präparationsbilder von Schilddrüsen- und Lungenmetastasen. Der rote Pfeil steht für den Schilddrüsentumor und der weiße Kreis für Metastasen in der Lunge. (D) HE-Färbung des Primärtumors (1 Monat und 2 Monate nach Induktion) und Lungenmetastasierung. Der rote Pfeil steht für die pleomorphe Riesenzelle, der gelbe Pfeil für die spindelförmige Zelle und der eingekreiste Bereich für eine Metastase in der Lunge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Kurzbeschreibung der Immunzellinfiltration in mATC. (A) Immunhistochemische Färbung von ATC-murinen Primärtumoren mit Antikörpern (Cd8, Foxp3). Der rote Pfeil steht für eine CD8-positive Zelle, der gelbe Pfeil für eine Foxp3-positive Zelle. (B) Immunhistochemische Färbung von ATC-murinen Primärtumoren mit Antikörpern (Ki67, Caspase-3). (C) Immunhistochemische Färbung von murinen ATC-Primärtumoren mit Antikörpern (F4/80, Cd206). (D) Die Quantifizierung der IHC. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Die Liste der Primer und die in dieser Studie verwendeten PCR-Einstellungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls für die Dissektion von Schilddrüsentumoren
Während der Dissektion muss die anatomische Lage der Schilddrüse richtig verstanden werden. Die Schilddrüse ist eine schmetterlingsförmige Drüse, die sich auf der dorsalen Seite der Unterkieferdrüse in der Nähe des Schildknorpels und der Luftröhre befindet. Während des Eingriffs wurde eine Durchtrennung der Blutarterien auf beiden Seiten des Halses sorgfältig vermieden.
Modifikation und Fehlerbehebung der mATC-Rasse
ATC ist eine seltene und hochaggressive bösartige Erkrankung. Die klinischen Merkmale von mATC- und ATC-Patienten weisen gewisse Ähnlichkeiten auf. Insbesondere ist die Haupttodesursache bei mATC Erstickung, was mit ATC-Patienten übereinstimmt. Daher sollte während des Experiments Folgendes beachtet werden: 1) Fassen Sie die Mäuse sanft und achten Sie während der Operation auf ihre Atmung; 2) engmaschige Überwachung in der Spätphase, um einen plötzlichen Tod und das Versäumnis, Proben rechtzeitig zu erhalten, zu verhindern; 3) Das Schilddrüsen- und Lungengewebe wird leicht durch das Blut auf der Oberfläche des Gewebes zur Beobachtung und Fotografie beeinflusst, so dass das Blutvolumen von Mäusen durch Enukleation des Augapfels reduziert werden kann.
Einschränkungen bei der Verwendung von mATC
Das Auftreten und die Entwicklung von menschlichem ATC ist komplex und veränderlich, aber der genetische Hintergrund von mATC ist relativ einfach, was nur einen Teil des menschlichen ATC simulieren kann. Zum Beispiel wiesen einige ATC-Gewebe TERT- und BRAF-Mutationen, die NOTCH2NL Kopienzahlvariante 18, anstelle von P53-Mutationen auf, die unterschiedliche Tumorentstehungsmechanismen und klinisch-pathologische Merkmale aufweisen können 7,19,20. Darüber hinaus hat die ATC in der Regel einen langen Verlauf bis zur Diagnose, aber die mATC erhält eine Diagnose nach einer Einleitung von 2 Monaten. Daher gibt es inhärente Unterschiede zwischen mATC und menschlichem Schilddrüsenkrebs, Tiermodelle können nicht alle Merkmale von menschlichem Schilddrüsenkrebs vollständig nachahmen, und viele Therapien, die auf den Menschen beschränkt sind, können nicht mit mATC bewertet werden. Obwohl mATC zur Erforschung der therapeutischen Wirkungen verschiedener niedermolekularer Medikamente eingesetzt werden kann, sollten mehrere Biologika (z. B. Antikörper oder Antikörper-verwandte Medikamente) speziell für Mäuse entwickelt werden. Darüber hinaus nimmt der gesamte Prozess der Konstruktion von bedingten Knockout-Mäusen und der anschließenden Erzielung des Zielgenotyps von Mäusen durch Kreuzung viel Zeit in Anspruch und erfordert bestimmte Mauskulturbedingungen und kostet21,22.
Bedeutung des Einsatzes von mATC in der Schilddrüsenkrebsforschung
Die Heterogenität der menschlichen Population und die Seltenheit der menschlichen ATC erschweren die Erforschung möglicher Mechanismen und therapeutischer Optionen für ATC. Als zuverlässiges Mausmodell erleichtert mATC die Entnahme von ATC-Geweben und bereichert den ATC-Gewebeprobenpool. mATC kann auch verwendet werden, um die Auswirkungen bestimmter Genfunktionen auf ATC zu untersuchen, die zellulären und molekularen Mechanismen der ATC-Entwicklung zu untersuchen, die Mechanismen der Progression von Schilddrüsentumoren und der Medikamentenresistenz zu verstehen und letztendlich die Prognose von ATC-Patienten zu verbessern16.
Zukünftige Anwendungen von mATC
mATC kann für die Forschung zu verschiedenen Aspekten der Strahlentherapie, Chemotherapie, Gentherapie, Immuntherapie und zielgerichteten Therapie eingesetzt werden. mATC kann auch verwendet werden, um die therapeutischen Wirkungen und Nebenwirkungen von Therapien zu untersuchen, z. B. Kombinationen zwischen verschiedenen Medikamenten oder mit Strahlentherapie. Anschließend haben wir mATC eingesetzt, um die therapeutischen Effekte der Strahlentherapie in Kombination mit Immuntherapie und niedermolekularen Inhibitoren auf ATC zu untersuchen. Darüber hinaus kann mATC verwendet werden, um die Auswirkungen verschiedener Verabreichungsmodalitäten oder -wege auf die Antitumorwirkung von Medikamenten zu untersuchen, um Wirkstoffverabreichungssysteme mit erhöhter Antitumoraktivität zu entwickeln. In zukünftigen klinischen Anwendungen hoffen wir, die Rezidivrate und Mortalitätsrate von Schilddrüsenkrebspatienten zu minimieren und damit die Überlebensrate der Patienten zu verbessern.
Wir gehen davon aus, dass in Zukunft weitere ATC-Mausmodelle entwickelt werden, sowie eingehendere Analysen von ATC in verschiedenen genetischen Hintergründen, wie z.B. PTEN und P13K23. Diese werden den molekularen Mechanismus der ATC-Tumorentstehung und -progression umfassender aufdecken, das Ergebnis einer ATC-Behandlung vorhersagen und den Patienten potenzielle therapeutische Angriffspunkte bieten 24,25,26,27,28. Wir hoffen, dass wir durch weitere experimentelle Untersuchungen die Modellierungsmethode des Mausmodells verbessern und die Modellierungszeit verkürzen können, um mehr Beiträge zur Grundlagenforschung zu leisten.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das National Key Research Development Program of China (2021YFA1301203) unterstützt; die Nationale Naturwissenschaftliche Stiftung Chinas (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); das Inkubationsprojekt für klinische Forschung, West China Hospital, Universität Sichuan (22HXFH019); das internationale Kooperationsprojekt des Chengdu Municipal Science and Technology Bureau (2020-GH02-00017-HZ); Naturwissenschaftliche Stiftung von Sichuan, 2022NSFSC1314; das "1.3.5-Projekt für Exzellenzdisziplinen, West China Hospital, Sichuan University" (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); und Sichuan Science and Technology Program (2023YFS0098).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
| 50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
| CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
| Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
| Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
| Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
| Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
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