Summary
Wanneer geïntegreerd met een kopplaat en een optisch ontwerp dat compatibel is met zowel enkelvoudige als twee-fotonmicroscopen, biedt de microprismalens een aanzienlijk voordeel bij het meten van neurale reacties in een verticale kolom onder verschillende omstandigheden, waaronder goed gecontroleerde experimenten in hoofdvaste toestanden of natuurlijke gedragstaken bij vrij bewegende dieren.
Abstract
Met de vooruitgang van multi-fotonenmicroscopie en moleculaire technologieën, groeit fluorescentiebeeldvorming snel uit tot een krachtige benadering voor het bestuderen van de structuur, functie en plasticiteit van levende hersenweefsels. In vergelijking met conventionele elektrofysiologie kan fluorescentiemicroscopie zowel de neurale activiteit als de morfologie van de cellen vastleggen, waardoor langdurige opnames van de geïdentificeerde neuronpopulaties met een eencellige of subcellulaire resolutie mogelijk zijn. Beeldvorming met hoge resolutie vereist echter meestal een stabiele, met het hoofd gefixeerde opstelling die de beweging van het dier beperkt, en de voorbereiding van een plat oppervlak van transparant glas maakt visualisatie van neuronen op een of meer horizontale vlakken mogelijk, maar is beperkt in het bestuderen van de verticale processen die over verschillende diepten lopen. Hier beschrijven we een procedure om een hoofdplaatfixatie en een microprisma te combineren dat meerlagige en multimodale beeldvorming geeft. Dit chirurgische preparaat geeft niet alleen toegang tot de hele kolom van de visuele cortex van de muis, maar maakt ook beeldvorming met twee fotonen mogelijk in een hoofdvaste positie en beeldvorming met één foton in een vrij bewegend paradigma. Met behulp van deze benadering kan men geïdentificeerde celpopulaties in verschillende corticale lagen bemonsteren, hun reacties registreren onder hoofdvaste en vrij bewegende toestanden, en de veranderingen op lange termijn gedurende maanden volgen. Deze methode biedt dus een uitgebreide analyse van de microschakelingen, waardoor een directe vergelijking mogelijk is van neurale activiteiten die worden opgeroepen door goed gecontroleerde stimuli en onder een natuurlijk gedragsparadigma.
Introduction
De komst van in vivo twee-foton fluorescerende beeldvorming 1,2, die de nieuwe technologieën in optische systemen en genetisch gemodificeerde fluorescentie-indicatoren combineert, is naar voren gekomen als een krachtige techniek in de neurowetenschappen om de ingewikkelde structuur, functie en plasticiteit in het levende brein te onderzoeken 3,4. In het bijzonder biedt deze beeldvormingsmodaliteit een ongeëvenaard voordeel ten opzichte van traditionele elektrofysiologie door zowel de morfologie als de dynamische activiteiten van neuronen vast te leggen, waardoor het volgen van geïdentificeerde neuronen op lange termijn wordt vergemakkelijkt 5,6,7,8.
Ondanks de opmerkelijke sterke punten vereist de toepassing van fluorescentiebeeldvorming met hoge resolutie vaak een statische, hoofdvaste opstelling die de mobiliteit van het dier beperkt 9,10,11. Bovendien beperkt het gebruik van een transparant glazen oppervlak voor het visualiseren van neuronen de waarnemingen tot een of meer horizontale vlakken, waardoor de verkenning van de dynamiek van verticale processen die zich over verschillende corticale diepten uitstrekken, wordt beperkt.
Om deze beperkingen aan te pakken, schetst de huidige studie een innovatieve chirurgische procedure die hoofdplaatfixatie, microprisma en miniscoop integreert om een beeldvormingsmodaliteit te creëren met meerlagige en multimodale mogelijkheden. Het microprisma maakt de observatie mogelijk van de verticale verwerking langs de corticale kolom 13,14,15,16, wat van cruciaal belang is om te begrijpen hoe informatie wordt verwerkt en getransformeerd terwijl deze door verschillende lagen van de cortex beweegt en hoe de verticale verwerking wordt veranderd tijdens plastische veranderingen. Bovendien maakt het beeldvorming van dezelfde neurale populaties mogelijk in een hoofdgefixeerd paradigma en in een vrij bewegende omgeving, die de veelzijdige experimentele omgevingen omvat 17,18,19: hoofdfixatie is bijvoorbeeld vaak vereist voor goed gecontroleerde paradigma's zoals sensorische waarnemingsbeoordeling en stabiele opnames onder het 2-fotonparadigma, terwijl vrij bewegen een meer natuurlijke, flexibele omgeving biedt voor gedragsstudies. Daarom is het vermogen om een directe vergelijking in beide modi uit te voeren cruciaal voor het vergroten van ons begrip van de microschakelingen die flexibele, functionele reacties mogelijk maken.
In wezen biedt de integratie van hoofdplaatfixatie, microprisma en miniscoop in fluorescentiebeeldvorming een veelbelovend platform voor het onderzoeken van de fijne kneepjes van de structuur en functionaliteit van de hersenen. Onderzoekers kunnen geïdentificeerde celpopulaties over verschillende diepten bemonsteren die alle corticale lagen beslaan, hun reacties direct vergelijken in zowel goed gecontroleerde als natuurlijke paradigma's en hun langetermijnveranderingen gedurende20 maanden volgen. Deze benadering biedt waardevol inzicht in hoe deze neurale populaties op elkaar inwerken en in de loop van de tijd veranderen onder verschillende experimentele omstandigheden, en biedt een venster op de dynamische aard van neurale circuits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 onder persoonlijke en projectlicenties die zijn goedgekeurd en afgegeven door het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken na een passende ethische beoordeling. Volwassen transgene lijnen CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE21 werden gefokt en hun nakomelingen werden in het experiment gebruikt. Voor de veiligheid van de onderzoekers en het handhaven van steriele omstandigheden werden alle procedures uitgevoerd onder aseptische omstandigheden en met volledige persoonlijke beschermingsmiddelen.
1. Preoperatieve voorbereiding
- Om oedeem tot een minimum te beperken, dient u Dexamethason (0,2 mg/kg) subcutaan toe, 12-24 uur voor de operatie.
- Steriliseer alle chirurgische instrumenten in een autoclaaf en steriliseer het operatiegebied met gestabiliseerd hypochloorzuur met gedestilleerd water en 70% ethanol voorafgaand aan de operatie. Zorg ervoor dat alle chirurgische apparatuur is ingeschakeld.
- Verdoving het dier (24 weken oud, mannetje met een gewicht van 31 g) met isofluraan met een inductiedosis van 5%, die wordt verlaagd tot 1%-2% zodra de muis zich op het stereotaxische frame bevindt, waarbij O2 tussen 1-2 l/min wordt gehouden. Injecteer NSAID's (Carprofen, 2,5 mg/kg) subcutaan.
- Controleer op afwezigheid van teenknijpreflex om de diepte van de anesthesie te beoordelen (verhoog de isofluraanconcentratie in stappen van 0,5% als reflex wordt gezien).
- Scheer de kop van het dier met een trimmer van achter de oren tot iets boven de ogen. Reinig dit gebied met een alcoholdoekje en een povidonjodiumoplossing en vermijd contact met de ogen van het dier.
- Monteer het dier op het homeotherme verwarmingskussen en het stereotaxische frame voorzien van oor- en tandstangen en zet de kop vast. Zorg ervoor dat het hoofd stabiel is, aangezien dit cruciaal is voor het slagen van de volgende procedure (Figuur 1).
- Breng oogzalf aan op de ogen van het dier om te voorkomen dat ze uitdrogen tijdens de operatie en bedek ze met folie om ze tegen licht te beschermen. Bedek het dier met een steriele chirurgische hoes.
Figuur 1: Voorbereiding voor de operatie. De muis wordt op het stereotaxische frame geplaatst, vastgezet met een neusstuk en oorbeugels. De muis wordt op een temperatuurgeregelde verwarmde pad geplaatst. Ogen hebben oogzalf en zijn bedekt met aluminiumfolie. Het hoofd wordt kaalgeschoren en de schedel wordt blootgelegd. Er wordt een steriele hoes over het dier geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Craniotomie
- Gebruik een chirurgische schaar om de huid langs de middellijn van het geschoren deel van het geschoren hoofd in te snijden om de schedel bloot te leggen.
- Reinig de schedel met een steriel wattenstaafje en verdunde waterstofperoxide (3% w/v van 35% H2O2 in 97% dH2O) gedurende 1-3 s om eventueel bindweefsel te verwijderen (Figuur 2A). Droog de schedel met een druppel 70% ethanol en een nieuw steriel wattenstaafje.
- Lijn de schedel anterieur/posterieur (AP) en mediaal/lateraal (ML) uit om een nauwkeurige implantatieplaats te garanderen. Meet hiervoor de dorsoventrale (DV) diepte van de schedel bij zowel bregma als lambda en zorg ervoor dat het verschil tussen de twee <0,03 mm is. Meet voor de mediolaterale uitlijning punten op gelijke afstand van beide pariëtale botten vanaf de middellijn en zorg er opnieuw voor dat het DV-verschil <0,03 mm is.
- Gebruik bregma als oorsprong om het gewenste corticale gebied te vinden en te markeren; hier zijn dit monoculaire primaire visuele cortex (V1), AP: -3,5 mm, ML: -2,5 mm.
- Gebruik een trephineboor (diameter 1.8 mm) en een tandartsboor (snelheid van 10,000 tpm) om de cortex bloot te leggen, en zorg ervoor dat de markering voor het gewenste corticale gebied (monoculair V1) zich binnen het onderste derde deel van het boorvenster bevindt.
- Zorg ervoor dat de hoek van de boor loodrecht staat op de kromming van de schedel. Dit zorgt voor een gelijkmatige craniotomie en voorkomt schade aan de dura of cortex.
- Boor totdat de weerstand afneemt en stop dan (Figuur 2B). Verwijder voorzichtig het losgemaakte botfragment met behulp van een naaldpunt van 23G (Figuur 2C).
- Reinig de blootgestelde cortex met chirurgisch schuim dat verzadigd is met koude kunstmatige hersenvloeistof (ACSF) om vuil te verwijderen en eventuele bloedingen te stoppen.
- Houd de blootgestelde cortex tijdens de operatie altijd gehydrateerd met behulp van koude ACSF.
Figuur 2: Craniotomie. (A) Huidincisie tussen bregma en lambda wordt getoond. Bindweefsel is verwijderd van het blootgestelde oppervlak. (B) Craniotomie door middel van een trephineboor voordat het botfragment wordt verwijderd. (C) Craniotomie na verwijdering van botfragment, met intacte dura en cortex (schaalbalk vertegenwoordigt 0,5 mm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Voorgesneden incisie
OPMERKING: Om rekening te houden bij het uitvoeren van de voorgesneden incisie, moeten de incisie en microprisma-implantatie zich vóór het beeldvormingsgebied (ROI) bevinden. Dit is om een volledig en nauwkeurig gezichtsveld mogelijk te maken. In de context van dit protocol wordt de incisie uitgevoerd langs de mediolaterale as en is het microprisma naar achteren gericht (Figuur 3B).
- Om te helpen bij het inbrengen en om de druk in de cortex tijdens het inbrengen van het microprisma te verlichten, maakt u een incisie.
- Bevestig het chirurgisch mes aan de stereotaxische armhouder en oriënteer het mes of de stereotaxische arm zo dat het langs de ML-as snijdt.
- Verplaats het mes naar de gewenste AP-coördinaat (AP: -3.4 mm); het prisma moet zich voor de ROI bevinden, dus maak de incisie 100 μm anterieur van de ROI AP-coördinaat (-3.5 mm).
- Beweeg het mes nu naar de mediale rand van de craniotomie, waar het de schedel raakt, laat het mes langzaam zakken totdat het het bot bereikt en stop dan. Aangezien de botdikte 200 μm is, moet deze waarde worden opgenomen in de totale insteekdiepte (zie stap 5.1 berekening).
- Optimale beeldvorming bevindt zich in het midden van het prisma, d.w.z. 500 μm; zorg er daarom voor dat deze diepte is uitgelijnd met de diepte van de corticale kolom (ROI DV: - 0,35 mm).
- Gebruik de onderstaande vergelijking om de dikte van de schedel op te nemen in de berekening van de diepte, die bepaalt hoe diep de voorgesneden incisie vanaf het oppervlak van de schedel moet zijn. Voor dit protocol wordt de implantatiediepte berekend als:
Botdikte (200 μm) + beeldvormings-ROI (bijv. 350 μm) + resterende microprismadiepte (500 μm) = 1.050 μm
- Gebruik de onderstaande vergelijking om de dikte van de schedel op te nemen in de berekening van de diepte, die bepaalt hoe diep de voorgesneden incisie vanaf het oppervlak van de schedel moet zijn. Voor dit protocol wordt de implantatiediepte berekend als:
- Zorg ervoor dat de lengte van de incisie meer dan 1 mm is, maar niet buitensporig; daarom is een afstand van 1,2 mm ideaal, waarbij de monoculaire ML-coördinaat zich in het midden van deze afstand bevindt.
- Wanneer u klaar bent om de incisie uit te voeren, verwijdert u overtollige ACSF zodat het zicht niet wordt belemmerd (Figuur 3A).
- Verplaats het mes van de mediale rand van de craniotomie naar de mediale coördinaat van de incisie. Laat het mes langzaam (10 μm/s) in de cortex zakken.
- Zodra de dura is doorboord en het mes de cortex is binnengedrongen, brengt u een druppel koude ACSF aan op de cortex om het weefsel tijdens de incisie gesmeerd en gehydrateerd te houden.
- Zodra de uiteindelijke diepte is bereikt, begint u het mes langs de ML-as te bewegen (met een snelheid van 10 μm/s).
- Blijf het omringende weefsel observeren terwijl de incisie wordt gemaakt. Als het weefsel met het mes meesleept, beweeg het mes dan een paar keer op en neer om er zeker van te zijn dat het weefsel wordt doorgesneden, en ga dan zijwaarts verder, waarbij u eraan denkt het mes terug te plaatsen naar zijn uiteindelijke diepte.
- Als u klaar bent, tilt u het mes langzaam op. Als er tijdens de incisie bloed naar buiten komt, gebruik deze tijd dan om de incisieplaats schoon te maken met ACSF-gedrenkt chirurgisch schuim om het bloed te verdunnen en eventueel bloed in de incisie naar buiten te duwen. Vergeet niet om een vers, verzadigd chirurgisch schuim over de blootgestelde cortex achter te laten totdat het klaar is om het microprisma in te brengen.
Figuur 3: Implantatie van microprisma's. (A) Voorgesneden incisie. (B) Schema van de geïntegreerde microprismalens die de positie in de cortex aantoont (C) Geïntegreerde microprismalens in de juiste richting ten opzichte van de voorgesneden incisie voordat deze in de cortex wordt ingebracht (schaalbalk geeft 0,5 mm weer). (D) Voorbeeld van cementophoping rond de geïntegreerde lens om de bevestiging aan de schedel te bevestigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Het inbrengen van het microprisma en de implantatie van de hoofdplaat
- De microprismalens bestaat uit een gradiëntindexlens die is bevestigd aan een prisma aan het distale uiteinde van de lens, die is geïntegreerd in een grondplaat. Bevestig het microprisma aan de implantaatkit.
- Zorg ervoor dat de beeldzijde van het prisma zich tegenover de schroef van de grondplaat bevindt. Om te helpen bij het inbrengen en plaatsen van het microprisma, bevestigt u het aan het stereotaxische frame en oriënteert u het prisma zo dat het is uitgelijnd met de incisie (Figuur 3C).
- Laat het microprisma langzaam zakken in de incisieplaats (10 μm/s). Vergeet niet om ACSF te verwijderen wanneer u het prisma voor het eerst inbrengt, maar eenmaal in de cortex, spoel met koude ACSF om het inbrengen te smeren.
- De cortex moet stabiel blijven terwijl het prisma in de incisie wordt neergelaten; zo niet, voeg dan extra ACSF toe en beweeg de cortex door het prisma op en neer te bewegen om de cortex los te maken van het prisma.
- Zodra de uiteindelijke diepte is bereikt, droogt u het blootgestelde corticale oppervlak af met behulp van steriel weefsel en zorgt u ervoor dat u het prisma niet aanraakt.
- Bedek het blootgestelde corticale gebied rond het prisma, evenals de lens, met een beschermende laag siliconenlijm, waardoor overtollige lijm op de omliggende schedel en dummyscoop tot een minimum wordt beperkt.
- Eenmaal uitgehard (5-10 min), bevestigt u de hoofdplaat aan de schedel om het hoofd te stabiliseren tijdens beeldvorming van het hoofd.
- Zorg ervoor dat de kopplaat voldoende naar achteren is geplaatst om de plaatsing van het implantaat niet te hinderen en om voldoende cement aan te brengen om het implantaat goed vast te zetten.
- Zorg ervoor dat de middellijn van de kopplaat iets rechts van de geïmplanteerde lens ligt om ervoor te zorgen dat beide zijden van de kopplaat aan de hoofdtrap kunnen worden bevestigd bij het uitvoeren van experimenten met een vaste kop
- Breng zelfklevend cement aan op de hoofdplaat en schedel.
- Bereid zelfklevend tandheelkundig cement voor door 1 schep ondoorzichtig cementpoeder te mengen met 4 druppels mengmedium en één druppel van de katalysator aan te brengen.
- Plaats cement op zowel de kopplaat als de schedel en houd de kopplaat op zijn plaats totdat deze is uitgehard, zorg ervoor dat deze evenwijdig is aan de oorbalken (inspecteer door middel van visueel onderzoek zowel van boven als achter de kop van het dier).
- Breng zelfklevend cement aan om de rest van de blootgestelde schedel en het blootliggende weefsel te bedekken, inclusief het microprisma (tot aan de basis van de huidplaat) en de kopplaat.
- Zorg ervoor dat er geen cement op de huidplaat, dummymicroscoop of een van de onderdelen ervan komt. Blijf het lijmcement aanbrengen totdat het microprisma en de kopplaat bedekt zijn en stabiel zijn (Figuur 3D).
- Wanneer het cement is uitgehard, maakt u de dummy-microscoop los door de stereotaxische arm langzaam omhoog te bewegen terwijl u het microprisma stabiliseert met een pincet (ze zijn verbonden door magneten, daarom kan er enige weerstand worden gevoeld tijdens de scheiding).
- Plaats de beschermkap op de lens en draai de schroef vast om deze op zijn plaats te bevestigen.
- Haal het dier uit het stereotaxische frame, laat het herstellen in een warme herstelbox en dien opgewarmde steriele 0,9% zoutoplossing subcutaan toe (3% van het lichaamsgewicht).
- Zodra het dier wakker is en in beweging is, plaatst u het terug in een schone kooi met één huis. Houd het dier in de gaten en dien aanvullende analgesie na de operatie toe volgens het beleid van de lokale instelling inzake analgesie.
- Wacht 4 weken na de operatie, het dier moet klaar zijn voor beeldvorming.
5. Calciumbeeldvorming met één foton van corticale lagen bij vrij bewegende muizen
OPMERKING: Het is essentieel om elke keer beelden te gebruiken die zijn vastgelegd tijdens de oorspronkelijke beeldvormingssessie om een nauwkeurige verwerving van het beoogde beeldvormingsvlak te garanderen. Deze geïdentificeerde oriëntatiepunten spelen, samen met de neuronen, een cruciale rol in het uitlijningsproces dat in detail wordt beschreven in stap 9 van het protocol. Bij het verkrijgen van gegevens van één foton is de miniscoop zowel het beeldvormingssysteem als de laserbron. Excitatie maakt gebruik van LED met een vermogensbereik van 0-2 mW/mm2 aan het vooroppervlak van het objectief. De laser gebruikt een excitatiegolflengte van 455 ± 8nm (blauw licht) voor GCaMP-signalering. De focusschuifregelaar van de lens kan worden gebruikt om de focus (Z-as) aan te passen, die op de interface wordt weergegeven als 0-1000, waarbij 0 staat voor een werkafstand van 0 μm en 1000 voor de maximale werkafstand van 300 μm.
- Voordat u gegevens verzamelt, moet u het dier 1 uur voor de opnamesessie laten acclimatiseren in de kamer en de open arena.
- Desinfecteer en reinig alles voor de beeldvorming met geschikte ontsmettingsmiddelen (bijv. gestabiliseerd hypochloorzuur met gedestilleerd water en 70% ethanol).
- Stel de DAQ-box in door deze op een computer aan te sluiten en de data-acquisitiesoftware te starten. Breng een directe verbinding tot stand via een ethernetkabel om verloren frames te minimaliseren; De draadloze verbindingsmodus kan echter voldoende zijn, afhankelijk van de sterkte van de draadloze verbinding.
- Bevestig de miniscoop aan de grondplaat van het dier onder een zacht nekvel.
- Verwijder eerst de beschermkap van de grondplaat door de stelschroef los te draaien. Houd het deksel met een pincet bij de opening vast. Bevestig vervolgens de miniscoop aan de grondplaat, waar het deksel zit.
- Controleer de oriëntatie van de miniscoop ten opzichte van de grondplaat voordat u deze installeert, zodat de kant met de markering van de schroef naar de schroef wijst.
- Zodra de miniscoop is bevestigd, draait u de stelschroef vast om deze te stabiliseren. Draai de stelschroef alleen naar voren totdat er enige weerstand voelbaar is. Het te vast aandraaien van de stelschroef zou de miniscoop mogelijk beschadigen en moet daarom worden vermeden.
- Sluit de miniscoop aan op de DAQ-box en bereid de software voor op opname.
- Schakel in de data-acquisitiesoftware de stream in voor de miniscoop en pas de opnameparameters aan (beeldframesnelheid, versterking, LED-vermogen, efocus-waarde) om een duidelijk gezichtsveld te bereiken (Afbeelding 4A).
- Schakel het histogramvenster in en pas de versterking en het LED-vermogen aan zodat de geregistreerde intensiteit tussen 35% en 70% ligt.
- Als u een longitudinaal onderzoek uitvoert, raadpleegt u de opnamen of snapshots die in een eerdere sessie zijn gemaakt en past u de efocuswaarde aan zodat hetzelfde beeldvlak duidelijk te zien is.
- Start het experiment en de data-acquisitie.
- Verwijder het dier na voltooiing van het experiment uit het gedragsapparaat.
- Draai onder een zacht nekvel de stelschroef los en verwijder de miniscoop van de grondplaat van het dier.
- Plaats de beschermkap terug op de grondplaat en stabiliseer deze met de stelschroef.
- Zet het dier terug in zijn thuiskooi (ga verder met stap 7 als je gegevens van één foton wilt verwerken).
Figuur 4: Data-acquisitie en -verwerking met software. (A) Een afbeelding die de real-time stream van de miniscoop laat zien. Het wordt aanbevolen om de focuswaarde van de lens aan te passen, zodat een duidelijk beeld te zien is in het streamingvenster, samen met de versterking en het vermogen van de beeldlaser (B) Schematische grafiek die de aanbevolen uitlijningsworkflow illustreert voor sessies die op verschillende tijdstippen zijn opgenomen. Het wordt aanbevolen om vanaf de eerste sessie een gemiddeld beeld te genereren, volgens de instructies voor de gegevensverwerkingssoftware. Dit beeld moet worden gebruikt als referentiebeeld tijdens bewegingscorrectie voor de volgende sessies. (C) Voorbeelden van vier cellen uit hetzelfde maximaal geprojecteerde ΔF/F-beeld. Over elke cel wordt een oranje lijn getrokken om de celdiameter in pixels te meten, waarvan het gemiddelde wordt genomen als invoerargument voor het celidentificatie-algoritme (linksboven: 13, rechtsboven: 11, linksonder: 12, rechtsonder: 13). (D) Uitvoer van het celidentificatie-algoritme na handmatige curatie (afbeelding bijgesneden). Witte contouren geven de geïdentificeerde cellen weer (schaalbalk staat voor 100 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Twee-foton calcium beeldvorming van corticale lagen in hoofd-gefixeerde muizen
OPMERKING: Voor laserscanmicroscopie met twee fotonen is de lichtbron een afstembare ultrasnelle laser met een excitatiegolflengte van 920 nm. Het excitatievermogen, gemeten aan het objectief, lag meestal tussen 100-150 mW en werd in elke sessie aangepast om vergelijkbare fluorescentieniveaus te bereiken. Emissielicht werd gefilterd door een emissiefilter (525/70 nm) en gemeten door een onafhankelijke fotomultiplicatorbuis (PMT), een groen kanaal genoemd. De beelden werden verkregen met een 20x luchtonderdompelingsobjectief (NA = 0,45, 6,9-8,2 mm werkafstand).
- Voordat u gegevens verwerft, moet u het dier in de dagen ervoor aan het apparaat laten wennen (om het dier vertrouwd te maken met de gedragsopstelling). Laat het dier 15-30 minuten per dag, gedurende 2-3 dagen, besteden aan het verkennen van de opstelling of totdat ze naturalistisch gedrag vertonen voordat ze beginnen met het verzamelen van gegevens.
- Schakel het beeldvormingssysteem met twee fotonen in, start acquisitiesoftware en schakel de laser AAN. Zorg ervoor dat de lasers zijn gesloten en PMT's zijn uitgeschakeld voordat u doorgaat.
- Reinig beeldvormingsapparatuur met twee fotonen met gestabiliseerd hypochloorzuur met gedestilleerd water en 70% ethanol.
- Zorg ervoor dat u het apparaat aanpast aan de grootte van het dier. Bevestig de muis en de kopplaat voorzichtig aan de hoofdpodiumopstelling en schroef deze op zijn plaats om de kop van de muis te stabiliseren.
- Eenmaal bevestigd, verwijdert u de lensdop (zie stap 5.4.1) en lijnt u het objectief uit zodat het zich over de grondplaat bevindt.
- Gebruik de epifluorescentie- en XYZ-faseregelaars om het corticale weefsel scherp te stellen.
- Zodra de corticale lagen zichtbaar zijn, schakelt u de microscoop om beeldvorming met twee fotonen mogelijk te maken (verwissel de spiegel voor de dichroïsche spiegel, sluit de fluorescerende sluiter en schakel de epifluorescentielaser en monitor uit). Zorg ervoor dat u de hoofdverlichting UIT schakelt om de PMT's te beschermen tijdens het fotograferen.
- Stel parameters in om de verkregen afbeeldingsbestanden te optimaliseren.
- Gebruik de resonantie-acquisitiemodus voor calciumbeeldvorming, omdat deze het snelle afvuren van GCaMP-signalen kan vastleggen.
- Pas het laservermogen, de PMT-versterking, de zoom en de LUT's (Look-Up Tables) aan om een optimaal beeld te verkrijgen en raadpleeg het beeld met één foton om ervoor te zorgen dat het juiste brandpuntsvlak wordt afgebeeld.
- Begin met het in beeld brengen van corticale lagen met het twee-fotonsysteem met gesynchroniseerde gedragsmonitoring en stimulusinvoer (indien van toepassing).
- Zorg ervoor dat u deze acquisitieparameters en XYZ-afstanden opslaat als u identieke afbeeldingen in de loop van de tijd wilt reproduceren.
- Om een z-stapel van de corticale lagen vast te leggen, volgt u de onderstaande stappen.
- Zoek het vlak om de z-stack te starten, pas de acquisitieparameters aan om de afbeelding te optimaliseren en markeer dit als het startpunt in de software.
- Ga vervolgens met behulp van de Z-besturing naar beneden in de stapel, pas alleen het laservermogen aan om een constante luminantie van de stapel te behouden en markeer het einde van de stapel op de software.
- Kritieke stap: met behulp van de optie Relatieve exponentiële gradiënt onder het tabblad Laservermogensgradiënt , kan de software de toename van het laservermogen berekenen terwijl deze door de z-stack beweegt. Zorg ervoor dat u de waarden van het laservermogen van het eindpunt noteert in de tabel die door de software wordt geleverd, zodat deze de gradiënt kan berekenen.
- Zodra de z-stack-parameters zijn ingesteld, past u de stapgrootte (μm) aan.
OPMERKING: De stapgrootte bepaalt de benodigde tijd, het aantal plakjes en de detailkwaliteit van de stapel. Kleinere stapgroottes resulteren in een langere acquisitietijd, een toename van het aantal plakjes en betere details in vergelijking met grotere stapgroottes. Z-stacks worden gebruikt om te helpen bij de registratie van afbeeldingen van één foton en twee fotonen, omdat ze anatomische oriëntatiepunten of kenmerken markeren.
- Om een tijdreeks (T-serie) van calciumveranderingen in neuronen te verkrijgen, vindt u een optimaal brandpuntsvlak met behulp van de XYZ-faseregelaars en past u het laservermogen, de PMT-versterking, de zoom en de LUT's aan.
- Definieer op het tabblad T-serie van de acquisitiesoftware de parameters van de acquisitiefrequentie die overeenkomen met de gegevens die zijn verkregen met behulp van het beeldvormingssysteem met één foton.
OPMERKING: Door de frequentie aan te passen, worden de 1P- en 2P-gegevens vergelijkbaar en is het beter geschikt voor het celidentificatie-algoritme dat wordt gebruikt in de gegevensverwerkingsstappen. Meerdere triggers en andere acquisitiemodi kunnen worden opgenomen in de acquisitie van de T-serie.
- Definieer op het tabblad T-serie van de acquisitiesoftware de parameters van de acquisitiefrequentie die overeenkomen met de gegevens die zijn verkregen met behulp van het beeldvormingssysteem met één foton.
- Begin met de overname van de T-serie.
7. Verwerking van calciumbeeldvormingsgegevens met één foton
- Gebruik voor het opnemen van films met één foton de gegevensverwerkingssoftware die bij het miniscoopsysteem wordt geleverd.
- Bewerk de film eerst door middel van ruimtelijke en temporele down-sampling. Over het algemeen zou ruimtelijke downsampling van de film met een factor twee de verwerkingstijd aanzienlijk verkorten zonder de nauwkeurigheid van de celidentificatie ernstig in gevaar te brengen.
- Stel de temporele downsampling-factor zo in dat de beeldsnelheid van de film wordt teruggebracht tot ongeveer 10 Hz, wat geschikter is voor het celidentificatie-algoritme dat in de volgende stappen wordt gebruikt.
- Als u meerdere films op dezelfde beeldvormingsdag aanschaft, combineert u de films in één tijdreeks vóór de voorbewerkingsstap om ze samen te verwerken.
- Optioneel: Pas een ruimtelijk banddoorlaatfilter toe op de film om de lagere en hogere ruimtelijke frequenties te verwijderen, wat resulteert in een vloeiendere film met een hoger contrast.
- Registreer de film met behulp van de bewegingscorrectiefunctionaliteit van de software. Hiermee wordt de film geregistreerd en gecorrigeerd voor bewegingsartefacten die worden veroorzaakt door de beweging van de miniscoop ten opzichte van het beeldoppervlak.
- Cruciale stap: Als u een longitudinaal onderzoek uitvoert, registreer dan de films in hetzelfde gezichtsveld, bijvoorbeeld het gemiddelde beeld van de film dat op de eerste beeldvormingsdag is gemaakt (Figuur 4B).
- Bereken de ΔF/F van de film met behulp van het bijbehorende tabblad en projecteer de film om een maximaal projectiebeeld van de ΔF/F-film te genereren. Deze afbeelding toont regio's die veranderingen in fluorescentieniveaus vertonen, mogelijk individuele neuronen, en kan worden gebruikt om de gemiddelde diameter van de neuronen te meten (Figuur 4C).
- U kunt ook de celdiameter meten op de bewegingsgecorrigeerde film, waar de neuronen duidelijke fluorescentie vertonen.
- Identificeer cellen met behulp van de algoritmen in de software.
- Hoewel er bij deze stap twee opties (PCA-ICA en CNMF-E) beschikbaar zijn, kunt u CNMF-E gebruiken voor dit onderzoek. Voer de gemiddelde celdiameter in pixels in en voer het algoritme uit om een celset te genereren met interessante regio's (ROI's) die celachtige activiteiten aantonen.
- Selecteer handmatig ROI's die cellen zijn (hebben een celachtige morfologie en activiteit22,23, en liggen binnen het gezichtsveld) van degenen die dat niet zijn, en valideer de samengestelde celset (Figuur 4D).
- Exporteer de calciumsporen van elke ROI voor verdere analyse.
8. Verwerking van calciumbeeldvormingsgegevens met twee fotonen
- Gebruik voor het opnemen van films met twee fotonen een python-pakket dat is ontworpen om calciumanalysegegevens met twee fotonen te verwerken.
- Combineer eerst de foto's die in een T-serie zijn gemaakt tot een .tiff stapel zoals hieronder beschreven.
- Pas onder de interface Opties uitvoeren de parameters aan, inclusief de tau-waarde en framesnelheid, zodat deze overeenkomen met de gebruikte GCaMP en de framesnelheid van de opname.
- Optioneel: Stel de parameter do_registration in op 1 om de film te registreren. Dit komt overeen met de hierboven beschreven bewegingscorrectiestap.
- Optioneel: Stel de parameter anatomical_only in op 1 om ROI's te detecteren met behulp van de anatomische kenmerken naast de fluorescentiedynamiek. Hiervoor moet de celdiameter worden ingevoerd, dus voer metingen uit met behulp van de beeldverwerkingssoftware. Dit wordt over het algemeen aanbevolen, omdat het ROI's genereert met meer natuurlijke vormen (Figuur 5A-C).
- Zodra alle parameters zijn ingesteld, voert u het algoritme zo uit dat het alle berekeningen samen uitvoert. Raadpleeg de grafische gebruikersinterface (GUI) om de voortgang te controleren.
- Zodra dit is gebeurd, keert u terug naar de celselectie-interface voor handmatige curatie van de celidentificatieresultaten.
- Sla een afbeelding op van de samengestelde cel bovenop de maximale projectie van de film. Dit zal later worden gebruikt als referentiebeeld voor het registreren van opnamegegevens van één foton.
- Het algoritme slaat de resultaten vervolgens automatisch op. npy-formaat, dat later toegankelijk is met Python. U kunt de resultaten ook opslaan in andere geformatteerde bestanden voor verdere analyse in andere software.
Figuur 5: Celidentificatie met behulp van software voor de verwerking van twee fotonen. (A) Representatief beeld van celidentificatie afkomstig van de software voor de verwerking van twee fotonen. Door Anatomical_only parameter op 0 in te stellen, maar alle andere parameters hetzelfde te houden, zijn er meerdere niet-cellen aanwezig in het gebied tussen stippellijnen die de handmatige curatie van werkelijke cellen verstoren. (B) Voorbeelden van metingen van de celdiameter met behulp van beeldverwerkingssoftware (linksboven; 7,5 pixels, rechtsboven; 9, linksonder; 6,5, rechtsonder; 7,5). (C) Representatief beeld van celidentificatie. Bij het instellen van Anatomical_only parameter op 1 en het invoeren van de gemiddelde celdiameter van (B) in het celdiameteralgoritme, zijn er geen cellen aanwezig in het gebied tussen de stippellijnen (schaalbalken vertegenwoordigen 200 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
9. Registratie van geïdentificeerde celsets in verschillende beeldvormingsmodaliteiten
- Voer registratie uit van cellen die zijn geïdentificeerd op basis van opnames van één foton en twee foton met het multimodale beeldregistratie- en analyse-algoritme (MIRA), dat beschikbaar is via de Python-interface van de beeldvormingssoftware met één foton.
- Dit algoritme lijnt de gegevens van één foton en twee fotonen uit via niet-rigide registratie. Zie de set online demonstratienotitieboekjes die op de website te vinden zijn en voor dit onderzoek zijn gebruikt.
OPMERKING: De notebooks zijn zo geschreven dat alle verwerking in de 1P-software zou worden voltooid en zijn dus niet compatibel met 2P-verwerkingssoftware. Volg daarom slechts enkele van de stappen in de notitieboekjes voor dit onderzoek.
- Dit algoritme lijnt de gegevens van één foton en twee fotonen uit via niet-rigide registratie. Zie de set online demonstratienotitieboekjes die op de website te vinden zijn en voor dit onderzoek zijn gebruikt.
- Volg de stappen die worden beschreven in de demonstratienotitieboekjes, waarbij voor elke beeldvormingsmodaliteit een structureel beeld wordt gegenereerd. Standaard gaat het hierbij om het genereren van een maximale projectie van de z-stack met twee fotonen en een gemiddelde afbeelding van de opname met één foton. U kunt ook een gemiddelde afbeelding van de opname van twee fotonen gebruiken.
- Waar daarom wordt gevraagd, filtert de ruimtelijke bandpass de afbeeldingen om de oriëntatiepunten beter te visualiseren en ze te heroriënteren zodat ze overeenkomen.
- Selecteer overeenkomende oriëntatiepunten op de twee afbeeldingen (Figuur 6A).
- Gebruik deze om de vervorming te berekenen die nodig is om de twee afbeeldingen uit te lijnen. Over het algemeen zouden 3 tot 5 oriëntatiepunten voldoende moeten zijn.
- Het algoritme berekent de vervorming op basis van een combinatie van oriëntatiepunten en beeldgelijkenis. Optimaliseer voor het relatieve gewicht dat aan de twee factoren wordt gegeven totdat bevredigende resultaten zijn bereikt.
- Verdraai de celkaart die is verkregen in een sessie met één foton om een nieuwe celkaart te genereren die is uitgelijnd met de gegevens van twee fotonen.
- Importeer vervolgens deze vervormde celkaart in de 1P-verwerkingssoftware om een afbeelding te genereren met het maximale projectiebeeld van de film met twee fotonen op de achtergrond.
- Exporteer deze afbeelding voor registratiedoeleinden.
- Lijn in programmeersoftware de twee tot nu toe gegenereerde afbeeldingen uit (twee-fotoncelkaart bovenop twee-foton maximale projectieafbeelding) en verdraai de één-fotoncelkaart bovenop het twee-foton maximale projectiebeeld (Figuur 6B,C).
- Gebruik hiervoor voor dit onderzoek een registratieschattingsapplicatie waarmee de gebruiker de resultaten van verschillende registratietechnieken kan vergelijken. Aangezien de twee afbeeldingen dezelfde achtergrond hebben, was de fasecorrelatietechniek, met rigide registratie, voldoende.
- Zodra de registratie is voltooid, scant u de nu geregistreerde afbeelding op overlappende ROI's. Dit zijn ROI's die in beide opnamesessies actief zijn en die kunnen worden gebruikt bij verdere analyse.
Figuur 6: Cross-modale celregistratie met behulp van de MIRA-workflow. (A) Representatief beeld van de workflow voor celuitlijning. Het gemiddelde beeld van de gegevens van één foton wordt aan de linkerkant weergegeven en het beeld van de gegevens van twee fotonen wordt rechts weergegeven. Overeenkomende oriëntatiepunten van beide afbeeldingen worden in de software geselecteerd en gelabeld door een willekeurig kleurenschema (rode cirkels). (B) Voorbeeldafbeeldingen met de twee geïdentificeerde celsets, één foton (paars) en twee foton (groen), worden over het gemiddelde beeld van de gegevens met twee fotonen heen gelegd. (C) Afbeelding van het gebied gemarkeerd met het witte vak in (B), uitgelijnde cellen worden hier weergegeven als overlappende groene en paarse contouren. In alle panelen staat de schaalbalk voor 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De methode van het uitvoeren van chronische meerlaagse in vivo calciumbeeldvorming van dezelfde neuronale populatie gedurende een periode van enkele weken, met behulp van zowel één- als twee-fotonbeeldvormingsmodaliteiten, onder vrij bewegende en hoofdgefixeerde omstandigheden is aangetoond. Hier is het vermogen aangetoond om overeenkomende neuronale populaties te identificeren onder beeldvorming van één foton terwijl het dier in het donker een open arena verkende (Figuur 7A). Calciumsporen werden geëxtraheerd uit de geïdentificeerde neuronen en z-gescoord ter vergelijking (Figuur 7B). Neuronen vertoonden vergelijkbare niveaus van fluorescentie en vuursnelheden in sessies met een tussenpoos van 3 weken.
Figuur 7: Calciumdynamiek van de primaire visuele cortex kan stabiel worden geregistreerd over sessies van 3 weken. (A) Ruimtelijke filters van geïdentificeerde neuronen over de maximale projectiebeelden van drie afzonderlijke opnames van hetzelfde gezichtsveld onder vrij bewegende calciumbeeldvorming met één foton, verspreid over een duur van 3 weken. ROI's worden gelabeld in de volgorde waarin ze worden gepresenteerd in (B). Donkere gebieden in de tweede (midden) en derde (rechts) sessie zijn het resultaat van beeldregistratie, waarbij de eerste (linker) sessie als referentie wordt gebruikt (schaalbalk vertegenwoordigt 0,5 mm). (B) Z-gescoorde calciumactiviteiten van de geregistreerde ROI's in de eerste (links), tweede (midden) en derde (rechts) sessie weergegeven in (A). De horizontale schaalbalk is 10 s en de verticale schaalbalk is 10 sd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Vervolgens werd de registratie van een neuronale populatie over verschillende beeldvormingsmodaliteiten gedemonstreerd. Beeldvormingssessies met één foton en twee foton werden op dezelfde dag uitgevoerd. ROI's werden geïdentificeerd op basis van gegevens van één foton en handmatig samengesteld om een celkaart te genereren (Figuur 8A). Op dezelfde manier werden gegevens van twee fotonen verwerkt om een celkaart te genereren waarbij cellen automatisch worden geïdentificeerd en handmatig worden geselecteerd voor demonstratie. Vervolgens werd het gemiddelde projectiebeeld van de één-foton-sessie uitgelijnd met het maximale projectiebeeld van de twee-foton z-stack met het MIRA-platform (Figuur 8B). Deze vervormde celkaart werd vervolgens geëxporteerd, gesuperponeerd op het maximale projectiebeeld van twee fotonen en uitgelijnd met de celkaart met twee fotonen (Figuur 8C). Dit maakte celidentificatie mogelijk die activiteiten van dezelfde cellen onder beide beeldvormingsmodaliteiten liet zien (Figuur 8D), die kan worden gebruikt voor kwantitatieve analyse van de neuronale reacties.
Figuur 8: Calciumdynamiek van de primaire visuele cortex geregistreerd tussen verschillende beeldvormingsmodaliteiten. (A) Ruimtelijke filters van geïdentificeerde neuronen over het maximale projectiebeeld van een vrij bewegende sessie met één foton. Gelabelde neuronen zijn neuronen die met succes zijn geregistreerd voor opnamegegevens van twee fotonen die worden gepresenteerd in (C). (B) Dezelfde contouren getoond in (A) werden vervormd om overeen te komen met de twee-foton-sessiegegevens getoond in (C). (C) Ruimtelijke filters van de ROI's weergegeven in (A) na uitlijning (wit), en ROI's geïdentificeerd met behulp van de 2P-verwerkingssoftware van een opnamesessie met twee fotonen op dezelfde dag (groen), over het maximale projectiebeeld van de twee-fotonsessie heen. Overlappende ROI's worden als geregistreerd beschouwd en worden gekozen voor verdere analyse (schaalbalken vertegenwoordigen 0,5 mm). (D) Z-gescoorde calciumactiviteiten van de geregistreerde ROI's in opnamesessies met één foton (links) en twee foton (rechts) (horizontale schaalbalk is 10 s en verticale schaalbalk is 10 sd). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we het vermogen getoond om neuronen te observeren en direct te vergelijken in hoofdgefixeerde en vrij bewegende omstandigheden in dezelfde neurale populaties. Hoewel we de toepassing in de visuele cortex hebben gedemonstreerd, kan dit protocol worden aangepast aan een groot aantal andere hersengebieden, zowel corticale gebieden als diepe kernen 24,25,26,27,28, evenals andere data-acquisitie en gedragsopstellingen 29,30.
Het is belangrijk om kennis te nemen van de kritieke stappen binnen dit protocol, omdat deze een optimale gegevensverzameling mogelijk maken. Ten eerste is het bij het uitvoeren van z-stacks van cruciaal belang om overal een consistente luminantie te behouden. Zoals eerder beschreven, zal licht verstrooien naarmate het meer weefsel moet binnendringen; dus door de versterking te vergroten, heeft de laser meer vermogen om het weefsel verder te kunnen penetreren en onze ROI's te prikkelen. Het wordt echter niet aangeraden om de z-stack te starten met de versterking die nodig is om ROI's in het diepe weefsel op te wekken, omdat dit overmatige blootstelling aan fluorescerende structuren en fototoxiciteit zal veroorzaken en het weefsel aan het oppervlak van de cortex kan bleken. Daarom kan de software door de optie Relatieve exponentiële gradiënt te selecteren, een constante gradiënt van het vermogen berekenen dat nodig is om optimaal te kunnen zijn bij elke stap van de z-stack. Ten tweede is de volgende cruciale stap om te helpen bij een consistente registratie van celsets in de loop van de tijd, ervoor te zorgen dat het gemiddelde beeld van de film wordt opgeslagen dat is gemaakt tijdens de eerste beeldvormingssessie met één foton. Dit stelt de gebruiker in staat om eventuele volgende beeldvormingssessies te vergelijken met het originele beeld om continuïteit in celsets en gegevensacquisitie te garanderen.
Het is vermeldenswaard dat lichtgewicht geminiaturiseerde twee-fotonmicroscopen onafhankelijk zijn ontworpen 31,32, die beeldvorming met hoge resolutie mogelijk maken bij dieren die zich vrij gedragen. Hoewel het een opwindende vooruitgang benadrukt voor in-vivobeeldvorming met hoge resolutie, maken het beperkte gezichtsveld (FOV) en het zeer gespecialiseerde ontwerp het een uitdaging voor algemene eindgebruikers. De methode die we hebben beschreven, integreert verschillende gevestigde platforms die direct beschikbaar zijn bij commerciële leveranciers, waardoor het een toegankelijke keuze is. In theorie kan het ook worden vervangen door een op maat gemaakt, zelfgeassembleerd microprisma dat compatibel is met een open-source miniscoop en een generieke microscoopmet twee fotonen 33,34.
Desalniettemin staat dit protocol voor uitdagingen zoals nauwkeurige implantatie van microprisma's, aangezien fouten kunnen leiden tot niet-levensvatbare FOV's en bijgevolg tot gecompromitteerde gegevens. Het handhaven van consistente FOV's in verschillende modaliteiten is ook een uitdaging vanwege de verschillende doelstellingen die worden gebruikt voor beeldvormingsacquisitie. Omdat de XY-assen van het microprisma echter vast blijven, is de variatie in FOV langs de Z-as; daarom worden specifieke oriëntatiepunten die aanwezig zijn in beide beeldvormingsmodi (zoals bloedvaten, artefacten in het corticale weefsel en identieke neuronen) gebruikt om de FOV's te synchroniseren. Bovendien is het cruciaal om registratie toe te passen om dezelfde neuronen onder verschillende modaliteiten op één lijn te brengen en te identificeren. Een andere uitdaging om op te letten is het minimaliseren van fotobleken van het GCaMP-weefsel tijdens acquisitie in beide modaliteiten. Daarom is het belangrijk om de opnametijd te verminderen, de signaal-ruisverhouding te optimaliseren (door de versterking te verhogen in plaats van het LED-/laservermogen) en 24-48 uur te wachten tussen beeldvormingssessies.
Ondanks deze inherente complexiteit biedt ons protocol, wanneer het wordt uitgevoerd met chirurgische precisie en geschikte beeldverwerkingstechnieken, een robuust platform voor het vergelijken van neurale activiteiten. Het maakt de vergelijking mogelijk tussen hoofdgefixeerde toestanden in strikt gecontroleerde taken en vrij bewegende toestanden die meer natuurlijk gedrag nabootsen, waardoor de potentiële toepassingen op het gebied van neurowetenschappen worden uitgebreid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van een concurrerend financieel belang of belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We danken mevrouw Charu Reddy en professor Matteo Carandini (Cortex Lab) voor hun advies over het chirurgische protocol en het delen van transgene muizenstammen. We danken Dr. Norbert Hogrefe (Inscopix) voor zijn begeleiding en hulp bij de ontwikkeling van de operatie. Wij danken mevrouw Andreea Aldea (Sun Lab) voor haar hulp bij de chirurgische opzet en gegevensverwerking. Dit werk werd ondersteund door de Moorfields Eye Charity.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | - | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | - | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | - | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system - single gas - isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | - | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | - | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | - | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | - | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | - | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Vaziri, A., Emiliani, V.
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sun, Y. J., Sebastian Espinosa, J., Hoseini, M. S., Stryker, M. P. Experience-dependent structural plasticity at pre- and postsynaptic sites of layer 2/3 cells in developing visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21812-21820 (2019).
- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Reid, R. C. Chronic cellular imaging of mouse visual cortex during operant behavior and passive viewing. Front Cell Neurosci. 4, 3 (2010).
- Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. Elife. 5, 14472 (2016).
- Puścian, A., Benisty, H., Higley, M. J. NMDAR-dependent emergence of behavioral representation in primary visual cortex. Cell Rep. 32 (4), 107970 (2020).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo. imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Seaton, G., et al. Dual-component structural plasticity mediated by αCaMKII autophosphorylation on basal dendrites of cortical layer 2/3 neurones. J Neurosci. 40 (11), 2228-2245 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: Imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (52), 18739-18744 (2014).
- Buxhoeveden, D. P., Casanova, M. F.
- Chen, S., et al. Miniature fluorescence microscopy for imaging brain activity in freely-behaving animals. Neurosci Bull. 36 (10), 1182-1190 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), e55579 (2017).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), 88678 (2014).
- Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. J Neurophysiol. 115 (6), 2852-2866 (2016).
- Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomed Opt Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Wenzel, M., Hamm, J. P., Peterka, D. S., Yuste, R. Reliable and elastic propagation of cortical seizures in. Cell Rep. 19 (13), 2681-2693 (2017).
- Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging. Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).
- Barson, D., Hamodi, A. S. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nat Methods. 17 (1), 107-113 (2020).
- Paquelet, G. E., et al. Single-cell activity and network properties of dorsal raphe nucleus serotonin neurons during emotionally salient behaviors. Neuron. 110 (16), 2664-2679 (2022).
- Yang, Q., et al. Transparent microelectrode arrays integrated with microprisms for electrophysiology and simultaneous two-photon imaging across cortical layers. bioRxiv. , (2022).
- Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences. Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).
- Zong, W., et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods. 18 (1), 46-49 (2021).
- Engelbrecht, C. J., et al. Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Opt Express. 16 (8), 5556-5564 (2008).
- Suzuki, M., Aru, J., Larkum, M. E. Double-μ Periscope, a tool for multilayer optical recordings, optogenetic stimulations or both. Elife. 10, 72894 (2021).
- Stibůrek, M., et al. 110 μm thin endo-microscope for deep-brain in vivo observations of neuronal connectivity, activity and blood flow dynamics. Nat Commun. 14 (1), 1897 (2023).
