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Neuroscience

स्वतंत्र रूप से चलती और सिर-तय जानवरों में माइक्रोप्रिज्म का उपयोग करके पहचाने गए तंत्रिका आबादी की दीर्घकालिक इमेजिंग

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/65387
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Ophthalmology, University College London

Summary

जब एक सिर-प्लेट और एक ऑप्टिकल डिज़ाइन के साथ एकीकृत किया जाता है, तो एकल और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप दोनों के साथ संगत होता है, माइक्रोप्रिज्म लेंस विभिन्न परिस्थितियों में एक ऊर्ध्वाधर स्तंभ में तंत्रिका प्रतिक्रियाओं को मापने में एक महत्वपूर्ण लाभ प्रस्तुत करता है, जिसमें सिर-निश्चित राज्यों में अच्छी तरह से नियंत्रित प्रयोग शामिल हैं या स्वतंत्र रूप से चलने वाले जानवरों में प्राकृतिक व्यवहार कार्य।

Abstract

बहु फोटॉन माइक्रोस्कोपी और आणविक प्रौद्योगिकियों की प्रगति के साथ, प्रतिदीप्ति इमेजिंग तेजी से संरचना का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण बनने के लिए बढ़ रहा है, कार्य, और जीवित मस्तिष्क के ऊतकों की plasticity. पारंपरिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की तुलना में, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तंत्रिका गतिविधि के साथ-साथ कोशिकाओं की आकृति विज्ञान को पकड़ सकती है, जिससे एकल-कोशिका या उपकोशिकीय संकल्प पर पहचाने गए न्यूरॉन आबादी की दीर्घकालिक रिकॉर्डिंग सक्षम हो सकती है। हालांकि, उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए आमतौर पर एक स्थिर, सिर-निश्चित सेटअप की आवश्यकता होती है जो जानवर की गति को प्रतिबंधित करता है, और पारदर्शी ग्लास की एक सपाट सतह की तैयारी एक या अधिक क्षैतिज विमानों पर न्यूरॉन्स के दृश्य की अनुमति देती है, लेकिन ऊर्ध्वाधर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने में सीमित है विभिन्न गहराई में चल रहा है। यहां, हम एक हेड प्लेट निर्धारण और एक माइक्रोप्रिज्म को संयोजित करने की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं जो बहुपरत और मल्टीमॉडल इमेजिंग देता है। यह सर्जिकल तैयारी न केवल माउस दृश्य प्रांतस्था के पूरे स्तंभ तक पहुंच प्रदान करती है, बल्कि एक सिर-निश्चित स्थिति में दो-फोटॉन इमेजिंग और स्वतंत्र रूप से चलती प्रतिमान में एक-फोटॉन इमेजिंग की अनुमति देती है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, कोई भी विभिन्न कॉर्टिकल परतों में पहचाने गए सेल आबादी का नमूना ले सकता है, सिर-तय और स्वतंत्र रूप से चलती राज्यों के तहत अपनी प्रतिक्रियाओं को पंजीकृत कर सकता है, और महीनों में दीर्घकालिक परिवर्तनों को ट्रैक कर सकता है। इस प्रकार, यह विधि माइक्रोक्रिकिट्स की एक व्यापक परख प्रदान करती है, जो अच्छी तरह से नियंत्रित उत्तेजनाओं द्वारा और एक प्राकृतिक व्यवहार प्रतिमान के तहत विकसित तंत्रिका गतिविधियों की प्रत्यक्ष तुलना को सक्षम करती है।

Introduction

विवो दो फोटॉन फ्लोरोसेंट इमेजिंग 1,2 में आगमन, ऑप्टिकल सिस्टम और आनुवंशिक रूप से संशोधित प्रतिदीप्ति संकेतक में नई प्रौद्योगिकियों के संयोजन, जटिल संरचना, कार्य, और जीवित मस्तिष्क 3,4 में plasticity की जांच करने के लिए तंत्रिका विज्ञान में एक शक्तिशाली तकनीक के रूप में उभरा है. विशेष रूप से, इस इमेजिंग साधन न्यूरॉन्स 5,6,7,8की पहचान न्यूरॉन्स की लंबी अवधि ट्रैकिंग की सुविधा है, जिससे आकृति विज्ञान और न्यूरॉन्स की गतिशील गतिविधियों दोनों पर कब्जा करके पारंपरिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पर एक अद्वितीय लाभ प्रदान करता है.

अपनी उल्लेखनीय ताकत के बावजूद, उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति इमेजिंग के आवेदन अक्सर एक स्थिर, सिर तय सेटअप है कि पशु की गतिशीलता 9,10,11 विवश की आवश्यकता होती है. इसके अतिरिक्त, न्यूरॉन्स कल्पना के लिए एक पारदर्शी कांच की सतह का उपयोग एक या एक से अधिक क्षैतिज विमानों के लिए टिप्पणियों को प्रतिबंधित करता है, ऊर्ध्वाधर प्रक्रियाओं की गतिशीलता की खोज को सीमित करता है जो विभिन्न कॉर्टिकल गहराई12 में विस्तारित होता है।

इन सीमाओं को संबोधित करते हुए, वर्तमान अध्ययन एक अभिनव शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की रूपरेखा तैयार करता है जो मल्टीलेयर और मल्टीमॉडल क्षमताओं के साथ इमेजिंग मोडैलिटी बनाने के लिए हेड प्लेट फिक्सेशन, माइक्रोप्रिज्म और मिनिस्कोप को एकीकृत करता है। माइक्रोप्रिज्म कॉर्टिकल कॉलम 13,14,15,16 के साथ ऊर्ध्वाधर प्रसंस्करण के अवलोकन की अनुमति देता है, जो यह समझने में महत्वपूर्ण है कि जानकारी कैसे संसाधित होती है और रूपांतरित होती है क्योंकि यह प्रांतस्था की विभिन्न परतों के माध्यम से चलती है और प्लास्टिक परिवर्तनों के दौरान ऊर्ध्वाधर प्रसंस्करण कैसे बदल जाती है। इसके अलावा, यह एक सिर-तय प्रतिमान में और एक स्वतंत्र रूप से चलती सेटिंग में एक ही तंत्रिका आबादी की इमेजिंग की अनुमति देता है, जिसमें बहुमुखी प्रयोगात्मक सेटिंग्स 17,18,19शामिल हैं: उदाहरण के लिए, सिर-निर्धारण अक्सर संवेदी धारणा मूल्यांकन और 2-फोटॉन प्रतिमान के तहत स्थिर रिकॉर्डिंग जैसे अच्छी तरह से नियंत्रित प्रतिमानों के लिए आवश्यक होता है, जबकि स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ना व्यवहार अध्ययन के लिए अधिक प्राकृतिक, लचीला वातावरण प्रदान करता है। इसलिए, दोनों तरीकों में प्रत्यक्ष तुलना करने की क्षमता लचीली, कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं को सक्षम करने वाले माइक्रोक्रिकिट्स की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है।

संक्षेप में, प्रतिदीप्ति इमेजिंग में सिर प्लेट निर्धारण, microprism, और miniscope के एकीकरण मस्तिष्क की संरचना और कार्यक्षमता की पेचीदगियों की जांच के लिए एक आशाजनक मंच प्रदान करता है. शोधकर्ता सभी कॉर्टिकल परतों में फैले विभिन्न गहराई में पहचाने गए सेल आबादी का नमूना ले सकते हैं, सीधे अच्छी तरह से नियंत्रित और प्राकृतिक प्रतिमानों दोनों में उनकी प्रतिक्रियाओं की तुलना कर सकते हैं, और20 महीने में उनके दीर्घकालिक परिवर्तनों की निगरानी कर सकते हैं। यह दृष्टिकोण मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है कि ये तंत्रिका आबादी विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत समय के साथ कैसे बातचीत करती है और बदलती है, तंत्रिका सर्किट की गतिशील प्रकृति में एक खिड़की प्रदान करती है।

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Protocol

सभी प्रयोग यूके एनिमल्स (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम 1986 के अनुसार यूके होम ऑफिस द्वारा अनुमोदित और जारी किए गए व्यक्तिगत और परियोजना लाइसेंस के तहत उचित नैतिकता समीक्षा के बाद आयोजित किए गए थे। वयस्क ट्रांसजेनिक लाइनें CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE21 को प्रतिबंधित किया गया था और प्रयोग में उनकी संतानों का उपयोग किया गया था। प्रयोगकर्ताओं की सुरक्षा और बाँझ स्थितियों के रखरखाव के लिए, सभी प्रक्रियाओं को सड़न रोकनेवाला स्थितियों के तहत और पूर्ण व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ किया गया था।

1. प्री-ऑपरेटिव तैयारी

  1. एडिमा को कम करने के लिए, डेक्सामेथासोन (0.2 मिलीग्राम/किग्रा) को चमड़े के नीचे, सर्जरी से 12-24 घंटे पहले प्रशासित करें।
  2. एक आटोक्लेव में सभी सर्जिकल उपकरणों को स्टरलाइज़ करें और सर्जरी से पहले आसुत जल और 70% इथेनॉल के साथ स्थिर हाइपोक्लोरस एसिड के साथ सर्जिकल क्षेत्र को निष्फल करें। सुनिश्चित करें कि सभी सर्जिकल उपकरण चालू हैं।
  3. 5% की प्रेरण खुराक के साथ आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके पशु (24 सप्ताह पुराना, पुरुष वजन 31 ग्राम) को एनेस्थेटाइज करें, जो माउस स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर होने के बाद 1% -2% तक कम हो जाता है, ओ2 के साथ 1-2 एल / मिनट के बीच रखा जाता है। NSAIDs (कारप्रोफेन, 2.5 मिलीग्राम/किग्रा) को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
  4. संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करने के लिए पैर की अंगुली-चुटकी पलटा की अनुपस्थिति के लिए जाँच करें (यदि पलटा देखा जाए तो 0.5% वेतन वृद्धि में आइसोफ्लुरेन एकाग्रता में वृद्धि)।
  5. जानवर के सिर को शेव करें, ट्रिमर का उपयोग करके, कानों के पीछे से आंखों के थोड़ा ऊपर तक। इस क्षेत्र को अल्कोहल वाइप और पोविडोन-आयोडीन समाधान से साफ करें, यह सुनिश्चित करें कि जानवर की आंखों के संपर्क से बचें।
  6. होमोथर्मिक हीटिंग पैड और कान और दांत सलाखों के साथ फिट स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर जानवर माउंट और सिर सुरक्षित. सुनिश्चित करें कि सिर स्थिर है, क्योंकि निम्नलिखित प्रक्रिया के सफल होने के लिए यह महत्वपूर्ण है (चित्र 1)।
  7. सर्जरी के दौरान उन्हें सूखने से रोकने के लिए जानवर की आंखों पर नेत्र मरहम लागू करें और उन्हें प्रकाश से बचाने के लिए पन्नी के साथ कवर करें। एक बाँझ शल्य चिकित्सा कवर के साथ पशु को कवर.

Figure 1
चित्रा 1: पूर्व ऑपरेशन की तैयारी। माउस को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर रखा गया है, जो नाक के टुकड़े और कान की सलाखों द्वारा सुरक्षित है। माउस एक तापमान विनियमित गर्म पैड पर रखा गया है. आंखों पर नेत्र मरहम होता है और एल्यूमीनियम पन्नी द्वारा कवर किया जाता है। सिर मुंडा है, और खोपड़ी उजागर हुई है। जानवर के ऊपर एक बाँझ आवरण रखा जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. क्रैनियोटॉमी

  1. सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, खोपड़ी को उजागर करने के लिए सिर के मुंडा क्षेत्र की मध्य रेखा के साथ त्वचा को उकसाएं।
  2. किसी भी संयोजी ऊतक (चित्रा 2 ए) को हटाने के लिए 1-3 एस के लिए एक बाँझ कपास झाड़ू और पतला हाइड्रोजन पेरोक्साइड (3% डब्ल्यू / वी 35% एच2ओ 2 97% डीएच2ओ में) का उपयोग करके खोपड़ी को साफ करें। 70% इथेनॉल की बूंद और एक नया बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग खोपड़ी सूखी.
  3. एक सटीक आरोपण साइट सुनिश्चित करने के लिए खोपड़ी पूर्वकाल/पीछे (एपी) और औसत दर्जे का/पार्श्व (एमएल) संरेखित करें। ऐसा करने के लिए, ब्रेग्मा और लैम्ब्डा दोनों पर खोपड़ी की पृष्ठीय (डीवी) गहराई को मापें और सुनिश्चित करें कि दोनों के बीच का अंतर <0.03 मिमी है। औसत दर्जे के संरेखण के लिए, मिडलाइन से दोनों पार्श्विका हड्डियों पर समान दूरी के बिंदुओं को मापें और फिर से सुनिश्चित करें कि डीवी अंतर <0.03 मिमी है।
  4. मूल के रूप में ब्रेग्मा का उपयोग करना, वांछित कॉर्टिकल क्षेत्र को ढूंढें और चिह्नित करें; यहां, ये मोनोकुलर प्राइमरी विजुअल कॉर्टेक्स (V1), AP: -3.5 मिमी, ML: -2.5 मिमी हैं।
  5. कॉर्टेक्स को बेनकाब करने के लिए ट्रेफिन ड्रिल बिट (1.8 मिमी व्यास) और डेंटल ड्रिल (10,000 आरपीएम गति) का उपयोग करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि वांछित कॉर्टिकल क्षेत्र (मोनोकुलर वी 1) के लिए निशान ड्रिल-बिट विंडो के निचले तीसरे हिस्से में स्थित है।
    1. सुनिश्चित करें कि ड्रिल बिट का कोण खोपड़ी की वक्रता के लंबवत है। यह एक समान क्रैनियोटॉमी सुनिश्चित करेगा और ड्यूरा या कॉर्टेक्स को नुकसान से बचाएगा।
    2. प्रतिरोध में कमी होने तक ड्रिल करें और फिर रुकें (चित्र 2बी)। ध्यान से एक 23 जी सुई टिप (चित्रा 2 सी) का उपयोग कर अलग हड्डी टुकड़ा हटा दें.
    3. किसी भी मलबे को हटाने और होने वाले किसी भी रक्तस्राव को रोकने के लिए ठंड कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ) में संतृप्त सर्जिकल फोम के साथ उजागर प्रांतस्था को साफ करें।
    4. सर्जरी के दौरान कोल्ड एसीएसएफ का उपयोग करके हमेशा उजागर कॉर्टेक्स को हाइड्रेटेड रखें।

Figure 2
चित्रा 2: क्रैनियोटॉमी। (ए) ब्रेग्मा और लैम्ब्डा के बीच त्वचा चीरा दिखाया गया है। संयोजी ऊतक को उजागर सतह से हटा दिया गया है। (बी) हड्डी के टुकड़े को हटाने से पहले ट्रेफिन ड्रिल द्वारा क्रैनियोटॉमी। (सी) हड्डी के टुकड़े को हटाने के बाद क्रैनियोटॉमी, बरकरार ड्यूरा और प्रांतस्था दिखा रहा है (स्केल बार 0.5 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. प्री-कट चीरा

नोट: प्रीकट चीरा करते समय विचार करने के लिए, चीरा और माइक्रोप्रिज्म आरोपण को ब्याज के इमेजिंग क्षेत्र (आरओआई) के पूर्वकाल होने की आवश्यकता होगी। यह देखने के पूर्ण और सटीक क्षेत्र की अनुमति देना है। इस प्रोटोकॉल के संदर्भ में, चीरा औसत दर्जे की धुरी के साथ किया जाएगा, और माइक्रोप्रिज्म पीछे के मुख (चित्रा 3 बी) का सामना करना पड़ उन्मुख है।

  1. सम्मिलन के साथ मदद करने के लिए और माइक्रोप्रिज्म के सम्मिलन के दौरान प्रांतस्था में दबाव को कम करने के लिए, एक चीरा बनाएं।
  2. सर्जिकल चाकू को स्टीरियोटैक्सिक आर्म होल्डर से संलग्न करें और ब्लेड या स्टीरियोटैक्सिक आर्म को उन्मुख करें ताकि यह एमएल अक्ष के साथ कट जाए।
  3. चाकू को वांछित एपी समन्वय (एपी: -3.4 मिमी) पर ले जाएं; प्रिज्म आरओआई के सामने होना आवश्यक है, इसलिए इमेजिंग आरओआई एपी समन्वय (-3.5 मिमी) के चीरा 100 माइक्रोन पूर्वकाल बनाएं।
  4. अब चाकू को क्रैनियोटॉमी के औसत दर्जे के किनारे पर ले जाएं, जहां यह खोपड़ी से मिलता है, धीरे-धीरे चाकू को तब तक कम करें जब तक कि यह हड्डी तक न पहुंच जाए और फिर रुक जाए। हड्डी मोटाई 200 माइक्रोन है के रूप में, कुल प्रविष्टि गहराई (5.1 5.1 गणना देखें) में इस मान को शामिल करें.
  5. इष्टतम इमेजिंग प्रिज्म के केंद्र में है, यानी 500 माइक्रोन; इसलिए, सुनिश्चित करें कि यह गहराई कॉर्टिकल कॉलम गहराई (आरओआई डीवी: - 0.35 मिमी) के साथ संरेखित हो।
    1. गहराई की गणना में खोपड़ी की मोटाई को शामिल करते हुए, नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करें, जो यह निर्धारित करता है कि खोपड़ी की सतह से पूर्व-कट चीरा कितना गहरा होना चाहिए। इस प्रोटोकॉल के लिए, आरोपण की गहराई के रूप में गणना की है:
      हड्डी की मोटाई (200 माइक्रोन) + इमेजिंग आरओआई (जैसे, 350 माइक्रोन) + शेष माइक्रोप्रिज्म गहराई (500 माइक्रोन) = 1,050 माइक्रोन
  6. सुनिश्चित करें कि चीरा की लंबाई 1 मिमी से अधिक है लेकिन अत्यधिक नहीं है; इसलिए, 1.2 मिमी की दूरी आदर्श है, जिसमें मोनोकुलर एमएल समन्वय इस दूरी के बीच में है।
  7. चीरा प्रदर्शन करने के लिए तैयार होने पर, अतिरिक्त एसीएसएफ को हटा दें ताकि दृष्टि अस्पष्ट न हो(चित्रा 3ए)।
    1. चाकू को क्रैनियोटॉमी के औसत दर्जे के किनारे से चीरा के शुरुआती औसत दर्जे का समन्वय करने के लिए ले जाएं। धीरे-धीरे (10 माइक्रोन /
    2. एक बार जब ड्यूरा छेद हो जाता है और चाकू प्रांतस्था में प्रवेश कर जाता है, तो चीरा के दौरान ऊतक को चिकनाई और हाइड्रेटेड रखने के लिए प्रांतस्था पर ठंडे एसीएसएफ की एक बूंद लागू करें।
  8. एक बार अंतिम गहराई तक पहुँच गया है, एमएल अक्ष (10 माइक्रोन / एस की दर से) के साथ चाकू चलती शुरू.
    1. चीरा बनाया जा रहा है के रूप में आसपास के ऊतक का अवलोकन रखें. यदि ऊतक चाकू के साथ खींच रहा है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए चाकू को कुछ बार ऊपर और नीचे ले जाएं कि ऊतक काटा जा रहा है, और फिर बाद में जारी रखें, चाकू को अपनी अंतिम गहराई पर वापस रखना याद रखें।
  9. पूरा होने पर, धीरे-धीरे चाकू उठाएं। यदि चीरे के दौरान रक्त निकलता है, तो इस समय का उपयोग रक्त को पतला करने और चीरे के भीतर किसी भी रक्त को बाहर धकेलने के लिए एसीएसएफ-भिगोए गए सर्जिकल फोम के साथ चीरा साइट को साफ करने के लिए करें। माइक्रोप्रिज्म डालने के लिए तैयार होने तक उजागर प्रांतस्था पर एक ताजा, संतृप्त सर्जिकल फोम छोड़ना याद रखें।

Figure 3
चित्रा 3: माइक्रोप्रिज्म प्रत्यारोपण। (ए) पूर्व कट चीरा। (बी) कॉर्टेक्स (सी) के भीतर अपनी स्थिति का प्रदर्शन करने वाले एकीकृत माइक्रोप्रिज्म लेंस का योजनाबद्ध कॉर्टेक्स में सम्मिलन से पहले पूर्व-कट चीरा के लिए सही अभिविन्यास में एकीकृत माइक्रोप्रिज्म लेंस (स्केल बार 0.5 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है)। (डी) खोपड़ी के लगाव को सुरक्षित करने के लिए एकीकृत लेंस के चारों ओर सीमेंट निर्माण का उदाहरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. माइक्रोप्रिज्म सम्मिलन और हेड प्लेट आरोपण

  1. माइक्रोप्रिज्म लेंस लेंस के बाहर के छोर पर एक प्रिज्म से जुड़े एक ग्रेडिएंट इंडेक्स लेंस से बना होता है, जिसे बेसप्लेट में एकीकृत किया जाता है। माइक्रोप्रिज्म को इम्प्लांट किट में संलग्न करें।
  2. सुनिश्चित करें कि प्रिज्म का इमेजिंग पक्ष बेसप्लेट स्क्रू के विपरीत है। माइक्रोप्रिज्म के सम्मिलन और प्लेसमेंट में मदद करने के लिए, इसे स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में संलग्न करें और प्रिज्म को उन्मुख करें ताकि यह चीरा(चित्रा 3सी)के साथ संरेखित हो।
  3. धीरे-धीरे चीरा साइट (10 माइक्रोन / शुरू में प्रिज्म डालने पर एसीएसएफ को हटाने के लिए याद रखें, लेकिन एक बार प्रांतस्था में, सम्मिलन को चिकनाई करने के लिए ठंडे एसीएसएफ के साथ फ्लश करें।
    1. प्रांतस्था स्थिर रहना चाहिए जबकि प्रिज्म चीरा में उतारा जाता है; यदि नहीं, तो अतिरिक्त एसीएसएफ जोड़ें और प्रिज्म से प्रांतस्था को ढीला करने के लिए प्रिज्म को ऊपर और नीचे ले जाकर प्रांतस्था को उत्तेजित करें।
  4. एक बार अंतिम गहराई तक पहुँच गया है, बाँझ ऊतक का उपयोग उजागर cortical सतह सूखी, प्रिज्म को छूने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा.
  5. प्रिज्म के आस-पास के उजागर कॉर्टिकल क्षेत्र को कवर करें, साथ ही लेंस, सिलिकॉन चिपकने की एक सुरक्षात्मक परत के साथ, आसपास की खोपड़ी और डमी स्कोप पर अतिरिक्त चिपकने को कम करें।
  6. एक बार ठीक हो जाने पर (5-10 मिनट), सिर-तय इमेजिंग के दौरान सिर को स्थिर करने के लिए हेडप्लेट को खोपड़ी से जोड़ दें।
    1. सुनिश्चित करें कि हेडप्लेट पर्याप्त पीछे है ताकि प्रत्यारोपण के प्लेसमेंट में हस्तक्षेप न करें और प्रत्यारोपण को ठीक से सुरक्षित करने के लिए सीमेंट के पर्याप्त आवेदन की अनुमति दें।
    2. सुनिश्चित करें कि हेडप्लेट की मिडलाइन प्रत्यारोपित लेंस के थोड़ा सही है यह सुनिश्चित करने के लिए कि हेडप्लेट के दोनों किनारों को सिर-तय प्रयोगों को करते समय सिर-चरण में सुरक्षित किया जा सकता है
  7. हेडप्लेट और खोपड़ी पर चिपकने वाला सीमेंट लागू करें।
    1. मिश्रण माध्यम की 4 बूंदों के साथ अपारदर्शी सीमेंट पाउडर के 1 स्कूप मिश्रण और उत्प्रेरक की एक बूंद लागू करके चिपकने वाला दंत सीमेंट तैयार करें।
    2. हेडप्लेट और खोपड़ी दोनों पर सीमेंट रखें और हेडप्लेट को ठीक होने तक पकड़ें, यह सुनिश्चित करें कि यह कान की सलाखों के समानांतर है (दृश्य परीक्षा के माध्यम से, जानवर के सिर के ऊपर और पीछे दोनों का निरीक्षण करें)।
  8. उजागर खोपड़ी और ऊतक के बाकी हिस्सों को कवर करने के लिए चिपकने वाला सीमेंट लागू करें, माइक्रोप्रिज्म (बेसप्लेट के आधार तक) और हेडप्लेट को शामिल करें।
  9. बेसप्लेट, डमी माइक्रोस्कोप या उसके किसी भी घटक पर सीमेंट न लें। चिपकने वाला सीमेंट तब तक लगाते रहें जब तक कि माइक्रोप्रिज्म और हेडप्लेट कवर न हो जाएं और स्थिर न हो जाएं (चित्र 3डी)।
  10. जब सीमेंट ठीक हो गया है, तो संदंश के साथ माइक्रोप्रिज्म को स्थिर करते हुए स्टीरियोटैक्सिक हाथ को धीरे-धीरे ऊपर की ओर ले जाकर डमी माइक्रोस्कोप को अलग करें (वे मैग्नेट के माध्यम से जुड़े हुए हैं, इसलिए अलगाव के दौरान कुछ प्रतिरोध महसूस किया जा सकता है)।
  11. लेंस पर सुरक्षात्मक आवरण डालें और इसे जगह पर सुरक्षित करने के लिए स्क्रू को कस लें।
  12. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से जानवर निकालें, इसे गर्म रिकवरी बॉक्स में ठीक करने की अनुमति दें, और गर्म बाँझ 0.9% खारा चमड़े के नीचे (शरीर के वजन का 3%) प्रशासित करें।
  13. एक बार जब जानवर जाग रहा है और आगे बढ़ रहा है, तो इसे वापस एक साफ एकल-घर वाले पिंजरे में रखें। पशु की निगरानी करें और एनाल्जेसिया पर स्थानीय संस्थान की नीति के अनुसार अतिरिक्त पोस्ट-सर्जरी एनाल्जेसिया का प्रशासन करें।
  14. सर्जरी के बाद 4 सप्ताह तक प्रतीक्षा करें, पशु इमेजिंग के लिए तैयार होना चाहिए।

5. स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में कॉर्टिकल परतों की एक-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग

नोट: इरादा इमेजिंग विमान के सटीक अधिग्रहण को सुनिश्चित करने के लिए हर बार मूल इमेजिंग सत्र से कब्जा कर लिया छवियों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. इन पहचाने गए स्थलों, न्यूरॉन्स के साथ, प्रोटोकॉल के चरण 9 में विस्तार से वर्णित संरेखण प्रक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एक-फोटॉन डेटा प्राप्त करते समय, मिनिस्कोप इमेजिंग सिस्टम और लेजर स्रोत दोनों होता है। उत्तेजना उद्देश्य सामने की सतह पर 0-2 mW/mm2 की पावर रेंज के साथ एलईडी का उपयोग करती है। लेजर GCaMP सिग्नलिंग के लिए 455 ± 8nm (नीली रोशनी) की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करता है। लेंस फोकस स्लाइडर का उपयोग फ़ोकस (Z अक्ष) को समायोजित करने के लिए किया जा सकता है, जिसे इंटरफ़ेस पर 0-1000 के रूप में दर्शाया जाता है, जहाँ 0 0μm कार्य दूरी का प्रतिनिधित्व करता है, और 1000 अधिकतम 300μm कार्य दूरी का प्रतिनिधित्व करता है।

  1. डेटा प्राप्त करने से पहले, जानवर रिकॉर्डिंग सत्र से पहले 1 घंटे के लिए कमरे और खुले क्षेत्र के लिए acclimatize करते हैं.
  2. इमेजिंग से पहले, उचित कीटाणुनाशकों के साथ सब कुछ कीटाणुरहित और साफ करें (उदाहरण के लिए, आसुत जल और 70% इथेनॉल के साथ हाइपोक्लोरस एसिड को स्थिर करें)।
  3. DAQ बॉक्स को कंप्यूटर से कनेक्ट करके और डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर लॉन्च करके सेट करें। गिराए गए फ्रेम को कम करने के लिए एक ईथरनेट केबल के माध्यम से सीधा संबंध स्थापित करें; हालाँकि, वायरलेस कनेक्शन मोड वायरलेस कनेक्शन की सामर्थ्य के आधार पर पर्याप्त हो सकता है।
  4. एक कोमल कूड़ा के तहत जानवर के बेसप्लेट के लिए miniscope संलग्न करते हैं.
    1. सबसे पहले, सेट स्क्रू को हटाकर बेसप्लेट से सुरक्षात्मक आवरण को हटा दें। संदंश के साथ अपने एपर्चर द्वारा कवर पकड़ो. फिर, मिनीस्कोप को बेसप्लेट से जोड़ दें, जहां कवर बैठता है।
    2. इसे स्थापित करने से पहले बेसप्लेट के संबंध में मिनिस्कोप के उन्मुखीकरण की जांच करें ताकि पेंच के अंकन के साथ पक्ष, पेंच का सामना करे।
    3. एक बार मिनिस्कोप संलग्न हो जाने के बाद, इसे स्थिर करने के लिए सेट स्क्रू को कस लें। केवल सेट स्क्रू को तब तक आगे बढ़ाएं जब तक कि कुछ प्रतिरोध महसूस न हो जाए। सेट स्क्रू को ओवरटाइट करने से मिनिस्कोप को संभावित रूप से नुकसान होगा और इस प्रकार इससे बचा जाना चाहिए।
  5. मिनिस्कोप को DAQ बॉक्स से कनेक्ट करें और रिकॉर्डिंग के लिए सॉफ्टवेयर तैयार करें।
    1. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, मिनिस्कोप के लिए स्ट्रीम चालू करें और देखने के स्पष्ट क्षेत्र(चित्रा 4ए)को प्राप्त करने के लिए रिकॉर्डिंग मापदंडों (इमेजिंग फ्रेम दर, लाभ, एलईडी पावर, ईफोकस मान) को समायोजित करें।
    2. हिस्टोग्राम विंडो चालू करें और लाभ और एलईडी पावर को समायोजित करें ताकि दर्ज की गई तीव्रता 35% से 70% के बीच बैठती है।
    3. यदि एक अनुदैर्ध्य अध्ययन का संचालन करते हैं, तो पिछले सत्र में ली गई रिकॉर्डिंग या स्नैपशॉट देखें और ईफोकस मान को समायोजित करें ताकि एक ही इमेजिंग विमान स्पष्ट रूप से देखा जा सके।
  6. प्रयोग और डेटा अधिग्रहण शुरू करें।
  7. प्रयोग के पूरा होने के बाद, व्यवहार तंत्र से पशु को हटा दें।
    1. एक कोमल कूड़ा के तहत, सेट पेंच ढीला और जानवर के बेसप्लेट से miniscope हटा दें.
    2. बेसप्लेट पर सुरक्षात्मक आवरण लौटाएं और इसे सेट स्क्रू के साथ स्थिर करें।
  8. अपने घर पिंजरे के लिए पशु लौटें (एक फोटॉन डेटा को संसाधित करने के लिए चाहते हैं तो कदम 7 के लिए आगे बढ़ना).

Figure 4
चित्रा 4: सॉफ्टवेयर के साथ डेटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण। (ए) मिनिस्कोप से वास्तविक समय स्ट्रीम दिखाने वाली एक छवि। लेंस फोकस मान को समायोजित करने की अनुशंसा की जाती है, ताकि स्ट्रीमिंग विंडो में एक स्पष्ट दृश्य देखा जा सके, साथ ही लाभ और इमेजिंग लेजर पावर (बी) योजनाबद्ध ग्राफ अलग-अलग समय बिंदुओं पर दर्ज सत्रों के लिए अनुशंसित संरेखण वर्कफ़्लो को दर्शाता है। डेटा प्रोसेसिंग सॉफ़्टवेयर के निर्देशों का पालन करते हुए, पहले सत्र से एक औसत छवि उत्पन्न करने की अनुशंसा की जाती है। इस छवि निम्नलिखित सत्रों के लिए गति सुधार के दौरान संदर्भ छवि के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. (सी) एक ही अधिकतम-अनुमानित ΔF/F छवि से चार कोशिकाओं के उदाहरण। पिक्सेल में अपने सेल व्यास को मापने के लिए प्रत्येक सेल में एक नारंगी रेखा खींची जाती है, जिसका औसत सेल पहचान एल्गोरिथ्म के लिए इनपुट तर्क के रूप में लिया जाता है (ऊपर बाएं: 13, ऊपर दाएं: 11, नीचे बाएं: 12, नीचे दाएं: 13)। (डी)मैनुअल क्यूरेशन (छवि फसल) के बाद सेल पहचान एल्गोरिथ्म का आउटपुट। सफेद रूपरेखा पहचान की कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व (स्केल बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

6. सिर-तय चूहों में कॉर्टिकल परतों के दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग

नोट: दो-फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के लिए, प्रकाश स्रोत 920 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ एक ट्यून करने योग्य अल्ट्राफास्ट लेजर है। उद्देश्य पर मापा उत्तेजना शक्ति, आम तौर पर 100-150 मेगावाट के बीच था और प्रतिदीप्ति के समान स्तर को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक सत्र में समायोजित. उत्सर्जन प्रकाश को एक उत्सर्जन फिल्टर (525/70 एनएम) द्वारा फ़िल्टर किया गया था और एक स्वतंत्र फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (पीएमटी) द्वारा मापा गया था, जिसे ग्रीन चैनल कहा जाता है। छवियों को 20x वायु विसर्जन उद्देश्य (एनए = 0.45, 6.9-8.2 मिमी काम करने की दूरी) के साथ अधिग्रहित किया गया था।

  1. डेटा प्राप्त करने से पहले, पहले के दिनों में तंत्र के लिए जानवर को अभ्यस्त करें (जानवर को व्यवहार सेटअप के साथ सहज बनाने के लिए)। पशु 2-3 दिनों के लिए, एक दिन 15-30 मिनट खर्च करने के लिए अनुमति दें, सेटअप की खोज या जब तक वे डेटा अधिग्रहण शुरू करने से पहले प्राकृतिक व्यवहार प्रदर्शित.
  2. दो-फोटॉन इमेजिंग सिस्टम चालू करें, अधिग्रहण सॉफ्टवेयर लॉन्च करें, और लेजर को चालू करें। सुनिश्चित करें कि लेजर बंद हैं और जारी रखने से पहले पीएमटी बंद हैं।
  3. आसुत जल और 70% इथेनॉल के साथ स्थिर हाइपोक्लोरस एसिड के साथ स्वच्छ दो-फोटॉन इमेजिंग उपकरण।
  4. जानवर के आकार फिट करने के लिए उपकरण को समायोजित करना सुनिश्चित करें। धीरे माउस और उसके हेडप्लेट को हेड-स्टेज सेटअप में संलग्न करें और माउस के सिर को स्थिर करने के लिए इसे जगह में पेंच करें।
  5. एक बार संलग्न होने के बाद, लेंस कवर को हटा दें (चरण 5.4.1 देखें), और उद्देश्य को संरेखित करें ताकि यह बेसप्लेट के ऊपर हो।
  6. कॉर्टिकल ऊतक को ध्यान में लाने के लिए एपिफ्लोरेसेंस और XYZ चरण नियंत्रण का उपयोग करें।
  7. एक बार cortical परतों दिखाई दे रहे हैं, खुर्दबीन स्विच दो फोटॉन इमेजिंग (dichroic दर्पण के लिए दर्पण बाहर स्वैप, फ्लोरोसेंट शटर बंद करें, और epifluorescence लेजर और मॉनिटर बंद कर देते हैं). इतनी के रूप में इमेजिंग जब PMTs की रक्षा के लिए मुख्य रोशनी बंद करने के लिए सुनिश्चित करें.
  8. अधिग्रहीत छवि फ़ाइलों को अनुकूलित करने के लिए पैरामीटर सेट करें।
    1. कैल्शियम इमेजिंग के लिए गुंजयमान अधिग्रहण मोड का उपयोग करें क्योंकि यह GCaMP संकेतों की तेजी से फायरिंग को पकड़ सकता है।
    2. लेजर शक्ति, पीएमटी लाभ, ज़ूम, और देखो तालिकाओं (एलयूटी) समायोजित करने के लिए एक इष्टतम छवि प्राप्त करने के लिए और एक फोटॉन छवि का संदर्भ सुनिश्चित करें कि सही फोकल विमान imaged किया जा रहा है.
    3. सिंक्रनाइज़ व्यवहार निगरानी और उत्तेजना आदानों (यदि लागू हो) के साथ दो फोटॉन प्रणाली के साथ cortical परतों की इमेजिंग शुरू.
    4. इन अधिग्रहण मापदंडों और XYZ दूरियों को सहेजना सुनिश्चित करें यदि समय के साथ समान छवियों को पुन: पेश करना चाहते हैं।
  9. कॉर्टिकल परतों के जेड-स्टैक को पकड़ने के लिए, नीचे वर्णित चरणों का पालन करें।
    1. जेड-स्टैक शुरू करने के लिए विमान ढूंढें, छवि को अनुकूलित करने के लिए अधिग्रहण मापदंडों को समायोजित करें, और इसे सॉफ्टवेयर पर शुरुआती बिंदु के रूप में चिह्नित करें।
    2. अगला, Z नियंत्रण का उपयोग करके, स्टैक को नीचे ले जाएं, केवल स्टैक की निरंतर चमक बनाए रखने के लिए लेजर पावर को समायोजित करें, और सॉफ्टवेयर पर स्टैक के अंत को चिह्नित करें।
    3. महत्वपूर्ण कदम: लेजर पावर ग्रेडिएंट टैब के तहत रिलेटिव एक्सपोनेंशियल ग्रेडिएंट विकल्प का उपयोग करके, सॉफ्टवेयर को लेजर पावर में वृद्धि की गणना करने की अनुमति दें क्योंकि यह जेड-स्टैक के माध्यम से चलता है। सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान की गई तालिका में समापन बिंदु लेजर पावर मानों को चिह्नित करना सुनिश्चित करें ताकि इसे ढाल की गणना करने की अनुमति मिल सके।
    4. एक बार जेड-स्टैक पैरामीटर सेट हो जाने के बाद, चरण आकार (माइक्रोन) समायोजित करें।
      नोट: चरण आकार लिया गया समय, स्लाइस की संख्या और स्टैक की विस्तार गुणवत्ता निर्धारित करेगा। छोटे चरण आकारों के परिणामस्वरूप लंबे समय तक अधिग्रहण का समय, स्लाइस की संख्या में वृद्धि और बड़े चरण आकार की तुलना में बेहतर विवरण होगा। जेड-स्टैक का उपयोग एक-फोटॉन और दो-फोटॉन छवियों के पंजीकरण में सहायता के लिए किया जाता है, क्योंकि वे किसी भी शारीरिक स्थलों या विशेषताओं को उजागर करेंगे।
  10. न्यूरॉन्स में कैल्शियम परिवर्तन की एक समय श्रृंखला (टी श्रृंखला) प्राप्त करने के लिए, XYZ चरण नियंत्रण का उपयोग कर एक इष्टतम फोकल विमान खोजने के लिए और लेजर शक्ति, पीएमटी लाभ, ज़ूम, और LUTs समायोजित.
    1. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर टी श्रृंखला टैब के तहत, एक फोटॉन इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर प्राप्त डेटा मिलान करने के लिए अधिग्रहण आवृत्ति मापदंडों को परिभाषित करें.
      नोट: आवृत्ति का मिलान 1P और 2P डेटा को तुलनीय बना देगा, और यह डेटा प्रोसेसिंग चरणों में उपयोग किए जाने वाले सेल पहचान एल्गोरिदम के लिए बेहतर अनुकूल है। टी-सीरीज़ अधिग्रहण में कई ट्रिगर और अन्य अधिग्रहण मोड शामिल किए जा सकते हैं।
  11. टी-सीरीज का अधिग्रहण शुरू करें।

7. एक-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग डेटा संसाधित करना

  1. एक-फोटॉन रिकॉर्डिंग फिल्मों के लिए, मिनिस्कोप सिस्टम के साथ आने वाले डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    1. सबसे पहले, स्थानिक और लौकिक डाउन-सैंपलिंग द्वारा फिल्म को पूर्व-संसाधित करें। आम तौर पर, दो के कारक द्वारा फिल्म के स्थानिक नीचे नमूना काफी गंभीर रूप से सेल पहचान सटीकता समझौता किए बिना प्रसंस्करण समय को कम होगा.
    2. अस्थायी डाउन-सैंपलिंग फैक्टर सेट करें ताकि फिल्म की फ्रेम दर को लगभग 10 हर्ट्ज तक लाया जा सके, जो निम्न चरणों में उपयोग किए जाने वाले सेल पहचान एल्गोरिदम के लिए अधिक उपयुक्त है।
    3. यदि एक ही इमेजिंग दिन पर कई फिल्में प्राप्त कर रहे हैं, तो फिल्मों को एक साथ संसाधित करने के लिए प्री-प्रोसेसिंग चरण से पहले एक समय श्रृंखला में संयोजित करें।
    4. वैकल्पिक: कम और उच्च स्थानिक आवृत्तियों को हटाने के लिए फिल्म के लिए एक स्थानिक बैंड-पास फ़िल्टर लागू करें, जिसके परिणामस्वरूप उच्च कंट्रास्ट वाली एक चिकनी फिल्म होती है।
  2. सॉफ्टवेयर की गति सुधार कार्यक्षमता का उपयोग करके फिल्म को पंजीकृत करें। यह फिल्म को पंजीकृत करता है और इमेजिंग सतह के सापेक्ष मिनिस्कोप के आंदोलन के कारण गति कलाकृतियों के लिए सही करता है।
    1. महत्वपूर्ण कदम: यदि एक अनुदैर्ध्य अध्ययन का आयोजन करते हैं, तो फिल्मों को देखने के एक ही क्षेत्र में पंजीकृत करें, उदाहरण के लिए, पहले इमेजिंग दिन(चित्रा 4बी)पर ली गई फिल्म की औसत छवि।
    2. संबंधित टैब का उपयोग करके फिल्म के ΔF/F की गणना करें और ΔF/F फिल्म की अधिकतम प्रक्षेपण छवि उत्पन्न करने के लिए फिल्म को प्रोजेक्ट करें। यह छवि उन क्षेत्रों को दिखाएगी जो प्रतिदीप्ति के स्तर, संभावित रूप से व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में परिवर्तन प्रदर्शित करते हैं, और इसका उपयोग न्यूरॉन्स(चित्रा 4सी)के औसत व्यास को मापने के लिए किया जा सकता है।
    3. वैकल्पिक रूप से, गति सही फिल्म, जहां न्यूरॉन्स स्पष्ट प्रतिदीप्ति दिखाने पर सेल व्यास को मापें.
  3. सॉफ्टवेयर में एल्गोरिदम का उपयोग करके कोशिकाओं को पहचानें।
    1. जबकि इस चरण में दो विकल्प (पीसीए-आईसीए और सीएनएमएफ-ई) उपलब्ध हैं, इस अध्ययन के लिए सीएनएमएफ-ई का उपयोग करें। पिक्सेल में औसत सेल व्यास इनपुट और सेल की तरह गतिविधियों को प्रदर्शित करता है कि ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) युक्त सेल सेट उत्पन्न करने के लिए एल्गोरिथ्म चलाने.
    2. मैन्युअल रूप से आरओआई का चयन करें जो कोशिकाएं हैं (सेल जैसी आकृति विज्ञान, और गतिविधि22,23 है, और एफओवी के भीतर झूठ बोलते हैं) उन लोगों से जो नहीं हैं, और क्यूरेटेड सेल सेट(चित्रा 4डी)को मान्य करते हैं।
  4. आगे के विश्लेषण के लिए प्रत्येक आरओआई के कैल्शियम निशान निर्यात करें।

8. प्रसंस्करण दो फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग डेटा

  1. दो-फोटॉन रिकॉर्डिंग फिल्मों के लिए, दो-फोटॉन कैल्शियम विश्लेषण डेटा को संसाधित करने के लिए डिज़ाइन किए गए पायथन पैकेज का उपयोग करें।
  2. सबसे पहले, टी-सीरीज़ में ली गई छवियों को नीचे वर्णित अनुसार .tiff स्टैक में संयोजित करें।
    1. रन विकल्प इंटरफ़ेस के तहत, ताऊ मान और फ्रेम दर सहित मापदंडों को समायोजित करें, ताकि यह उपयोग किए गए GCaMP और रिकॉर्डिंग की फ्रेम दर से मेल खाए।
    2. वैकल्पिक: मूवी रजिस्टर करने के लिए do_registration पैरामीटर को 1 पर सेट करें. यह ऊपर वर्णित गति सुधार चरण के बराबर है।
    3. वैकल्पिक: प्रतिदीप्ति गतिशीलता के अलावा शारीरिक सुविधाओं का उपयोग कर आरओआई का पता लगाने के लिए 1 के लिए anatomical_only पैरामीटर सेट करें। इसके लिए सेल व्यास के इनपुट की आवश्यकता होती है, इसलिए इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके माप लें। यह आम तौर पर अनुशंसित है, क्योंकि यह अधिक प्राकृतिक आकृतियों (चित्रा 5ए-सी) के साथ आरओआई उत्पन्न करता है।
    4. एक बार सभी पैरामीटर सेट हो जाने के बाद, एल्गोरिथ्म चलाएं ताकि यह सभी गणनाओं को एक साथ करे। प्रगति की जाँच करने के लिए ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस (GUI) देखें।
    5. एक बार यह किया जाता है, सेल पहचान परिणामों के मैनुअल क्यूरेशन के लिए सेल चयन इंटरफ़ेस पर लौटें।
  3. फिल्म के अधिकतम प्रक्षेपण के शीर्ष पर क्यूरेटेड सेल सेट की एक छवि सहेजें। इसका उपयोग बाद में एक-फोटॉन रिकॉर्डिंग डेटा को पंजीकृत करने के लिए संदर्भ छवि के रूप में किया जाएगा।
  4. एल्गोरिथ्म तब परिणामों को स्वचालित रूप से सहेजता है। npy प्रारूप, जिसे बाद में पायथन के साथ एक्सेस किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, अन्य सॉफ़्टवेयर में आगे के विश्लेषण के लिए परिणामों को अन्य स्वरूपित फ़ाइलों में सहेजें।

Figure 5
चित्रा 5: दो-फोटॉन प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सेल पहचान। (ए) दो-फोटॉन प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर से ली गई सेल पहचान की प्रतिनिधि छवि। पैरामीटर Anatomical_only 0 पर सेट करना लेकिन अन्य सभी मापदंडों को समान रखना, कई गैर-कोशिकाएं धराशायी रेखाओं के बीच के क्षेत्र में मौजूद हैं जो वास्तविक कोशिकाओं के मैनुअल क्यूरेशन में हस्तक्षेप करती हैं। (बी) से लिए गए सेल व्यास माप के उदाहरण (ए), एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (ऊपर बाएं; 7.5 पिक्सेल, ऊपर दाएं; 9, नीचे बाएं; 6.5, नीचे दाएं; 7.5) का उपयोग कर। (सी) सेल पहचान की प्रतिनिधि छवि। पैरामीटर Anatomical_only 1 पर सेट करते समय और सेल व्यास एल्गोरिथ्म में (बी) से लिए गए औसत सेल व्यास को इनपुट करते समय, धराशायी लाइनों के बीच के क्षेत्र में कोई सेल मौजूद नहीं होती है (स्केल बार 200 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

9. इमेजिंग तौर-तरीकों में पहचाने गए सेल सेटों का पंजीकरण

  1. मल्टीमॉडल छवि पंजीकरण और विश्लेषण एल्गोरिथ्म (एमआईआरए) के साथ एक-फोटॉन और दो-फोटॉन रिकॉर्डिंग से पहचानी गई कोशिकाओं का पंजीकरण करें, जो एक-फोटॉन इमेजिंग सॉफ्टवेयर के पायथन इंटरफ़ेस के माध्यम से उपलब्ध है।
    1. यह एल्गोरिथ्म गैर-कठोर पंजीकरण के माध्यम से एक-फोटॉन और दो-फोटॉन डेटा को संरेखित करता है। वेबसाइट पर पाए गए प्रदर्शन ऑनलाइन नोटबुक का सेट देखें और इस अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है।
      नोट: नोटबुक लिखे गए थे ताकि सभी प्रसंस्करण 1P सॉफ़्टवेयर में पूरा हो सकें और इस प्रकार 2P प्रोसेसिंग सॉफ़्टवेयर के साथ गैर-संगत हों। इसलिए, इस अध्ययन के लिए नोटबुक में कुछ चरणों का ही पालन करें।
  2. प्रदर्शन नोटबुक, जो प्रत्येक इमेजिंग साधन के लिए एक संरचनात्मक छवि उत्पन्न करने में शामिल में वर्णित चरणों के माध्यम से पालन करें. डिफ़ॉल्ट रूप से, इसमें दो-फोटॉन जेड-स्टैक का अधिकतम प्रक्षेपण और एक-फोटॉन रिकॉर्डिंग की एक औसत छवि उत्पन्न करना शामिल है। वैकल्पिक रूप से, दो फोटॉन रिकॉर्डिंग की एक मतलब छवि का उपयोग करें.
    1. जहां संकेत दिया जाता है, स्थानिक बैंडपास स्थलों को बेहतर ढंग से देखने के लिए छवियों को फ़िल्टर करते हैं और उन्हें पुन: पेश करते हैं ताकि वे मेल खाएं।
  3. दो छवियों (चित्रा 6 ए) पर मिलान स्थलों का चयन करें.
    1. दो छवियों को संरेखित करने के लिए आवश्यक ताना की गणना करने के लिए इनका उपयोग करें। सामान्य तौर पर, 3 से 5 स्थलचिह्न पर्याप्त होने चाहिए।
    2. एल्गोरिथ्म स्थलों और छवि समानता के संयोजन के आधार पर ताना की गणना करता है। संतोषजनक परिणाम प्राप्त होने तक दो कारकों को दिए गए सापेक्ष वजन के लिए अनुकूलन करें।
  4. दो-फोटॉन डेटा से संरेखित एक नया सेल मैप उत्पन्न करने के लिए एक-फोटॉन सत्र में अधिग्रहित सेल मैप को ताना दें।
    1. फिर पृष्ठभूमि में दो-फोटॉन फिल्म से अधिकतम प्रक्षेपण छवि के साथ एक छवि उत्पन्न करने के लिए 1P प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में इस विकृत सेल मानचित्र को आयात करें।
    2. पंजीकरण उद्देश्यों के लिए इस छवि को निर्यात करें।
  5. प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर में, अब तक उत्पन्न दो छवियों (दो-फोटॉन अधिकतम प्रक्षेपण छवि के शीर्ष पर दो-फोटॉन सेल मानचित्र) को संरेखित करें और दो-फोटॉन अधिकतम प्रक्षेपण छवि(चित्रा 6बी,सी)के शीर्ष पर एक-फोटॉन सेल मैप को ताना दें।
    1. ऐसा करने के लिए, इस अध्ययन के लिए, एक पंजीकरण अनुमानक एप्लिकेशन का उपयोग करें जो उपयोगकर्ता को विभिन्न पंजीकरण तकनीकों के परिणामों की तुलना करने की अनुमति देता है। यह देखते हुए कि दो छवियों की पृष्ठभूमि समान है, कठोर पंजीकरण के साथ चरण सहसंबंध तकनीक पर्याप्त थी।
  6. एक बार पंजीकरण पूरा हो जाने के बाद, आरओआई को ओवरलैप करने के लिए अब पंजीकृत छवि को स्कैन करें। ये आरओआई हैं जो दोनों रिकॉर्डिंग सत्रों में सक्रिय हैं, जिनका उपयोग आगे के विश्लेषण में किया जा सकता है।

Figure 6
चित्रा 6: मीरा वर्कफ़्लो का उपयोग कर पार साधन सेल पंजीकरण. (ए) सेल संरेखण वर्कफ़्लो से प्रतिनिधि छवि. एक-फोटॉन डेटा से माध्य छवि बाईं ओर दिखाई जाती है, और दो-फोटॉन डेटा से एक दाईं ओर दिखाया गया है। दोनों छवियों से मिलान स्थलों का चयन किया जाता है और एक यादृच्छिक रंग योजना (लाल घेरे) द्वारा सॉफ्टवेयर में लेबल किया जाता है। (बी) दो पहचाने गए सेल सेट, एक-फोटॉन (बैंगनी) और दो-फोटॉन (हरा) दिखाते हुए उदाहरण-संरेखित छवियां, दो-फोटॉन डेटा की औसत छवि पर मढ़ा जाता है। (सी) (बी) में सफेद बॉक्स के साथ चिह्नित क्षेत्र की छवि, गठबंधन कोशिकाओं को यहां ओवरलैप किए गए हरे और बैंगनी रूपरेखा के रूप में दर्शाया गया है। सभी पैनलों में, स्केल बार 200 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

कई हफ्तों की अवधि में एक ही न्यूरोनल आबादी के विवो कैल्शियम इमेजिंग में क्रोनिक मल्टीलेयर का संचालन करने की विधि, स्वतंत्र रूप से चलती और सिर-निश्चित स्थितियों के तहत, एक और दो-फोटॉन इमेजिंग तौर-तरीकों दोनों का उपयोग करके दिखाया गया है। यहां, एक-फोटॉन इमेजिंग के तहत मिलान न्यूरोनल आबादी की पहचान करने की क्षमता, जबकि जानवर ने अंधेरे में एक खुले क्षेत्र की खोज की, (चित्रा 7 ए) का प्रदर्शन किया गया है। कैल्शियम के निशान पहचाने गए न्यूरॉन्स से निकाले गए थे और तुलना के लिए जेड-स्कोर किया गया था(चित्रा 7बी)। न्यूरॉन्स ने सत्रों में प्रतिदीप्ति और फायरिंग दरों के तुलनीय स्तर दिखाए जो 3 सप्ताह अलग थे।

Figure 7
चित्रा 7: प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था से कैल्शियम गतिशीलता 3 सप्ताह तक फैले सत्रों में स्थिर रूप से पंजीकृत की जा सकती है। (ए) पहचाने गए न्यूरॉन्स के स्थानिक फिल्टर एक-फोटॉन के तहत देखने के एक ही क्षेत्र की तीन अलग-अलग रिकॉर्डिंग से अधिकतम प्रक्षेपण छवियों पर मढ़ा हुआ है, जो 3 सप्ताह की अवधि में फैला हुआ है। आरओआई को उस क्रम में लेबल किया जाता है जिस क्रम में वे (बी) में प्रस्तुत किए जाते हैं। दूसरे (मध्य) और तीसरे (दाएं) सत्रों में अंधेरे क्षेत्रों छवि पंजीकरण के परिणाम हैं, संदर्भ के रूप में पहले (बाएं) सत्र का उपयोग (स्केल बार 0.5 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है). (बी) जेड-पहले (बाएं), दूसरे (मध्य), और तीसरे (दाएं) सत्रों में पंजीकृत आरओआई की कैल्शियम गतिविधियों को (ए) में दिखाया गया है। क्षैतिज स्केल बार 10 s है, और ऊर्ध्वाधर स्केल बार 10 sd है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

इसके बाद, विभिन्न इमेजिंग तौर-तरीकों में एक न्यूरोनल आबादी के पंजीकरण का प्रदर्शन किया गया था। एक ही दिन में एक फोटॉन और दो फोटॉन इमेजिंग सत्र आयोजित किए गए थे। आरओआई को एक-फोटॉन डेटा से पहचाना गया और मैन्युअल रूप से सेल मैप(चित्रा 8ए)उत्पन्न करने के लिए क्यूरेट किया गया। इसी तरह, दो-फोटॉन डेटा को एक सेल मैप उत्पन्न करने के लिए संसाधित किया गया था जिससे कोशिकाओं को स्वचालित रूप से पहचाना जाता है और मैन्युअल रूप से प्रदर्शन के लिए चुना जाता है। फिर, एक-फोटॉन सत्र से माध्य प्रक्षेपण छवि को मीरा मंच(चित्रा 8बी)के साथ दो-फोटॉन जेड-स्टैक से अधिकतम प्रक्षेपण छवि के साथ संरेखित किया गया था। इस विकृत सेल मानचित्र को तब निर्यात किया गया था, दो-फोटॉन अधिकतम प्रक्षेपण छवि पर आरोपित किया गया था, और दो-फोटॉन सेल मैप(चित्रा 8सी)के साथ गठबंधन किया गया था। यह सेल पहचान के लिए अनुमति दी गई है जो दोनों इमेजिंग तौर-तरीकों (चित्रा 8 डी) के तहत एक ही कोशिकाओं की गतिविधियों को दिखाती है, जिसका उपयोग न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

Figure 8
चित्रा 8: प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था से कैल्शियम गतिशीलता विभिन्न इमेजिंग तौर-तरीकों के बीच पंजीकृत. (ए)एक फोटॉन, स्वतंत्र रूप से चलती सत्र से अधिकतम प्रक्षेपण छवि पर मढ़ा न्यूरॉन्स के स्थानिक फिल्टर. लेबल न्यूरॉन्स वे हैं जो सफलतापूर्वक (सी) में प्रस्तुत दो-फोटॉन रिकॉर्डिंग डेटा में पंजीकृत थे। (बी) (ए) में दिखाए गए समान आकृति को (सी) में दिखाए गए दो-फोटॉन सत्र डेटा से मेल खाने के लिए विकृत किया गया था। (सी) संरेखण (सफेद) के बाद (ए) में दिखाए गए आरओआई के स्थानिक फिल्टर, और आरओआई ने एक ही दिन (हरे) में दो-फोटॉन सिर-निश्चित रिकॉर्डिंग सत्र से 2 पी प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पहचान की, अधिकतम प्रक्षेपण छवि पर मढ़ा दो फोटॉन सत्र से। ओवरलैपिंग आरओआई को पंजीकृत माना जाता है और आगे के विश्लेषण के लिए चुना जाता है (स्केल बार 0.5 मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं)। (डी)एक-फोटॉन (बाएं) और दो-फोटॉन (दाएं) रिकॉर्डिंग सत्रों में पंजीकृत आरओआई की जेड-स्कोर कैल्शियम गतिविधियां (क्षैतिज स्केल बार 10 एस है, और ऊर्ध्वाधर स्केल बार 10 एसडी है)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां, हमने एक ही तंत्रिका आबादी में सिर-तय और स्वतंत्र रूप से चलती स्थितियों में न्यूरॉन्स का निरीक्षण करने और सीधे तुलना करने की क्षमता दिखाई है। जबकि हम दृश्य प्रांतस्था में आवेदन का प्रदर्शन किया, इस प्रोटोकॉल अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों, दोनों cortical क्षेत्रों और गहरी नाभिक 24,25,26,27,28, साथ ही अन्य डेटा अधिग्रहण और व्यवहार सेटअप29,30 की एक भीड़ के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदमों पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है क्योंकि वे इष्टतम डेटा अधिग्रहण की अनुमति देते हैं। सबसे पहले, जेड-स्टैक करते समय, पूरे समय लगातार चमक बनाए रखना महत्वपूर्ण है। जैसा कि पहले वर्णित है, प्रकाश अधिक ऊतक को बिखेर देगा जिसे उसे घुसना होगा; इस प्रकार, लाभ में वृद्धि करके, लेजर में ऊतक को और अधिक भेदने और हमारे आरओआई को उत्तेजित करने में सक्षम होने की अधिक शक्ति होती है। हालांकि, गहरे ऊतक में आरओआई को उत्तेजित करने के लिए आवश्यक लाभ पर जेड-स्टैक शुरू करने की सलाह नहीं दी जाती है, क्योंकि इससे फ्लोरोसेंट संरचनाओं और फोटोटॉक्सिसिटी का ओवरएक्सपोजर होगा और प्रांतस्था की सतह पर ऊतक को ब्लीच कर सकता है। इसलिए, सापेक्ष घातीय ढाल विकल्प का चयन करने से सॉफ्टवेयर को जेड-स्टैक के हर चरण में इष्टतम होने में सक्षम होने के लिए आवश्यक शक्ति के स्थिर ढाल की गणना करने की अनुमति मिलती है। दूसरे, समय के साथ सेल सेट के लगातार पंजीकरण के साथ मदद करने के लिए अगले महत्वपूर्ण कदम पहले एक फोटॉन इमेजिंग सत्र पर लिया फिल्म की मतलब छवि को बचाने के लिए सुनिश्चित करने के लिए है. यह उपयोगकर्ता सेल सेट और डेटा अधिग्रहण में निरंतरता सुनिश्चित करने के लिए मूल छवि के लिए किसी भी बाद इमेजिंग सत्र की तुलना करने के लिए अनुमति देता है.

यह हल्के लघु दो फोटॉन माइक्रोस्कोप स्वतंत्र रूप से जानवरों का व्यवहार में उच्च संकल्प इमेजिंग की अनुमति देते हैं, जो31,32, डिजाइन किया गया है कि ध्यान देने योग्य है. हालांकि यह विवो इमेजिंग में उच्च-रिज़ॉल्यूशन के लिए एक रोमांचक प्रगति पर प्रकाश डालता है, प्रतिबंधित फील्ड-ऑफ-व्यू (एफओवी) और अत्यधिक विशिष्ट डिज़ाइन इसे सामान्य अंत-उपयोगकर्ताओं के लिए चुनौतीपूर्ण बनाते हैं। जिस विधि का हमने वर्णन किया है, वह वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं से आसानी से उपलब्ध कई अच्छी तरह से स्थापित प्लेटफार्मों को एकीकृत करती है, जिससे यह एक सुलभ विकल्प बन जाता है। सिद्धांत रूप में, यह भी एक खुले स्रोत miniscope और एक सामान्य दो फोटॉन माइक्रोस्कोप33,34 के साथ संगत एक अनुकूलित, स्वयं इकट्ठे microprism के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है.

बहरहाल, इस प्रोटोकॉल को सटीक माइक्रोप्रिज्म आरोपण जैसी चुनौतियों का सामना करना पड़ता है क्योंकि त्रुटियों से गैर-व्यवहार्य एफओवी हो सकता है और परिणामस्वरूप, डेटा से समझौता किया जा सकता है। इमेजिंग अधिग्रहण के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न उद्देश्यों के कारण विभिन्न तौर-तरीकों में लगातार एफओवी बनाए रखना भी चुनौतीपूर्ण है। हालांकि, जैसा कि माइक्रोप्रिज्म के XY अक्ष तय रहते हैं, FOV में भिन्नता Z अक्ष के साथ होती है; इसलिए, दोनों इमेजिंग मोड (जैसे रक्त वाहिकाओं, कॉर्टिकल ऊतक में कलाकृतियों, और समान न्यूरॉन्स) में मौजूद विशिष्ट स्थलों को एफओवी को सिंक्रनाइज़ करने के लिए नियोजित किया जाता है। इसके अलावा, विभिन्न तौर-तरीकों के तहत एक ही न्यूरॉन्स को संरेखित करने और पहचानने के लिए पंजीकरण लागू करना महत्वपूर्ण है। जागरूक होने के लिए एक और चुनौती दोनों तौर-तरीकों में अधिग्रहण के दौरान GCaMP ऊतक के फोटोब्लीचिंग को कम करना है। इसलिए, रिकॉर्डिंग में बिताए गए समय की मात्रा को कम करना महत्वपूर्ण है, सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अनुकूलित करें (एलईडी/लेजर पावर के बजाय लाभ बढ़ाकर), और इमेजिंग सत्रों के बीच 24-48 घंटे प्रतीक्षा करें।

इन अंतर्निहित जटिलताओं के बावजूद, हमारे प्रोटोकॉल, जब सर्जिकल परिशुद्धता और उपयुक्त छवि प्रसंस्करण तकनीकों के साथ निष्पादित किया जाता है, तो तंत्रिका गतिविधियों की तुलना करने के लिए एक मजबूत मंच प्रदान करता है। यह सख्ती से नियंत्रित कार्यों और स्वतंत्र रूप से चलने वाले राज्यों में सिर-निश्चित राज्यों के बीच तुलना करने में सक्षम बनाता है जो अधिक प्राकृतिक व्यवहारों की नकल करते हैं, इस प्रकार तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में संभावित अनुप्रयोगों का विस्तार करते हैं।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम सुश्री चारू रेड्डी और प्रोफेसर माटेओ कारंडिनी (कॉर्टेक्स लैब) को सर्जिकल प्रोटोकॉल और ट्रांसजेनिक माउस स्ट्रेन को साझा करने पर उनकी सलाह के लिए धन्यवाद देते हैं। हम सर्जरी के विकास के माध्यम से उनके मार्गदर्शन और सहायता के लिए डॉ नॉर्बर्ट होग्रेफ (इंस्कोपिक्स) को धन्यवाद देते हैं। हम सर्जिकल सेटअप और डेटा प्रोसेसिंग के साथ उनकी सहायता के लिए सुश्री एंड्रिया एल्डिया (सन लैब) को धन्यवाद देते हैं। इस काम को मूरफील्ड्स आई चैरिटी द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml Dechra 20091607 Saline for hydration and drug reconsitution
18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur FST 18004-18 Drill bit
1ml syringe Terumo MDSS01SE 1ml syringe
23G x 5/8 inch 6% LUER needle Terumo NN-2316R 23G needle
71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software RWD - RWD
Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) Surgispon SSP-101010 gel-foam
Alcohol pads 70% isopropyl alcohol Braun 9160612 Alcohol pads
Aluminium foil Any retailer - Foil to cover eyes during surgery
Articifical Cerebrospinal Fluid  Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand 3525/25ML ACSF
Automated microinjection pump WPI 8091
Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml Videne/Ecolab 3030440 Betadine
Bruker Ultime 2Pplus (customised) Bruker - Two-photon imaging system 
Cardiff Aldasorber Vet-Tech AN006 Anaesthesia absorber
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC Nikon MRH48230 20x objective lens
Compact Anaesthesia system - single gas - isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit Vet-Tech AN001 Compact anaesthesia system 
Contec Prochlor  Aston Pharma AP2111L1 Disinfectant (hypochlorous acid)
Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 Hikma Covetrus:70789 Dexamethasone
Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel Fine Science Tools 10055-12 Knife for incisino of cortex
Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars Stoelting 51649 Ear bar
Dummy microscope Inscopix Dummy microscope To help with implantation
Ethanol (100%)  VWR 40-1712-25 Used to make 70% ethanol 
Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III FischerScientific 17182182 Gloves
Homeothermic Monitor 50-7222-F Harvard Apparatus 50-7222-F Homeothermic monitoring system/heating pad
Image processing software ImageJ - Image processing software
Inscopix Data Processing Software (IDPS) Inscopix - One-photon calcium imaging processing software
Insight Duals-232, S/N 2043 InSight Insight Spectra X3 Two-photon imaging laser
IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation Zoetis WM 42058/4195 Isoflurane
Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive World Precision Intruments (WPI) KWIK-SIL Silicone adhesive
MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E PROXXON NO 28 515 Handheld drill
nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package Inscopix - One-photon Imaging system and software
ProView Implant Kit Inscopix ProView Implant Kit Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment 
ProView Prism Probe Inscopix 1050-002203 Microprism lens
Rimadyl (50mg/ml) Zoetis VM 42058/4123 Carprofen 
Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp WPI PZMTIII-AAC  Microscope
Super-Bond Universal kit, SUN Medical Prestige-Dental K058E Adhesive cement
Two-photon calcium image software Suite2P - Two-photon calcium imaging processing software
Vapouriser Vet-Tech - Isoflurane vapouriser
Xailin Lubricating Eye Ointment 5g Xailin-Night MLG/28/1551 Ophthalmic ointment 

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References

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Burrows, R., Ma, C. H., Sun, Y. J. Long-Term Imaging of Identified Neural Populations using Microprisms in Freely Moving and Head-Fixed Animals. J. Vis. Exp. (203), e65387, doi:10.3791/65387 (2024).

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