Summary
Når den integreres med en hodeplate og en optisk design som er kompatibel med både enkelt- og to-foton mikroskoper, gir mikroprismelinsen en betydelig fordel ved måling av nevrale responser i en vertikal kolonne under forskjellige forhold, inkludert velkontrollerte eksperimenter i hodefaste tilstander eller naturlige atferdsoppgaver i fritt bevegelige dyr.
Abstract
Med utviklingen av multi-foton mikroskopi og molekylær teknologi, vokser fluorescensavbildning raskt til å bli en kraftig tilnærming for å studere strukturen, funksjonen og plastisiteten til levende hjernevev. Sammenlignet med konvensjonell elektrofysiologi kan fluorescensmikroskopi fange nevral aktivitet så vel som morfologien til cellene, noe som muliggjør langsiktige opptak av de identifiserte nevronpopulasjonene ved enkeltcelle- eller subcellulær oppløsning. Imidlertid krever høyoppløselig avbildning vanligvis et stabilt, hodefast oppsett som begrenser dyrets bevegelse, og fremstillingen av en flat overflate av gjennomsiktig glass tillater visualisering av nevroner på ett eller flere horisontale plan, men er begrenset til å studere de vertikale prosessene som går over forskjellige dybder. Her beskriver vi en prosedyre for å kombinere en hodeplatefiksering og et mikroprisme som gir flerlags og multimodal avbildning. Dette kirurgiske preparatet gir ikke bare tilgang til hele kolonnen i musens visuelle cortex, men tillater to-foton avbildning i en hodefast stilling og en-foton avbildning i et fritt bevegelig paradigme. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan man prøve identifiserte cellepopulasjoner over forskjellige kortikale lag, registrere deres svar under hodefaste og fritt bevegelige tilstander, og spore de langsiktige endringene over måneder. Dermed gir denne metoden en omfattende analyse av mikrokretsene, noe som muliggjør direkte sammenligning av nevrale aktiviteter fremkalt av velkontrollerte stimuli og under et naturlig atferdsparadigme.
Introduction
Fremkomsten av in vivo to-foton fluorescerende avbildning 1,2, som kombinerer de nye teknologiene i optiske systemer og genetisk modifiserte fluorescensindikatorer, har dukket opp som en kraftig teknikk innen nevrovitenskap for å undersøke den intrikate strukturen, funksjonen og plastisiteten i den levende hjernen 3,4. Spesielt gir denne bildemodaliteten en enestående fordel i forhold til tradisjonell elektrofysiologi ved å fange både morfologi og dynamiske aktiviteter av nevroner, og dermed legge til rette for langsiktig sporing av identifiserte nevroner 5,6,7,8.
Til tross for sine bemerkelsesverdige styrker, krever anvendelsen av høyoppløselig fluorescensavbildning ofte et statisk, hodefast oppsett som begrenser dyrets mobilitet 9,10,11. I tillegg begrenser bruken av en gjennomsiktig glassoverflate for visualisering av nevroner observasjoner til ett eller flere horisontale plan, noe som begrenser utforskningen av dynamikken i vertikale prosesser som strekker seg over forskjellige kortikale dybder12.
For å adressere disse begrensningene, skisserer denne studien en innovativ kirurgisk prosedyre som integrerer hodeplatefiksering, mikroprisme og miniskop for å skape en avbildningsmodalitet med flerlags og multimodale evner. Mikroprismet tillater observasjon av den vertikale behandlingen langs den kortikale kolonnen 13,14,15,16, noe som er avgjørende for å forstå hvordan informasjon behandles og transformeres når den beveger seg gjennom forskjellige lag i cortex og hvordan den vertikale behandlingen endres under plastendringer. Videre tillater det avbildning av de samme nevrale populasjonene i et hodefiksert paradigme og i en fritt bevegelig setting, som omfatter de allsidige eksperimentelle innstillingene 17,18,19: for eksempel er hodefiksering ofte nødvendig for velkontrollerte paradigmer som sensorisk persepsjonsvurdering og stabile opptak under 2-foton paradigme, mens fritt bevegelige gir et mer naturlig, fleksibelt miljø for atferdsstudier. Derfor er evnen til å utføre en direkte sammenligning i begge modusene avgjørende for å fremme vår forståelse av mikrokretsene som muliggjør fleksible, funksjonelle responser.
I hovedsak tilbyr integreringen av hodeplatefiksering, mikroprisme og miniskop i fluorescensavbildning en lovende plattform for å undersøke vanskelighetene med hjernens struktur og funksjonalitet. Forskere kan prøve identifiserte cellepopulasjoner over ulike dybder som spenner over alle kortikale lag, direkte sammenligne deres svar i både velkontrollerte og naturlige paradigmer, og overvåke deres langsiktige endringer over måneder20. Denne tilnærmingen gir verdifull innsikt i hvordan disse nevrale populasjonene samhandler og endres over tid under forskjellige eksperimentelle forhold, og gir et vindu inn i nevrale kretsers dynamiske natur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble utført i henhold til UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 under personlige lisenser og prosjektlisenser godkjent og utstedt av UK Home Office etter passende etisk gjennomgang. Voksne transgene linjer CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE21 ble avlet og deres avkom brukt i forsøket. For eksperimentenes sikkerhet og vedlikehold av sterile forhold ble alle prosedyrene utført under aseptiske forhold og med fullt personlig verneutstyr.
1. Preoperativ forberedelse
- For å minimere ødem, administrer Dexamethason (0,2 mg / kg) subkutant, 12-24 timer før operasjonen.
- Steriliser alle kirurgiske verktøy i en autoklav og steriliser operasjonsområdet med stabilisert hypoklorsyre med destillert vann og 70% etanol før operasjonen. Forsikre deg om at alt kirurgisk utstyr er slått PÅ.
- Bedøv dyret (24 uker gammelt, hann som veier 31 g) med isofluran med en induksjonsdose på 5 %, som reduseres til 1 %-2 % når musen er på den stereotaksiske rammen, med O2 mellom 1-2 l/min. Injiser NSAIDs (Carprofen, 2,5 mg/kg) subkutant.
- Sjekk for fravær av tå-klype refleks for å vurdere dybden av anestesi (øke isofluran konsentrasjon i 0,5% trinn hvis refleks sett).
- Barber dyrets hode, ved hjelp av en trimmer, fra bak ørene til litt over øynene. Rengjør dette området med en alkoholserviett og povidon-jodløsning, og sørg for å unngå kontakt med dyrets øyne.
- Monter dyret på homeothermic varmepute og stereotaksisk ramme utstyrt med øre- og tenner barer og fest hodet. Sørg for at hodet er stabilt, da dette er avgjørende for at følgende prosedyre skal lykkes (figur 1).
- Påfør oftalmisk salve over dyrets øyne for å forhindre at de tørker under operasjonen og dekk dem med folie for å beskytte dem mot lys. Dekk dyret med et sterilt kirurgisk deksel.
Figur 1: Forberedelse før operasjon. Musen er plassert på den stereotaktiske rammen, sikret med et nesestykke og ørestenger. Musen er plassert på en temperaturregulert oppvarmet pute. Øyne har oftalmisk salve på dem og er dekket av aluminiumsfolie. Hodet er barbert, og skallen er utsatt. Et sterilt deksel er plassert over dyret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Kraniotomi
- Bruk kirurgisk saks, snitt huden langs midtlinjen av det barberte området av hodet for å avsløre skallen.
- Rengjør skallen med en steril bomullspinne og fortynnet hydrogenperoksid (3 % w/v på 35 %H2O2 tommer 97 % dH2O) i 1–3 s for å fjerne bindevev (figur 2A). Tørk skallen med en dråpe på 70% etanol og en ny steril bomullspinne.
- Juster skallen anteriort/posteriort (AP) og medialt/lateralt (ML) for å sikre et nøyaktig implantasjonssted. For å gjøre dette, måle dorsoventral (DV) dybden av skallen ved både bregma og lambda og sørg for at forskjellen mellom de to er <0,03 mm. For den mediolaterale justeringen måler du ekvivalente punkter på begge parietale bein fra midtlinjen og sikrer igjen at DV-forskjellen er <0,03 mm.
- Bruk bregma som opprinnelse, finn og merk ønsket kortikale område; her er disse monokulær primær visuell cortex (V1), AP: -3,5 mm, ML: -2,5 mm.
- Bruk et trefinbor (1,8 mm diameter) og tannbor (10 000 o/min) for å eksponere cortex, slik at merket for ønsket kortikale område (monokulær V1) er plassert i den nederste tredjedelen av borekronevinduet.
- Sørg for at vinkelen på borekronen er vinkelrett på krumningen av skallen. Dette vil sikre en jevn kraniotomi og vil forhindre skade på dura eller cortex.
- Bor til det er en nedgang i motstanden og stopp deretter (figur 2B). Fjern forsiktig det frittliggende benfragmentet med en 23G nålespiss (figur 2C).
- Rengjør den eksponerte cortex med kirurgisk skum mettet i kald kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) for å fjerne rusk og stoppe blødninger som kan oppstå.
- Hold alltid den eksponerte cortex hydrert, ved hjelp av kald ACSF, gjennom hele operasjonen.
Figur 2: Kraniotomi. (A) Hudsnitt mellom bregma og lambda er vist. Bindevev er fjernet fra den eksponerte overflaten. (B) Kraniotomi ved trefinbor før fjerning av beinfragmentet. (C) Kraniotomi etter fjerning av benfragment, som viser intakt dura og cortex (skala bar representerer 0,5 mm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Pre-cut snitt
MERK: For å bli vurdert når du utfører precut snittet, må snittet og mikroprismeimplantasjonen være fremre for bildeområdet av interesse (ROI). Dette er for å tillate et fullstendig og nøyaktig synsfelt. I sammenheng med denne protokollen vil snittet utføres langs den mediolaterale aksen, og mikroprismet er orientert mot bakre (figur 3B).
- For å hjelpe med innsettingen og for å lindre trykket i cortex under innsetting av mikroprisme, gjør et snitt.
- Fest den kirurgiske kniven til den stereotaktiske armholderen og orienter bladet eller den stereotaktiske armen slik at den skjærer langs ML-aksen.
- Flytt kniven til ønsket AP-koordinat (AP: -3,4 mm); prismet kreves for å være foran avkastningen, så gjør snittet 100 μm foran bildeavkastningen AP-koordinaten (-3,5 mm).
- Nå flytter kniven til den mediale kanten av kraniotomien, hvor den møter skallen, senk kniven sakte til den når beinet og stopp deretter. Siden bentykkelsen er 200 μm, innlemmes denne verdien i den totale innsettingsdybden (se beregning av trinn 5.1).
- Optimal avbildning er i sentrum av prismet, dvs. 500 μm; sørg derfor for at denne dybden stemmer overens med den kortikale kolonnedybden (ROI DV: - 0,35 mm).
- Innlemme tykkelsen på skallen i beregningen av dybde, bruk ligningen nedenfor, som bestemmer hvor dypt det forhåndskuttede snittet må være fra overflaten av skallen. For denne protokollen beregnes implantasjonsdybden som:
Bentykkelse (200 μm) + bildeavkastning (f.eks. 350 μm) + gjenværende mikroprismedybde (500 μm) = 1,050 μm
- Innlemme tykkelsen på skallen i beregningen av dybde, bruk ligningen nedenfor, som bestemmer hvor dypt det forhåndskuttede snittet må være fra overflaten av skallen. For denne protokollen beregnes implantasjonsdybden som:
- Sørg for at lengden på snittet er mer enn 1 mm, men ikke overdreven; Derfor er en avstand på 1, 2 mm ideell, med den monokulære ML-koordinaten midt i denne avstanden.
- Når du er klar til å utføre snittet, fjern overflødig ACSF slik at visjonen ikke er skjult (figur 3A).
- Flytt kniven fra den mediale kanten av kraniotomien til den første mediale koordinaten til snittet. Sakte (10 μm/s) senk kniven ned i cortex.
- Når dura er gjennomboret og kniven har kommet inn i cortex, påfør en dråpe kald ACSF på cortex for å holde vevet smurt og hydrert under snittet.
- Når den endelige dybden er nådd, begynner du å bevege kniven langs ML-aksen (med en hastighet på 10 μm / s).
- Fortsett å observere det omkringliggende vevet mens snittet blir gjort. Hvis vevet drar sammen med kniven, flytt kniven opp og ned noen ganger for å sikre at vevet blir kuttet, og fortsett deretter sideveis, husk å sette kniven tilbake til sin endelige dybde.
- Når du er ferdig, løft kniven sakte. Hvis det oppstår blod under snittet, bruk denne tiden til å rengjøre snittstedet med ACSF-gjennomvåt kirurgisk skum for å fortynne blodet og skyve blod i snittet ut. Husk å legge et friskt, mettet kirurgisk skum over den eksponerte cortex til du er klar til å sette inn mikroprismet.
Figur 3: Mikroprismeimplantasjon. (A) Pre-cut snitt. (B) Skjematisk fremstilling av den integrerte mikroprismelinsen som viser dens posisjon i cortex (C) Integrert mikroprismelinse i riktig retning for å forhåndsskjære snitt før innsetting i cortex (skala bar representerer 0,5 mm). (D) Eksempel på sementoppbygging rundt den integrerte linsen for å sikre festingen til skallen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Mikroprismeinnsetting og implantasjon av hodeplate
- Mikroprismelinsen består av en gradientindekslinse festet til et prisme i den distale enden av linsen, som er integrert i en baseplate. Fest mikroprismet til implantatsettet.
- Forsikre deg om at bildesiden av prismet er motsatt grunnplateskruen. For å hjelpe til med innsetting og plassering av mikroprismen, fest den til den stereotaksiske rammen og orienter prismet slik at det stemmer overens med snittet (figur 3C).
- Senk mikroprismet sakte ned i snittstedet (10 μm / s). Husk å fjerne ACSF når du først setter inn prismet, men en gang i cortex, skyll med kald ACSF for å smøre innsetting.
- Cortex skal forbli stabil mens prismet senkes ned i snittet; hvis ikke, legg til ekstra ACSF og agiter cortex ved å flytte prismet opp og ned for å løsne cortex fra prismet.
- Når den endelige dybden er nådd, tørk den eksponerte kortikale overflaten ved hjelp av sterilt vev, og vær forsiktig så du ikke berører prismet.
- Dekk det eksponerte kortikale området rundt prismet, så vel som linsen, med et beskyttende lag av silikonlim, og minimer overflødig lim på den omkringliggende skallen og dummy-omfanget.
- Når den er herdet (5-10 min), fest hodeplaten til skallen for å stabilisere hodet under hodefiksert avbildning.
- Forsikre deg om at hodeplaten er bakre nok til ikke å forstyrre implantatets plassering og for å tillate tilstrekkelig påføring av sement for å sikre implantatet ordentlig.
- Forsikre deg om at midtlinjen på hodeplaten ligger litt til høyre for implantert linse for å sikre at begge sider av hodeplaten kan festes til hodestadiet når du utfører hodefikserte eksperimenter
- Påfør selvklebende sement på hodeplaten og skallen.
- Forbered selvklebende dental sement ved å blande 1 skje ugjennomsiktig sementpulver med 4 dråper blandemedium og påføre en dråpe katalysatoren.
- Plasser sement på både hodeplaten og hodeskallen og hold hodeplaten på plass til den er herdet, slik at den er parallell med ørestengene (gjennom visuell undersøkelse, inspiser både ovenfra og bak dyrets hode).
- Påfør selvklebende sement for å dekke resten av den eksponerte skallen og vevet, som inneholder mikroprisme (opp til bunnen av grunnplaten) og hodeplaten.
- Ikke få sement på bunnplaten, dummymikroskopet eller noen av komponentene. Fortsett å påføre limsementet til mikroprismen og hodeplaten er dekket og er stabile (figur 3D).
- Når sementen har herdet, løsner du dummymikroskopet ved å bevege den stereotaktiske armen sakte oppover mens du stabiliserer mikroprismet med tang (de er forbundet gjennom magneter, derfor kan det føles noe motstand under separasjonen).
- Sett beskyttelsesdekselet på linsen og stram skruen for å feste den på plass.
- Fjern dyret fra den stereotaktiske rammen, la den komme seg i en varm gjenopprettingsboks, og administrer oppvarmet steril 0,9% saltvann subkutant (3% kroppsvekt).
- Når dyret er våkent og beveger seg, legg det tilbake i et rent bur. Overvåk dyret og administrer ytterligere analgesi etter operasjonen i henhold til den lokale institusjonens retningslinjer for analgesi.
- Vent i 4 uker etter operasjonen, dyret skal være klar til avbildning.
5. En-foton kalsiumavbildning av kortikale lag i fritt bevegelige mus
MERK: Det er viktig å bruke bilder tatt fra den opprinnelige bildebehandlingsøkten hver gang for å sikre nøyaktig innsamling av det tiltenkte bildeplanet. Disse identifiserte landemerkene, sammen med nevronene, spiller en kritisk rolle i justeringsprosessen beskrevet i detalj i trinn 9 i protokollen. Ved anskaffelse av en-foton data, er miniskopet både bildesystemet og laserkilden. Excitation bruker LED med et effektområde på 0-2 mW / mm2 på objektivets frontflate. Laseren bruker en eksitasjonsbølgelengde på 455 ± 8 nm (blått lys) for GCaMP-signalering. Glidebryteren for objektivfokus kan brukes til å justere fokus (Z-aksen), som er representert på grensesnittet som 0-1000, der 0 representerer en 0μm arbeidsavstand, og 1000 representerer maksimal 300μm arbeidsavstand.
- Før du samler inn data, la dyret akklimatisere seg til rommet og den åpne arenaen i 1 time før opptaksøkten.
- Før avbildning, desinfiser og rengjør alt med passende desinfeksjonsmidler (f.eks. stabilisert hypoklorsyre med destillert vann og 70% etanol).
- Sett opp DAQ-boksen ved å koble den til en datamaskin og starte datainnsamlingsprogramvaren. Opprett en direkte forbindelse via en Ethernet-kabel for å minimere tapte rammer; Den trådløse tilkoblingsmodusen kan imidlertid være tilstrekkelig, avhengig av styrken på den trådløse tilkoblingen.
- Fest miniskopet til dyrets grunnplate under en mild skrue.
- Fjern først beskyttelsesdekselet fra bunnplaten ved å skru ut settskruen. Hold dekselet med blenderåpningen med tang. Fest deretter miniskopet til bunnplaten, der dekselet sitter.
- Kontroller retningen til miniskopet i forhold til grunnplaten før du installerer den, slik at siden med skruens merke vender mot skruen.
- Når miniskopet er festet, stram settskruen for å stabilisere den. Bare før settskruen til litt motstand kan føles. Overstramming av settskruen vil potensielt skade miniskopet og bør derfor unngås.
- Koble miniskopet til DAQ-boksen og klargjør programvaren for opptak.
- I datainnsamlingsprogramvaren slår du på strømmen for miniskopet og justerer opptaksparametrene (bildebildefrekvens, forsterkning, LED-effekt, efokusverdi) for å oppnå et klart synsfelt (figur 4A).
- Slå på histogramvinduet og juster forsterkningen og LED-effekten slik at den registrerte intensiteten ligger mellom 35% og 70% .
- Hvis du utfører en longitudinell studie, kan du se på opptakene eller øyeblikksbildene som er tatt i en tidligere økt og justere efokusverdien slik at det samme bildeplanet ses tydelig.
- Start eksperimentet og datainnsamlingen.
- Etter at forsøket er fullført, fjern dyret fra atferdsapparatet.
- Under en mild skrue, løsne settskruen og fjern miniskopet fra dyrets grunnplate.
- Sett beskyttelsesdekselet tilbake på bunnplaten og stabiliser det med settskruen.
- Sett dyret tilbake til hjemmeburet (fortsett til trinn 7 hvis du vil behandle en-foton data).
Figur 4: Datainnsamling og prosessering med programvare. (A) Et bilde som viser sanntidsstrømmen fra miniskopet. Det anbefales å justere objektivets fokusverdi, slik at en klar visning vises i streamingvinduet, sammen med forsterkningen og bildelaserstyrken (B) Skjematisk graf som illustrerer den anbefalte justeringsarbeidsflyten for økter registrert på forskjellige tidspunkter. Det anbefales å generere et gjennomsnittlig bilde fra den første økten, i henhold til instruksjonene for databehandlingsprogramvaren. Dette bildet skal brukes som referansebilde under bevegelseskorrigering for de følgende øktene. (C) Eksempler på fire celler fra det samme maksprojiserte ΔF/F-bildet. En oransje linje tegnes over hver celle for å måle cellediameteren i piksler, hvis gjennomsnitt tas som et inndataargument for celleidentifikasjonsalgoritmen (øverst til venstre: 13, øverst til høyre: 11, nederst til venstre: 12, nederst til høyre: 13). (D) Utdata fra celleidentifikasjonsalgoritmen etter manuell kurering (bilde beskåret). Hvite konturer representerer de identifiserte cellene (skalalinjen representerer 100 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
6. To-foton kalsiumavbildning av kortikale lag i hodefaste mus
MERK: For to-foton laserskanningsmikroskopi er lyskilden en justerbar ultrafast laser med en eksitasjonsbølgelengde på 920 nm. Eksitasjonseffekt, målt ved målet, var vanligvis mellom 100-150 mW og justert i hver økt for å oppnå lignende nivåer av fluorescens. Emisjonslyset ble filtrert av et emisjonsfilter (525/70 nm) og målt av et uavhengig fotomultiplikatorrør (PMT), referert til som en grønn kanal. Bildene ble tatt med et 20x luftnedsenkingsmål (NA = 0,45, 6,9-8,2 mm arbeidsavstand).
- Før du anskaffer data, habituate dyret til apparatet i dagene før (for å få dyret til å bli komfortabelt med atferdsoppsettet). La dyret bruke 15-30 minutter om dagen, i 2-3 dager, utforske oppsettet eller til de viser naturalistisk oppførsel før de begynner datainnsamlingen.
- Slå på to-foton bildebehandlingssystemet, start innsamlingsprogramvare og slå laseren PÅ. Forsikre deg om at laserne er lukket og PMT-er er slått av før du fortsetter.
- Rengjør to-foton bildebehandlingsapparat med stabilisert hypoklorsyre med destillert vann og 70% etanol.
- Sørg for å justere apparatet slik at det passer til dyrets størrelse. Fest musen og hodeplaten forsiktig til hovedtrinnsoppsettet og skru den på plass for å stabilisere musens hode.
- Når det er festet, fjerner du objektivdekselet (se trinn 5.4.1) og justerer objektivet slik at det er over bunnplaten.
- Bruk epifluorescens- og XYZ-trinnkontrollene for å bringe kortikalvevet i fokus.
- Når de kortikale lagene er synlige, bytt mikroskopet for å tillate to-foton avbildning (bytt ut speilet for det dikroiske speilet, lukk fluorescerende lukkeren og slå av epifluorescenslaseren og skjermen). Sørg for å slå av hovedlysene for å beskytte PMT-ene når du bilder.
- Sett opp parametere for å optimalisere anskaffede bildefiler.
- Bruk resonansoppkjøpsmodus for kalsiumavbildning, da det kan fange opp rask avfyring av GCaMP-signaler.
- Juster lasereffekt, PMT-forsterkning, zoom og oppslagstabeller (LUT) for å få et optimalt bilde, og referer til en-fotonbildet for å sikre at riktig fokusplan blir avbildet.
- Begynn avbildning av kortikale lag med to-foton systemet med synkronisert atferdsovervåking og stimulusinnganger (hvis aktuelt).
- Sørg for å lagre disse anskaffelsesparametrene og XYZ-avstandene hvis du vil reprodusere identiske bilder over tid.
- For å fange en z-stabel av de kortikale lagene, følg trinnene beskrevet nedenfor.
- Finn flyet du vil starte z-stacken fra, juster oppkjøpsparametrene for å optimalisere bildet, og merk dette som utgangspunkt på programvaren.
- Deretter bruker du Z-kontrollen, flytter du ned i stabelen, justerer bare lasereffekten for å opprettholde en konstant luminans av stabelen, og markerer slutten på stabelen på programvaren.
- Kritisk trinn: Ved å bruke alternativet Relative Exponential Gradient under kategorien Laser Power Gradient , la programvaren beregne økningen i lasereffekt når den beveger seg gjennom z-stakken. Sørg for å markere endepunktlasereffektverdiene i tabellen som leveres av programvaren, slik at den kan beregne gradienten.
- Når z-stack-parametrene er angitt, justerer du trinnstørrelsen (μm).
MERK: Trinnstørrelsen bestemmer tiden, antall stykker og detaljkvaliteten til stabelen. Mindre trinnstørrelser vil resultere i lengre anskaffelsestid, en økning i antall stykker og bedre detaljer sammenlignet med større trinnstørrelse. Z-stacks brukes til å hjelpe til med registrering av en-foton og to-foton bilder, da de vil markere eventuelle anatomiske landemerker eller funksjoner.
- For å skaffe en tidsserie (T-serie) av kalsiumendringer i nevroner, finn et optimalt fokalplan ved hjelp av XYZ-trinnkontrollene og juster lasereffekten, PMT-forsterkning, zoom og LUT.
- Under kategorien T-serie i anskaffelsesprogramvaren definerer du parametere for innsamlingsfrekvens for å matche dataene som er oppnådd ved hjelp av ett-foton bildesystem.
MERK: Hvis du matcher frekvensen, blir 1P- og 2P-dataene sammenlignbare, og de passer bedre for celleidentifikasjonsalgoritmen som brukes i databehandlingstrinnene. Flere utløsere og andre anskaffelsesmoduser kan innlemmes i oppkjøpet i T-serien.
- Under kategorien T-serie i anskaffelsesprogramvaren definerer du parametere for innsamlingsfrekvens for å matche dataene som er oppnådd ved hjelp av ett-foton bildesystem.
- Begynn oppkjøpet av T-serien.
7. Behandling av en-foton kalsiumavbildningsdata
- For en-foton innspilling filmer, bruk databehandlingsprogramvaren som følger med miniskopsystemet.
- Først forhåndsbehandler du filmen med romlig og tidsmessig nedsampling. Generelt vil romlig nedsampling av filmen med en faktor på to redusere behandlingstiden betydelig uten å gå alvorlig ut over celleidentifikasjonsnøyaktigheten.
- Still inn tidsmessig samplingsfaktor slik at bildefrekvensen til filmen bringes ned til rundt 10 Hz, noe som er mer egnet for celleidentifikasjonsalgoritmen som brukes i de følgende trinnene.
- Hvis du anskaffer flere filmer på samme bildedag, kan du kombinere filmene til én tidsserie før forhåndsbehandlingstrinnet for å behandle dem sammen.
- Valgfritt: Bruk et romlig båndpassfilter på filmen for å fjerne de lavere og høyere romlige frekvensene, noe som resulterer i en jevnere film med høyere kontrast.
- Registrer filmen ved hjelp av bevegelseskorrigeringsfunksjonaliteten til programvaren. Dette registrerer filmen og korrigerer for bevegelsesartefakter forårsaket av miniskopets bevegelse i forhold til bildeoverflaten.
- Kritisk trinn: Hvis du gjennomfører en longitudinell studie, registrer filmene til samme synsfelt, for eksempel gjennomsnittsbildet av filmen tatt på den første bildedagen (figur 4B).
- Beregn ΔF/F for filmen ved hjelp av den tilsvarende kategorien, og projiser filmen for å generere et maksimalt projeksjonsbilde av ΔF/F-filmen. Dette bildet vil vise regioner som viser endringer i fluorescensnivåer, potensielt individuelle nevroner, og kan brukes til å måle gjennomsnittlig diameter av nevronene (figur 4C).
- Alternativt kan du måle cellediameteren på den bevegelseskorrigerte filmen, der nevronene viser tydelig fluorescens.
- Identifiser celler ved hjelp av algoritmene i programvaren.
- Mens to alternativer (PCA-ICA og CNMF-E) er tilgjengelige på dette trinnet, bruk CNMF-E for denne studien. Skriv inn gjennomsnittlig cellediameter i piksler og kjør algoritmen for å generere et cellesett som inneholder interesseområder (ROI) som viser cellelignende aktiviteter.
- Velg manuelt ROIer som er celler (har en cellelignende morfologi og aktivitet22,23, og ligger innenfor FOV) fra de som ikke er det, og valider det kuraterte cellesettet (figur 4D).
- Eksporter kalsiumsporene for hver avkastning for videre analyse.
8. Behandling av to-foton kalsiumavbildningsdata
- For to-foton opptaksfilmer, bruk en pythonpakke designet for å behandle to-foton kalsiumanalysedata.
- Kombiner først bildene tatt i en T-serie i en .tiff stabel som beskrevet nedenfor.
- Under Run-alternativgrensesnittet justerer du parametrene, inkludert tau-verdien og bildefrekvensen, slik at den samsvarer med GCaMP som brukes og bildefrekvensen til opptaket.
- Valgfritt: Sett parameteren do_registration til 1 for å registrere filmen. Dette tilsvarer bevegelseskorreksjonstrinnet beskrevet ovenfor.
- Valgfritt: Sett anatomical_only parameteren til 1 for å oppdage avkastning ved hjelp av de anatomiske egenskapene i tillegg til fluorescensdynamikken. Dette krever inntasting av cellediameter, så ta målinger ved hjelp av bildebehandlingsprogramvaren. Dette anbefales generelt, da det genererer avkastning med mer naturlige former (figur 5A-C).
- Når alle parametere er angitt, kjører du algoritmen slik at den utfører alle beregningene sammen. Se det grafiske brukergrensesnittet (GUI) for å kontrollere fremdriften.
- Når det er gjort, gå tilbake til cellevalggrensesnittet for manuell kurering av celleidentifikasjonsresultatene.
- Lagre et bilde av det kuraterte cellesettet over den maksimale projeksjonen av filmen. Dette vil senere bli brukt som referansebilde for registrering av enfotonopptaksdata.
- Algoritmen lagrer deretter resultatene automatisk. npy-format, som kan nås senere med Python. Alternativt kan du lagre resultatene i andre formaterte filer for videre analyse i annen programvare.
Figur 5: Celleidentifikasjon ved hjelp av to-foton prosesseringsprogramvare. (A) Representativt bilde av celleidentifikasjon tatt fra to-foton prosesseringsprogramvare. Ved å sette Anatomical_only parameter til 0, men holde alle andre parametere de samme, er flere ikke-celler tilstede i området mellom stiplede linjer som forstyrrer manuell kurering av faktiske celler. (B) Eksempler på målinger av cellediameter hentet fra (A), ved hjelp av et bildebehandlingsprogram (øverst til venstre; 7,5 piksler, øverst til høyre; 9, nederst til venstre; 6,5, nederst til høyre; 7,5). (C) Representativt bilde av celleidentifikasjon. Når du setter Anatomical_only parameter til 1 og legger inn gjennomsnittlig cellediameter tatt fra (B) i cellediameteralgoritmen, er det ingen celler tilstede i området mellom stiplede linjer (skalastenger representerer 200 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
9. Registrering av identifiserte cellesett på tvers av avbildningsmodaliteter
- Utfør registrering av celler identifisert fra en-foton og to-foton opptak med den multimodale bilderegistrerings- og analysealgoritmen (MIRA), som er tilgjengelig via Python-grensesnittet til en-foton bildebehandlingsprogramvaren.
- Denne algoritmen justerer en-foton og to-foton data via ikke-stiv registrering. Se settet med demonstrasjon online notatbøker funnet på nettstedet og brukt til denne studien.
MERK: Notatbøkene ble skrevet slik at all behandling ville bli fullført i 1P-programvaren og er dermed ikke kompatibel med 2P-behandlingsprogramvare. Følg derfor bare gjennom med noen av trinnene i notatbøkene for denne studien.
- Denne algoritmen justerer en-foton og to-foton data via ikke-stiv registrering. Se settet med demonstrasjon online notatbøker funnet på nettstedet og brukt til denne studien.
- Følg trinnene som er beskrevet i demonstrasjonsnotatbøkene, som innebærer å generere et strukturelt bilde for hver bildemodalitet. Som standard innebærer dette å generere en maksimal projeksjon av to-foton z-stakken og et gjennomsnittlig bilde av en-foton opptaket. Alternativt kan du bruke et gjennomsnittsbilde av to-fotonopptaket.
- Der du blir bedt om det, filtrerer Spatial Bandpass bildene for å visualisere landemerkene bedre og orientere dem på nytt slik at de samsvarer.
- Velg samsvarende landemerker på de to bildene (figur 6A).
- Bruk disse til å beregne fordreiningen som trengs for å justere de to bildene. Generelt bør 3 til 5 landemerker være tilstrekkelig.
- Algoritmen beregner fordreiningen basert på en kombinasjon av landemerker og bildelikhet. Optimaliser for den relative vekten gitt til de to faktorene til tilfredsstillende resultater oppnås.
- Fordreie cellekartet som er anskaffet i en en-foton økt for å generere et nytt cellekart som er justert til to-foton data.
- Deretter importerer du dette forvridde cellekartet til 1P-behandlingsprogramvaren for å generere et bilde med det maksimale projeksjonsbildet fra to-fotonfilmen i bakgrunnen.
- Eksporter dette bildet for registreringsformål.
- I programmeringsprogramvare justerer du de to bildene som er generert så langt (to-foton cellekart på toppen av to-foton maksimal projeksjonsbilde) og fordreie en-foton cellekart på toppen av to-foton maksimal projeksjonsbilde (figur 6B, C).
- For å gjøre dette, for denne studien, bruk et registreringsestimatorprogram som lar brukeren sammenligne resultatene av forskjellige registreringsteknikker. Gitt at de to bildene har samme bakgrunn, var fasekorrelasjonsteknikken, med stiv registrering, tilstrekkelig.
- Når registreringen er fullført, skann det nå registrerte bildet for overlappende avkastning. Dette er avkastninger som er aktive i begge opptaksøkter, som kan brukes i videre analyse.
Figur 6: Celleregistrering på tvers av modaliteter ved hjelp av MIRA-arbeidsflyten. (A) Representativt bilde fra arbeidsflyten for cellejustering. Gjennomsnittsbildet fra enfotondataene vises til venstre, og bildet fra tofotondataene vises til høyre. Matchende landemerker fra begge bildene velges og merkes i programvaren med et randomisert fargevalg (røde sirkler). (B) Eksempeljusterte bilder som viser de to identifiserte cellesettene, en-foton (lilla) og to-foton (grønn), legges over på middelbildet av to-foton dataene. (C) Bilde av regionen merket med den hvite boksen i (B), justerte celler er her representert som overlappende grønne og lilla konturer. I alle paneler representerer skalastangen 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden for å gjennomføre kronisk flerlags in vivo kalsiumavbildning av den samme nevronpopulasjonen over en periode på flere uker, ved bruk av både en- og to-foton bildebehandlingsmodaliteter, under fritt bevegelige og hodefaste forhold har blitt vist. Her har evnen til å identifisere matchende nevronpopulasjoner under en-foton avbildning mens dyret utforsket en åpen arena i mørket blitt demonstrert (figur 7A). Kalsiumspor ble ekstrahert fra de identifiserte nevronene og z-skåret for sammenligning (figur 7B). Nevroner viste sammenlignbare nivåer av fluorescens og avfyringshastigheter i økter som var 3 uker fra hverandre.
Figur 7: Kalsiumdynamikk fra primær synsbark kan registreres stabilt over sesjoner som strekker seg over 3 uker. (A) Romlige filtre av identifiserte nevroner lagt på maksimale projeksjonsbilder fra tre separate opptak av samme synsfelt under en-foton fritt bevegelig kalsiumavbildning, som strekker seg over en varighet på 3 uker. ROI er merket i den rekkefølgen de er presentert i (B). Mørke områder i den andre (midtre) og tredje (høyre) økten er resultatet av bilderegistrering, der den første (venstre) økten brukes som referanse (skalalinjen representerer 0,5 mm). (B) Z-scoret kalsiumaktivitet av de registrerte avkastningene i første (venstre), andre (midtre) og tredje (høyre) økter vist i (A). Den horisontale skalastangen er 10 s, og den vertikale skalastangen er 10 sd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Deretter ble registreringen av en nevronpopulasjon på tvers av forskjellige bildebehandlingsmodaliteter demonstrert. En-foton og to-foton bildebehandling ble gjennomført samme dag. ROI ble identifisert fra en-foton data og manuelt kuratert for å generere et cellekart (figur 8A). På samme måte ble to-foton data behandlet for å generere et cellekart hvor celler automatisk identifiseres og manuelt velges for demonstrasjon. Deretter ble gjennomsnittsprojeksjonsbildet fra enfotonøkten justert til det maksimale projeksjonsbildet fra to-foton z-stakken med MIRA-plattformen (figur 8B). Dette forvridde cellekartet ble deretter eksportert, lagt over på det maksimale projeksjonsbildet med to foton og justert med to-foton cellekartet (figur 8C). Dette tillot celleidentifikasjon som viste aktiviteter av de samme cellene under begge bildemodaliteter (figur 8D), som kan brukes til kvantitativ analyse av nevronresponsene.
Figur 8: Kalsiumdynamikk fra primær visuell cortex registrert mellom ulike avbildningsmodaliteter. (A) Romlige filtre av identifiserte nevroner lagt på det maksimale projeksjonsbildet fra en en-foton, fritt bevegelig økt. Merkede nevroner er de som ble registrert til to-foton opptaksdata presentert i (C). (B) De samme konturene vist i (A) ble fordreid for å samsvare med dataene for to-foton økter vist i (C). (C) Romlige filtre av avkastningen vist i (A) etter justering (hvit), og avkastning identifisert ved hjelp av 2P-prosesseringsprogramvaren fra en to-foton hodefiksert opptaksøkt på samme dag (grønn), overlappet på det maksimale projeksjonsbildet fra to-fotonøkten. Overlappende ROI regnes som registrert og velges for videre analyse (skalastenger representerer 0,5 mm). (D) Z-scoret kalsiumaktivitet av de registrerte avkastningene i en-foton (venstre) og to-foton (høyre) opptaksøkter (horisontal skala bar er 10 s, og vertikal skala bar er 10 sd). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi vist evnen til å observere og direkte sammenligne nevroner i hodefaste og fritt bevegelige forhold i de samme nevrale populasjonene. Mens vi demonstrerte applikasjonen i den visuelle cortexen, kan denne protokollen tilpasses en rekke andre hjerneområder, både kortikale områder og dype kjerner 24,25,26,27,28, samt annen datainnsamling og atferdsoppsett 29,30.
Det er viktig å legge merke til de kritiske trinnene i denne protokollen, da de tillater optimal datainnsamling. For det første, når du utfører z-stabler, er det avgjørende å opprettholde konsistent luminans hele veien. Som beskrevet tidligere, vil lyset spre seg jo mer vev det må trenge gjennom; Således, ved å øke gevinsten, har laseren mer kraft til å kunne trenge lenger inn i vevet og opphisse avkastningen vår. Det anbefales imidlertid ikke å starte z-stacken ved forsterkningen som kreves for å opphisse avkastning i dypvevet, da dette vil føre til overeksponering av fluorescerende strukturer og fototoksisitet og kan bleke vevet på overflaten av cortex. Ved å velge alternativet Relativ eksponentiell gradient kan programvaren derfor beregne en jevn gradient av kraft som trengs for å kunne være optimal i hvert trinn i z-stakken. For det andre er det neste kritiske trinnet for å hjelpe med konsekvent registrering av cellesett over tid å sikre å lagre det gjennomsnittlige bildet av filmen tatt på den første en-foton bildebehandlingsøkten. Dette lar brukeren sammenligne eventuelle påfølgende bildebehandlingsøkter med det opprinnelige bildet for å sikre kontinuitet i cellesett og datainnsamling.
Det er verdt å merke seg at lette miniatyriserte to-foton mikroskoper har blitt uavhengig designet 31,32, som tillater høyoppløselig avbildning i fritt oppførende dyr. Selv om det fremhever et spennende fremskritt for høyoppløselig in vivo-bildebehandling, gjør det begrensede synsfeltet (FOV) og den høyt spesialiserte designen det utfordrende for generelle sluttbrukere. Metoden vi beskrev integrerer flere veletablerte plattformer som er lett tilgjengelige fra kommersielle leverandører, noe som gjør det til et tilgjengelig valg. I teorien kan den også erstattes med et tilpasset, selvmontert mikroprisme kompatibelt med et åpen kildekode-miniskop og et generisk to-foton mikroskop33,34.
Ikke desto mindre står denne protokollen overfor utfordringer som nøyaktig mikroprismeimplantasjon, siden feil kan føre til ikke-levedyktige FOV-er og følgelig kompromitterte data. Å opprettholde konsistente FOV-er på tvers av forskjellige modaliteter er også utfordrende på grunn av de forskjellige målene som brukes til bildeoppkjøp. Imidlertid, ettersom XY-aksene til mikroprismet forblir faste, er variasjonen i FOV langs Z-aksen; Derfor brukes spesifikke landemerker som er tilstede i begge bildemodusene (for eksempel blodkar, artefakter i kortikalt vev og identiske nevroner) for å synkronisere FOV-ene. Videre er det avgjørende å bruke registrering for å justere og identifisere de samme nevronene under forskjellige modaliteter. En annen utfordring å være klar over er å minimere fotobleking av GCaMP-vevet under oppkjøp i begge modaliteter. Derfor er det viktig å redusere tiden som brukes på opptak, optimalisere signal-støy-forholdet (ved å øke forsterkningen i stedet for LED / lasereffekten), og vente 24-48 timer mellom bildebehandlingene.
Til tross for disse iboende kompleksitetene, gir protokollen vår, når den utføres med kirurgisk presisjon og egnede bildebehandlingsteknikker, en robust plattform for å sammenligne nevrale aktiviteter. Det muliggjør sammenligning mellom hodefaste tilstander i strengt kontrollerte oppgaver og fritt bevegelige tilstander som etterligner mer naturlig atferd, og dermed utvider potensielle applikasjoner innen nevrovitenskap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser eller interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Charu Reddy og professor Matteo Carandini (Cortex Lab) for deres råd om kirurgisk protokoll og deling av transgen musestamme. Vi takker Dr. Norbert Hogrefe (Inscopix) for hans veiledning og hjelp gjennom utviklingen av operasjonen. Vi takker Andreea Aldea (Sun Lab) for hennes hjelp med kirurgisk oppsett og databehandling. Dette arbeidet ble støttet av Moorfields Eye Charity.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | - | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | - | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | - | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system - single gas - isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | - | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | - | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | - | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | - | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | - | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Vaziri, A., Emiliani, V.
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sun, Y. J., Sebastian Espinosa, J., Hoseini, M. S., Stryker, M. P. Experience-dependent structural plasticity at pre- and postsynaptic sites of layer 2/3 cells in developing visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21812-21820 (2019).
- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Reid, R. C. Chronic cellular imaging of mouse visual cortex during operant behavior and passive viewing. Front Cell Neurosci. 4, 3 (2010).
- Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. Elife. 5, 14472 (2016).
- Puścian, A., Benisty, H., Higley, M. J. NMDAR-dependent emergence of behavioral representation in primary visual cortex. Cell Rep. 32 (4), 107970 (2020).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo. imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Seaton, G., et al. Dual-component structural plasticity mediated by αCaMKII autophosphorylation on basal dendrites of cortical layer 2/3 neurones. J Neurosci. 40 (11), 2228-2245 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: Imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (52), 18739-18744 (2014).
- Buxhoeveden, D. P., Casanova, M. F.
- Chen, S., et al. Miniature fluorescence microscopy for imaging brain activity in freely-behaving animals. Neurosci Bull. 36 (10), 1182-1190 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), e55579 (2017).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), 88678 (2014).
- Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. J Neurophysiol. 115 (6), 2852-2866 (2016).
- Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomed Opt Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Wenzel, M., Hamm, J. P., Peterka, D. S., Yuste, R. Reliable and elastic propagation of cortical seizures in. Cell Rep. 19 (13), 2681-2693 (2017).
- Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging. Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).
- Barson, D., Hamodi, A. S. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nat Methods. 17 (1), 107-113 (2020).
- Paquelet, G. E., et al. Single-cell activity and network properties of dorsal raphe nucleus serotonin neurons during emotionally salient behaviors. Neuron. 110 (16), 2664-2679 (2022).
- Yang, Q., et al. Transparent microelectrode arrays integrated with microprisms for electrophysiology and simultaneous two-photon imaging across cortical layers. bioRxiv. , (2022).
- Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences. Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).
- Zong, W., et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods. 18 (1), 46-49 (2021).
- Engelbrecht, C. J., et al. Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Opt Express. 16 (8), 5556-5564 (2008).
- Suzuki, M., Aru, J., Larkum, M. E. Double-μ Periscope, a tool for multilayer optical recordings, optogenetic stimulations or both. Elife. 10, 72894 (2021).
- Stibůrek, M., et al. 110 μm thin endo-microscope for deep-brain in vivo observations of neuronal connectivity, activity and blood flow dynamics. Nat Commun. 14 (1), 1897 (2023).
