Summary
该方案概述了从当地来源的猪眼中获取和培养原代视网膜色素上皮（RPE）细胞的程序。这些细胞可作为干细胞的高质量替代品，适用于 体外 视网膜研究。
Abstract
视网膜色素上皮 （RPE） 是视网膜外层负责支持光感受器的关键单层。RPE 变性通常发生在以进行性视力丧失为特征的疾病中，例如年龄相关性黄斑变性 （AMD）。AMD的研究通常依赖于人类供体的眼睛或诱导多能干细胞（iPSC）来代表RPE。然而，这些RPE来源需要更长的分化期和大量的培养专业知识。此外，一些研究机构，特别是农村地区的研究机构，很难获得捐赠者的眼睛。虽然存在市售的永生化 RPE 细胞系 （ARPE-19），但它缺乏基本的 体内 RPE 特征，并且在许多眼科研究出版物中没有被广泛接受。迫切需要从更容易获得和更具成本效益的来源获得具有代表性的原代 RPE 细胞。该方案阐明了从猪眼睛死后获得的原代RPE细胞的分离和传代培养，这些细胞可以从商业或学术供应商处本地采购。该协议需要组织培养实验室中常见的常见材料。其结果是 iPSC、人类供体眼睛和 ARPE-19 细胞的主要、差异化且具有成本效益的替代品。
Introduction
视网膜色素上皮 （RPE） 是位于 Bruch 膜和光感受器之间的视网膜外层的单层1。RPE 细胞与闭塞带-1 （ZO-1） 等蛋白质形成紧密连接，并具有以色素沉着和六边形形态为特征的独特表型 2,3。这些细胞有助于血液-视网膜屏障，从而支持光感受器健康并维持视网膜稳态 4,5。此外，RPE 细胞通过吸收光和回收光感受器的基本成分在视觉中发挥关键作用6.例如，RPE65 是一种在 RPE 细胞中高度表达的蛋白质，可将全反式视黄酯转化为 11-顺式视黄醇 7,8。鉴于 RPE 细胞执行的多种功能，它们的功能障碍与各种疾病有关，包括年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变 9,10。为了加强对视网膜病变的理解并开发新的治疗方法，经常采用视网膜的体外模型。
为了生成健康或患病视网膜的代表性模型，必须使用模拟 RPE 细胞类型。市售的 ARPE-19 细胞系缺乏天然表型，例如色素沉着，而 iPSC 可能需要数月才能分化 11,12,13。尽管人类供体的眼睛可能是理想的，但许多研究实验室通常不容易获得它们。
在这里，我们设计了一种利用猪眼的方法，猪眼与人眼有许多相似之处14，以获得原代RPE细胞。这些原代猪 RPE 细胞已用于多种视网膜模型15,16。这些细胞不仅具有成本效益，而且与iPSC或供体眼睛相比，它们需要更少的时间来获取。此外，它们还表现出天然特征，例如色素沉着和微绒毛。虽然存在类似的猪RPE提取方案17,18,19，但这种简单而详细的技术进一步验证了酶解离，并采用了大多数细胞培养实验室中常见的材料。
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Protocol
该程序中使用的眼睛是从当地经美国农业部检查的肉店死后获得的，并且不使用活体动物进行任何工作。在动物被处死后，大约2小时后眼睛被摘除。由于组织腐烂可能开始发生，因此在运输过程中保持眼睛凉爽以防止进一步腐烂非常重要。在此过程中，眼睛在摘除后立即放入冰箱中。随后，将眼袋放置在 1000 mL 聚丙烯烧杯内，并在 8 L 冷却器内被冰包围。重要的是不要将眼睛直接放在冰上。一旦眼睛到达实验室，RPE细胞的分离就会在生物安全柜内进行。在 3-5 小时内完成此过程至关重要。该协议已针对处理 10 只眼睛进行了优化。
1. 制备 DNase 原液等分试样
注意：建议在隔离之前执行此步骤。
- 用无菌去离子水制备5mM氯化钙溶液。
注意： 氯化钙粉末会引起严重的眼睛刺激或损伤。穿戴适当的个人防护装备。 - 向 DNase 粉末中加入 5 mM 氯化钙溶液（参见 材料表），得到最终 DNase 浓度为 3 mg/mL。确保溶液充分混合。
注意：DNase 是一种呼吸道致敏危害。不要吸入粉末/物质。 - 将小体积（例如 1 mL）等分装到微量离心管中。
- 将等分试样冷冻在-20°C直至使用。
2. 设置解剖区域
- 将无菌解剖仪器和细胞培养设备转移到生物安全柜中：手术窗帘、培养皿、细胞过滤器、孔板、纱布、镊子、手术刀柄、手术刀刀片和虹膜剪刀（见 材料表）。
- 使用镊子，铺开手术布。将一块 6 孔板放在手术悬垂物上，然后取下盖子。
- 将等分试样的无菌杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 放在冰上并放入生物安全柜中。
- 将 6 孔板的一个孔填充一半（约 6 mL）的 10% 聚维酮碘溶液。
- 用冷却的DPBS填充剩余的孔。
- 从其中一个培养皿上取下盖子，将其倒置在手术窗帘上。将培养皿底座作为废物容器放在一边。
- 将等分试样的细胞培养基（Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），10%胎牛血清（FBS），1%抗生素/抗真菌剂）和0.25%胰蛋白酶/ EDTA的等分试样放入37°C水浴中。
- 从冰箱中取出DNase储备溶液（有关详细信息，请参阅方案的其余部分）。
3. 去除外部组织
注意：外部组织去除可以在生物安全柜外进行。切割前检查眼睛，确保巩膜没有被刺穿，瞳孔没有雾化，并且存在视神经。丢弃不符合这些标准的眼睛。
- 用一只手握住附着在眼睛上的肌肉，用另一只手用手术刀轻轻切掉巩膜周围的组织。小心不要压伤眼睛或意外切开巩膜。如果巩膜被切开并露出黑色内部，请丢弃眼睛。
注意：强烈建议握着肌肉的手戴上防割手套，以防止意外割伤。 - 用弯曲的虹膜剪刀修剪视神经，长度不超过 3 毫米。如果视神经太长，眼罩以后将无法正确放置在细胞过滤器中。
- 将眼睛放在冰上，角膜朝下。
- 重复步骤 3.1-3.3，直到从每只眼睛上取出外部组织。
4.眼球解剖
- 用镊子将眼睛转移到生物安全柜和含有10%聚维酮碘溶液的孔中，并旋转眼睛以确保其完全涂覆在碘溶液中。为了尽可能保持工具无菌，这些镊子只能用于触摸眼睛的外部。
- 当眼睛坐在碘溶液中时，将无菌纱布放在先前准备好的培养皿的浅倒盖上。在单独的培养皿中，放置细胞过滤器。仅使用细胞过滤器来支撑眼罩，而不是用于细胞分离。
- 让眼睛在碘溶液中静置约 30 秒后，将眼睛浸入含有 DPBS 的孔中约 5 秒，从一个孔移动到另一个孔以逐渐稀释碘溶液，然后将眼睛转移到无菌纱布上。
- 用手术刀在锯齿肌下方做一个小切口，或从虹膜边缘向下大约1/3处做一个切口。
- 切开后，用虹膜剪刀沿眼球圆周均匀切割，平行于角膜。操作眼睛时，只能使用镊子触摸眼睛外侧或纱布以保持无菌。
- 用镊子抓住视神经，轻轻地将球体从纱布上抬起。玻璃体应该从地球上掉下来。如果需要，轻轻摇晃眼睛以帮助去除玻璃体。
注意： 如果玻璃体很难去除，请尝试在球体上切得更低。 - 轻轻地将眼罩放入准备好的细胞过滤器中，眼罩内部朝上。如果不均匀，请使用镊子调整眼罩，使切口尽可能水平。
- 将冷却的 DPBS 轻轻添加到眼罩中，使液位刚好低于切口的最低点。该 DPBS 将在神经视网膜切除后移除。
注意： 添加的 DPBS 体积会因眼睛大小和切口位置而异。 - 重复步骤4.1-4.8，直到所有眼睛都被解剖。
5. 神经视网膜切除和RPE解离
注意：以下部分更容易分阶段执行。在这种设置中，此过程一次在一批（通常为 3 个眼罩）上执行。对于步骤 5.1-5.7，在进入下一步之前，应对整个批次执行每个步骤。
- 在手电筒下，找到神经视网膜（白色/粉红色）开始与 RPE（黑色）分离的任何区域。然后，用钝镊子轻轻抓住抬起的神经视网膜并将其剥离。
注意： 如果没有神经视网膜分离的区域，请用镊子轻轻抓住它靠近眼罩顶部。使用这种方法，如果对 RPE/脉络膜造成损害，这些细胞在 RPE 收集过程中不会解离。 - 轻轻收集视盘附近的神经视网膜。
- 使用连接到真空抽吸系统的巴斯德移液管吸出神经视网膜。建议羽化吸气以帮助去除过程。
注意：移液器吸头可以放在巴斯德移液器的末端以减少吸力。 - 小心地添加额外的冷却 DPBS 以替换吸气的 DPBS。
- 通过再次吸气去除剩余的神经视网膜。这一次，在不干扰暴露的 RPE 的情况下尽可能多地删除 DPBS。
- 将胰蛋白酶轻轻加入眼罩中。将体积水平保持在切口线和受损 RPE 的任何部分以下，以减少污染。
注意：胰蛋白酶是一种酶，接触时会引起皮肤和眼睛刺激。穿戴适当的个人防护装备。 - 将胰蛋白酶添加到每只眼睛后，确保更换培养皿盖。接下来，将培养皿转移到37°C和5%CO2 的加湿培养箱中30分钟。
- 对每批重复步骤5.1-5.7，直到处理完所有眼罩。
6. RPE收集
- 从每批眼睛（2-3 只眼睛）中收集 RPE 细胞，并放入单个 15 mL 离心管中，使接种过程简单明了。
- 在手电筒下，使用 1000 μL 移液管轻轻研磨以去除 RPE 细胞。如果RPE细胞未分离，则加入新鲜胰蛋白酶并再孵育10-15分钟。小心不要刮擦视网膜。
- 将 RPE 细胞收集在 15 mL 离心管中。
- 用细胞培养基清洗眼罩以收集任何剩余细胞并中和胰蛋白酶。确保 15 mL 离心管中培养基的体积至少为胰蛋白酶的两倍。
- 重复步骤6.1，直到从所有眼罩中收集RPE细胞。
- 在室温下以250× g 离心细胞悬浮液5分钟。
7. 制备DNase工作溶液
- 计算添加到细胞培养基中所需的 3 mg/mL DNase 储备溶液（在步骤 1 中制备）的体积，最终浓度为 100 μg/mL，每管细胞的最终体积为 3 mL（即，对于三个离心管的细胞，需要 9 mL 的 100 μg/mL DNase 溶液）。
- 混合适当体积的 DNase 储备溶液和细胞培养基。在工作溶液中使用 DNase 有助于防止细胞结块，并允许细胞均匀接种。
8. RPE细胞接种
- 在步骤6.3中离心后，从每个15mL离心管中取出上清液，注意不要破坏细胞沉淀。
- 将每个细胞沉淀重悬于 3 mL DNase 工作溶液中。
- 将含有重悬细胞的15mL离心管放入37°C和5%CO2 的湿润培养箱中15分钟。
- 孵育后，在室温下以150× g 离心细胞悬浮液5分钟。
- 取出上清液，注意不要破坏细胞沉淀。
- 将每个细胞沉淀重悬于 3 mL 新鲜细胞培养基中。
- 对于每个含有 2-3 个眼睛的 RPE 细胞的离心管，接种 6 孔板的一个孔（传代 0）。
- 小心地将接种的6孔板转移到37°C和5%CO2的加湿培养箱中。
9. 原代猪RPE细胞培养
- 在移动平板之前，让新接种的RPE细胞附着48-72小时。在第一次更换培养基期间，可以用新鲜的细胞培养基进行洗涤，以帮助去除多余的细胞碎片。
- 每48小时更换一次细胞培养基。
- 当细胞达到汇合时，过渡到FBS浓度为2%的细胞培养基中，并保持直至实验。
10. RPE单元验证
- 免疫细胞化学（ICC）染色
- 在室温下将细胞固定在DPBS中的4%甲醛中10分钟。
- 用DPBS洗涤两次。
- 在室温下使用0.2%Triton-X 100在DPBS中透化细胞（如果需要）10分钟。
- 用DPBS洗涤两次。
- 在室温下在DPBS中施用3%（w / v）牛血清白蛋白（BSA）封闭溶液1小时。
- 加入1：100稀释度（或推荐的制造商浓度）的一抗（参见 材料表），并在室温下静置1小时或在4°C下静置过夜。
- 用DPBS洗涤三次，每次5分钟。
- 加入 2 μg/mL（或推荐的制造商浓度）的二抗（如果需要）（参见 材料表），并在室温下静置 1 小时。
- 如果应用二抗，则用 DPBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
- 加入制造商浓度的核染色探针（参见 材料表），并在室温下静置25分钟。
- 用PBS洗涤三次，每次5分钟。
- 如果在细胞培养插入物上，则使用Rickabaugh和Weatherston等人20概述的封固剂，用盖玻片安装到显微镜载玻片上。否则，请在 DPBS 中对单元格进行映像。
- 扫描电子显微镜（SEM）
- 遵循 Harris 等人 21 概述的程序。
- 反式上皮电阻 （TEER）
- 按照制造商的TEER测量方案（参见 材料表），在基底室15中加入1 mL培养基。
- 酶联免疫吸附试验（ELISA）
- 按照制造商的方案，使用多重人酶联免疫吸附测定试剂盒进行ELISA15 （参见 材料表）。
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Representative Results
使用该程序，从猪眼中成功分离出原代RPE细胞。 图 1A 显示了分离后 3 天具有特征性色素沉着的 RPE 细胞。生长1周后，细胞完全融合并形成健康的单层（图1B）。然后将细胞转移到细胞培养插入物中，在那里它们保持其色素沉着和形态（图1C），进一步支持分离程序的功效。没有表现出这些特征，而是显示出变异形态和过度色素沉着的培养物（图1D）被怀疑是细胞污染，并且没有用于实验。在本手稿中分离的 RPE 细胞表达 RPE65，这是一种在 RPE 细胞中高度表达的蛋白质（图 2）。RPE65表达较低的区域可能是由于色素沉着阻断了荧光，因为这些区域对应于色素沉着更严重的细胞（图2A）。分离的RPE细胞表达的另一个特征蛋白是VEGF。10 天后，VEGF 在 RPE 单层基底侧的表达量更高，浓度为 2612.5 ± 28.0 pg/mL，而顶端侧的浓度为 2141.2 ± 53.5 pg/mL（图 3）。原代猪RPE细胞还具有微绒毛和鹅卵石形态（图4）。此外，当在细胞培养插入物上生长时，TEER 读数从 7 天时的 166.1 ± 75.9 Ω∙cm2 增加到 14 天后的 363.4 ± 9.0 Ω∙cm 2 （图 5），表明随着时间的推移形成一致、健康的紧密连接22。为了进一步研究连接的形成，分析了 RPE 细胞的 ZO-1 表达，该表达定位于细胞边界，这意味着健康的连接形成和单层完整性（图 6）。
图 1：将初级 RPE 接种到孔板上并传代培养后。分离后 3 天 （A） 的健康 RPE 细胞，分离后 7 天完全融合的单层细胞 （B），RPE 成功传代到培养插入物 （C） 上，以及 RPE 培养物上的潜在细胞污染区域 （箭头） （D）。比例尺 = 100 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：显示猪 RPE 细胞中 RPE65 表达的免疫细胞化学图像。 接种后 15 天细胞的明场 （A）、RPE65 （B）、细胞核 （C） 和合并 （D） 图像。请注意，明场图像中的颗粒状背景是多孔培养插入膜。比例尺 = 50 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：RPE 单层顶端和基底侧的 VEGF 表达。VEGF浓度通过在培养插入物上细胞生长10天后进行的ELISA测定。误差线表示 n = 2 的标准差。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：原代猪 RPE 细胞的扫描电子显微镜 （SEM） 图像。 细胞在成像前生长 30 天。比例尺 = 5 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：对在细胞培养插入物上培养的 RPE 细胞进行的 TEER 读数。 生长 7、10 和 14 天后的阻力值。误差线表示 n = 3 的标准差。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：显示猪 RPE 细胞中 ZO-1 表达的免疫细胞化学图像。 在玻璃底孔板上接种 6 天后细胞的明场 （A） ZO-1 （B）、细胞核 （C） 和合并 （D） 图像。比例尺 = 50 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
该协议描述了如何从猪眼中分离RPE细胞。在分离后 7 天内可以看到色素沉着和鹅卵石形态（图 1B）。此外，TEER 数据表明紧密结形成22 和健康的单层（图 5）。这些结果表明，用这种方法分离的RPE细胞与人RPE相似，在视网膜细胞培养模型中是有益的。
这份手稿中使用的眼睛是死后从当地一家肉店获得的，但也可以从其他来源获得，例如与使用猪产品的合作者的学术环境。重要的是在动物死亡后尽快开始手术，并在手术前保持眼睛凉爽。在分离过程中，在胰蛋白酶消化后研磨之前，必须不要破坏 RPE。在剥离神经视网膜时，这种护理最为关键，因为缺乏谨慎可能会导致用镊子抓住布鲁赫膜1 并将其他细胞类型引入溶液中。
虽然此程序已针对我们的条件进行了优化，但可以对方法进行一些更改。例如，如果需要特定的接种密度，则可以在 DNase 孵育后对细胞进行计数。此外，如果真空抽吸不起作用，可以通过用弯曲的小剪刀仔细修剪来去除神经视网膜。在为实验接种时，可以使用高接种密度（例如 2.5 x 105 个细胞/cm2 ）来防止过度的细胞分裂。此外，不建议重复传代，因为细胞可能开始失去其天然表型。虽然这项研究使用了传代 1 细胞进行实验，但如果 RPE 表型和特征得以维持，则可能会使用额外的传代。最后，如果需要，可以使用浓度为1%的FBS代替2%进行传代培养或实验。
这种方法有一些缺点。首先，难以复制或获得动物的年龄、性别、品种和死亡时间，这些都是原代细胞分离中常见的问题。其次，过度胰蛋白酶消化会迅速导致细胞异常，Fietz 等人17 也注意到了这一点。然而，最终，这种方法提供了一种廉价且有效的方法来获得原代 RPE 细胞。这些细胞不像 iPSC 那样需要较长的分化时间。这些猪 RPE 天生也具有关键结构，如微绒毛和色素沉着15,16，这与未分化的对应物不同。因此，这些细胞为视网膜研究提供了更具代表性的细胞类型。最后，这种方法可能非常有益于更多无法获得人类供体眼睛的农村地区或机构，以产生类似于人类模型的视网膜模型，以了解视力和疾病。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
作者要感谢 Farhad Farjood 在猪 RPE 细胞培养和分离方面的帮助，以及 Thomas Harris 在 SEM 方面的帮助。作者感谢犹他州立大学显微镜核心设施对SEM分析的支持。该设施维护着通过美国国家科学基金会主要研究仪器资助（CMMI-1337932）获得的扫描电子显微镜。这项研究的资金由美国国立卫生研究院通过拨款 1R15EY028732 （Vargis） 和 BrightFocus 基金会拨款M2019109 （Vargis） 提供。犹他州立大学研究办公室的本科生研究和创意机会补助金（Weatherston）和犹他州立大学阿尔茨海默病和痴呆症研究中心的种子补助金（Vargis）提供了额外的资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified - calcium - magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
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