Summary
Denne protokol skitserer proceduren for opnåelse og dyrkning af primære retinale pigmentepitelceller (RPE) fra lokalt fremskaffede svineøjne. Disse celler fungerer som et alternativ af høj kvalitet til stamceller og er velegnede til in vitro retinal forskning.
Abstract
Det retinale pigmentepitel (RPE) er et afgørende monolag i den ydre nethinden, der er ansvarlig for at understøtte fotoreceptorer. RPE-degeneration forekommer almindeligvis i sygdomme præget af progressivt synstab, såsom aldersrelateret makuladegeneration (AMD). Forskning i AMD er ofte afhængig af menneskelige donorøjne eller inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) til at repræsentere RPE. Disse RPE-kilder kræver imidlertid længere differentieringsperioder og betydelig ekspertise til dyrkning. Derudover mangler nogle forskningsinstitutioner, især dem i landdistrikterne, let adgang til donorøjne. Mens der findes en kommercielt tilgængelig udødeliggjort RPE-cellelinje (ARPE-19), mangler den væsentlige in vivo RPE-funktioner og er ikke bredt accepteret i mange oftalmologiske forskningspublikationer. Der er et presserende behov for at få repræsentative primære RPE-celler fra en lettere tilgængelig og omkostningseffektiv kilde. Denne protokol belyser isolering og subkultur af primære RPE-celler opnået post mortem fra svineøjne, som kan hentes lokalt fra kommercielle eller akademiske leverandører. Denne protokol nødvendiggør almindelige materialer, der typisk findes i vævskulturlaboratorier. Resultatet er et primært, differentieret og omkostningseffektivt alternativ til iPSC'er, menneskelige donorøjne og ARPE-19-celler.
Introduction
Det retinale pigmentepitel (RPE) er et monolag placeret i den ydre nethinden mellem Bruchs membran og fotoreceptorerne1. RPE-celler danner tætte kryds med proteiner såsom zonula occludens-1 (ZO-1) og besidder en karakteristisk fænotype karakteriseret ved pigmentering og sekskantet morfologi 2,3. Disse celler bidrager til blod-retinal barrieren og understøtter derved fotoreceptorens sundhed og opretholder retinal homeostase 4,5. Derudover spiller RPE-celler en kritisk rolle i synet ved at absorbere lys og genbruge vigtige komponenter til fotoreceptorerne6. For eksempel omdanner RPE65, et protein, der er stærkt udtrykt i RPE-celler, all-trans-retinylestere til 11-cis-retinol 7,8. I betragtning af de mange funktioner, der udføres af RPE-celler, er deres dysfunktion impliceret i forskellige sygdomme, herunder aldersrelateret makuladegeneration og diabetisk retinopati 9,10. For at øge forståelsen af retinale patologier og udvikle nye behandlinger anvendes ofte in vitro-modeller af nethinden.
For at generere repræsentative modeller af sunde eller syge nethinden er det bydende nødvendigt at bruge en mimetisk RPE-celletype. Den kommercielt tilgængelige ARPE-19-cellelinje mangler indfødte fænotyper, såsom pigmentering, mens iPSC'er kan tage måneder at differentiere 11,12,13. Selvom menneskelige donorøjne kan være ideelle, er de ofte ikke let tilgængelige for mange forskningslaboratorier.
Her har vi udtænkt en metode til at udnytte svineøjne, som deler mange ligheder med menneskelige øjne14, til opnåelse af primære RPE-celler. Disse primære svin RPE-celler er blevet brugt i flere retinale modeller15,16. Disse celler er ikke kun omkostningseffektive, men de kræver også mindre tid at erhverve end iPSC'er eller donorøjne. Derudover udviser de indfødte egenskaber, såsom pigmentering og mikrovilli. Mens lignende protokoller til porcin RPE-ekstraktion findes 17,18,19, validerer denne ligetil og detaljerede teknik yderligere enzymatisk dissociation og anvender materialer, der almindeligvis findes i de fleste cellekulturlaboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De øjne, der anvendes i denne procedure, fås post mortem fra en lokal, USDA-inspiceret slagterbutik, og der udføres ikke noget arbejde ved hjælp af levende dyr. Efter at dyrene er blevet ofret, går der ca. 2 timer, før øjnene er enukleerede. Da vævsforfald kan begynde at forekomme, er det vigtigt at holde øjnene kølige under transport for at forhindre yderligere forfald. I denne procedure placeres øjnene straks i køleskab efter enukleation. Derefter placeres posen med øjne inde i et 1000 ml polypropylenbægerglas og omgivet af is i en 8 L køler. Det er vigtigt ikke at placere øjnene direkte på isen. Når øjnene ankommer til laboratoriet, udføres isoleringen af RPE-celler i et biosikkerhedsskab. Det er afgørende at afslutte denne proces inden for 3-5 timer. Denne protokol er optimeret til behandling af 10 øjne.
1. Forberedelse af DNase-stamalikvoter
BEMÆRK: Det anbefales, at dette trin udføres før isoleringen.
- Forbered en 5 mM calciumchloridopløsning med sterilt deioniseret vand.
FORSIGTIG: Calciumchloridpulver kan forårsage alvorlig øjenirritation eller skade. Brug passende personlige værnemidler. - Tilsæt 5 mM calciumchloridopløsning til DNasepulver (se materialetabel) for at få en endelig DNase-koncentration på 3 mg/ml. Sørg for, at opløsningen blandes grundigt.
FORSIGTIG: DNase er en respiratorisk sensibiliseringsfare. Indånd ikke pulver/stof. - Alikvote små mængder, for eksempel 1 ml, i mikrocentrifugerør.
- Alikvoter fryses ved -20 °C indtil brug.
2. Opsætning af dissektionsområdet
- Overfør de sterile dissektionsinstrumenter og cellekulturudstyr til biosikkerhedsskabet: kirurgisk drapering, petriskåle, cellesi, brøndplader, gaze, pincet, skalpelhåndtag, skalpelblad og irissaks (se materialetabel).
- Brug pincet til at lægge det kirurgiske drapering ud. Placer en 6-brønds plade oven på det kirurgiske gardin, og fjern låget.
- Anbring en prøve sterilt Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) på is og i biosikkerhedsskabet.
- Fyld en brønd i en 6-brønds plade halvvejs fuld (ca. 6 ml) af 10% povidon-jodopløsning.
- Fyld de resterende brønde med kølet DPBS.
- Fjern låget fra en af petriskålene og læg det omvendt oven på det kirurgiske gardin. Sæt petriskålens bund til side som affaldsbeholder.
- Anbring en prøve cellekulturmedier (Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM), 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% antibiotika/antimykotika) og en prøve på 0,25% trypsin/EDTA i et 37 °C vandbad.
- Fjern DNase-stamopløsningen fra fryseren (se resten af protokollen for flere detaljer).
3. Udvendig vævsfjernelse
BEMÆRK: Udvendig vævsfjernelse kan udføres uden for biosikkerhedsskabet. Undersøg øjet før skæring for at sikre, at sclera ikke er punkteret, pupillen ikke er tåget, og synsnerven er til stede. Kassér øjne, der ikke opfylder disse kriterier.
- Mens du holder musklen fastgjort til øjet med den ene hånd, skal du bruge den anden hånd til forsigtigt at skære vævet omkring sclera væk med en skalpel. Pas på ikke at knuse øjet eller ved et uheld skære gennem sclera. Hvis sclera skæres igennem og udsætter det sorte indre, skal du kassere øjet.
FORSIGTIG: En snitbestandig handske anbefales stærkt til den hånd, der holder musklen, for at beskytte mod utilsigtede snit. - Trim synsnerven med buet irissaks til en længde på højst 3 mm. Hvis synsnerven er for lang, vil øjenkoppen ikke sidde ordentligt i cellesien senere.
- Placer øjet på is med hornhinden nede.
- Gentag trin 3.1-3.3, indtil det udvendige væv er fjernet fra hvert øje.
4. Øjendissektion
- Brug en pincet til at overføre et øje ind i biosikkerhedsskabet og ind i brønden, der indeholder 10% povidon-jodopløsning, og drej øjet for at sikre, at det er fuldt belagt i jodopløsningen. For at holde værktøjerne så sterile som muligt bør disse pincetter kun bruges til at røre ved ydersiden af øjet.
- Mens øjet sidder i jodopløsning, skal du placere en steril gasbind på det lave, omvendte låg på petriskålen, der er tilberedt tidligere. I en separat petriskål placeres en cellesil. Brug kun cellesien til at understøtte øjenkoppen, ikke til celleseparation.
- Efter at have ladet øjet sidde i jodopløsning i ca. 30 s, vaskes øjet ved at dyppe det i hullerne indeholdende DPBS i ca. 5 s hver, flyttes fra brønd til brønd for gradvist at fortynde jodopløsningen og overføre øjet til det sterile gaze.
- Lav et lille snit ved hjælp af en skalpel under ora serrata, eller ca. 1/3 ned ad kloden fra iriskanten.
- Efter snittet skal du bruge irissaks til at skære jævnt langs klodens omkreds parallelt med hornhinden. Når du manøvrerer øjet, skal du kun bruge pincetten til at røre ydersiden af øjet eller gasbindet for at opretholde sterilitet.
- Brug pincetten til at få fat i synsnerven og løft forsigtigt kloden væk fra gasbindet. Den glasagtige skal falde ud af kloden. Ryst forsigtigt øjet om nødvendigt for at hjælpe med at løsne glaslegemet.
BEMÆRK: Hvis glaslegemet er meget vanskeligt at fjerne, kan du prøve at skære lavere på kloden. - Placer forsigtigt øjenkoppen i den forberedte cellesil med indersiden af øjenkoppen opad. Hvis det er ujævnt, skal du bruge pincet til at justere øjenkoppen for at få snittet så plant som muligt.
- Tilsæt forsigtigt afkølet DPBS til øjenkoppen, så væskeniveauet er lige under det laveste punkt i snittet. Denne DPBS vil blive fjernet efter neurale nethinden fjernelse.
BEMÆRK: Mængden af DPBS, der tilføjes, varierer afhængigt af øjenstørrelse og snitplacering. - Gentag trin 4.1-4.8, indtil alle øjne er dissekeret.
5. Fjernelse af neurale nethinden og RPE-dissociation
BEMÆRK: Følgende afsnit er lettere at udføre i etaper. I denne opsætning udføres denne proces på en batch (normalt 3 øjenkopper) ad gangen. For trin 5.1-5.7 skal hvert trin udføres på hele batchen, før du går videre til næste trin.
- Under en lommelygte skal du finde områder, hvor neuralhinden (hvid / lyserød) begynder at løsne sig fra RPE (sort). Brug derefter stump pincet til forsigtigt at gribe fat i den løftede neurale nethinden og skræl den væk.
BEMÆRK: Hvis der ikke er nogen områder, hvor neuralhinden løsner sig, skal du bruge pincetten til forsigtigt at gribe den nær toppen af øjenkoppen. Ved hjælp af denne metode, hvis der sker skade på RPE / choroid, vil disse celler ikke blive dissocieret under RPE-indsamling. - Opsaml forsigtigt nethinden nær den optiske disk.
- Opsug den neurale nethinde ud ved hjælp af en Pasteur-pipette, der er fastgjort til et vakuumaspirationssystem. Det anbefales at fjer ambitionen om at hjælpe i fjernelsesprocessen.
BEMÆRK: En pipettespids kan placeres på enden af en Pasteur-pipette for at reducere sugningen. - Tilføj forsigtigt yderligere afkølet DPBS for at erstatte det, der blev aspireret.
- Fjern resterende neurale nethinden ved at aspirere igen. Denne gang skal du fjerne så meget DPBS som muligt, mens du ikke forstyrrer den udsatte RPE.
- Tilsæt forsigtigt trypsin til øjenkoppen. Hold lydstyrkeniveauet under snitlinjen og eventuelle sektioner af beskadiget RPE for at reducere kontaminering.
FORSIGTIG: Trypsin er et enzym, der vil forårsage hud- og øjenirritation ved kontakt. Brug passende personlige værnemidler. - Når trypsin er tilsat til hvert øje, skal du sørge for, at petriskållåget udskiftes. Derefter overføres petriskålen til en befugtet inkubator ved 37 °C og 5% CO2 i 30 minutter.
- Gentag trin 5.1-5.7 for hver batch, indtil alle øjenkopper er behandlet.
6. RPE-indsamling
- Saml RPE-cellerne fra hvert parti øjne (2-3 øjne) og læg dem i et enkelt 15 ml centrifugerør for at gøre såningsprocessen ligetil.
- Under en lommelygte tritureres forsigtigt ved hjælp af en 1000 μL pipette for at løsne RPE-cellerne. Hvis RPE-cellerne ikke løsnes, tilsættes frisk trypsin og inkuberes i yderligere 10-15 minutter. Pas på ikke at skrabe nethinden.
- RPE-cellerne samles i et 15 ml centrifugerør.
- Vask øjenkoppen med cellekulturmedier for at samle eventuelle resterende celler og neutralisere trypsinet. Sørg for, at der er mindst dobbelt så meget medievolumen som trypsin i 15 ml centrifugeglasset.
- Gentag trin 6.1, indtil RPE-celler er indsamlet fra alle øjenkopper.
- Centrifuger cellesuspensionerne ved 250 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
7. Forberedelse af DNase-arbejdsløsning
- Beregn det volumen på 3 mg/ml DNase-stamopløsning (fremstillet i trin 1), der er nødvendigt for at tilsætte cellekulturmedier til en slutkoncentration på 100 μg/ml og et slutvolumen på 3 ml pr. cellerør (dvs. til tre centrifugeglas med celler kræves 9 ml 100 μg/ml DNase-opløsning).
- Kombiner de relevante mængder DNase-stamopløsning og cellekulturmedier. Brug af DNase i arbejdsløsningen hjælper med at forhindre celleklumpning og gør det muligt at pode celler jævnt.
8. RPE-cellesåning
- Efter centrifugering i trin 6.3 fjernes supernatanter fra hvert 15 ml centrifugeglas, idet det sikres, at cellepellettet ikke forstyrres.
- Resuspender hver cellepille i 3 ml DNase-arbejdsløsning.
- De 15 ml centrifugeglas indeholdende de resuspenderede celler anbringes i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i 15 minutter.
- Efter inkubation centrifugeres cellesuspensionerne ved 150 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanterne fjernes, og pas på ikke at forstyrre cellepillerne.
- Resuspender hver cellepille i 3 ml friske cellekulturmedier.
- For hvert centrifugerør, der indeholder RPE-celler med 2-3 øjne, frø en brønd i en 6-brøndplade (passage 0).
- Overfør forsigtigt den frøede 6-brønds plade til en befugtet inkubator ved 37 °C og 5% CO2.
9. Primær RPE-cellekultur hos svin
- Lad de nysåede RPE-celler fastgøre i 48-72 timer, før du flytter pladen. Under det første medieskift kan der udføres en vask med friske cellekulturmedier for at hjælpe med at fjerne overskydende celleaffald.
- Udskift cellekulturmediet hver 48. time.
- Når celler når sammenløb, overgang til et cellekulturmedie med en FBS-koncentration på 2% og opretholdes indtil eksperimentering.
10. Validering af RPE-celler
- Immunocytokemisk (ICC) farvning
- Fix celler i 4% formaldehyd i DPBS i 10 min ved stuetemperatur.
- Vask to gange med DPBS.
- Permeabiliser celler (hvis nødvendigt) ved hjælp af 0,2% Triton-X 100 i DPBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Vask to gange med DPBS.
- Påfør blokerende opløsning af 3% (w/v) bovint serumalbumin (BSA) i DPBS i 1 time ved stuetemperatur.
- Der tilsættes primært antistof ved 1:100 fortynding (eller den anbefalede producentkoncentration) (se materialetabellen) og lad det sidde i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
- Vask tre gange med DPBS i 5 minutter hver.
- Tilsæt sekundært antistof (om nødvendigt) ved 2 μg/ml (eller anbefalet producentkoncentration) (se materialetabellen) og lad det sidde i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask tre gange med DPBS i 5 minutter hver, hvis sekundært antistof påføres.
- Tilsæt nuklear farvningssonde ved producentens koncentration (se materialetabel) og lad den sidde i 25 minutter ved stuetemperatur.
- Vask tre gange med PBS i 5 min hver.
- Hvis det er på en cellekulturindsats, monteres det på mikroskopglas med et dæksel ved hjælp af monteringsmedium som skitseret af Rickabaugh og Weatherston et al.20. Ellers billedceller i DPBS.
- Scanning elektronmikroskopi (SEM)
- Følg proceduren beskrevet af Harris et al.21.
- Trans epitel elektrisk modstand (TEER)
- Følg producentens protokol for TEER-måling (se materialetabellen) med 1 ml dyrkningsmedium i basalkammeret15.
- Enzymbundet immunosorbentassay (ELISA)
- ELISA15 udføres ved hjælp af et multiplex-humant enzymbundet immunosorbentassaysæt efter producentens protokol (se materialetabellen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne procedure blev primære RPE-celler med succes isoleret fra svineøjne. Figur 1A viser RPE-celler 3 dage efter isolering med karakteristisk pigmentering. Efter 1 uges vækst var cellerne fuldt sammenflydende og dannede et sundt monolag (figur 1B). Celler blev derefter overført til cellekulturindsatser, hvor de opretholdt deres pigmentering og morfologi (figur 1C), hvilket yderligere understøttede effektiviteten af isolationsproceduren. Kulturer, der ikke udviste disse egenskaber og i stedet viste variantmorfologi og overdreven pigmentering (figur 1D), blev mistænkt for cellulær kontaminering og ikke anvendt i forsøg. RPE-celler isoleret i dette manuskript udtrykker RPE65, et protein, der er stærkt udtrykt i RPE-celler (figur 2). De områder, hvor RPE65-ekspression forekommer lavere, skyldes sandsynligvis pigmentering, der blokerer fluorescensen, da disse områder svarer til mere stærkt pigmenterede celler (figur 2A). Et andet karakteristisk protein udtrykt af de isolerede RPE-celler var VEGF. Efter 10 dage blev VEGF udtrykt mere på den basale side af RPE-monolaget med en koncentration på 2612,5 ± 28,0 pg/ml sammenlignet med den apikale side med en koncentration på 2141,2 ± 53,5 pg/ml (figur 3). Primære svin RPE-celler har også mikrovilli og brostensmorfologi (figur 4). Derudover steg TEER-aflæsningerne, når de blev dyrket på cellekulturindsatser, fra 166,1 ± 75,9 Ω∙cm2 efter 7 dage til 363,4 ± 9,0 Ω∙cm2 efter 14 dage (figur 5), hvilket indikerer konsistent, sund tæt krydsdannelse over tid22. For yderligere at undersøge krydsdannelse blev RPE-celler analyseret for ZO-1-ekspression, som blev lokaliseret til cellegrænser, hvilket indebærer sund krydsdannelse og monolagintegritet (figur 6).
Figur 1: Primær RPE efter såning på brøndplader og subkultur. Sunde RPE-celler 3 dage efter isolation (A), fuldt sammenflydende monolag 7 dage efter isolering (B), RPE med succes passeret på en kulturindsats (C) og områder med potentiel cellulær kontaminering (pile) på en RPE-kultur (D). Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Immunocytokemiske billeder, der viser RPE65-ekspression i RPE-celler hos svin. Brightfield (A), RPE65 (B), kerner (C) og flettede (D) billeder af celler 15 dage efter såning. Bemærk, at den kornede baggrund i brightfield-billedet er den porøse kulturindsatsmembran. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: VEGF-ekspression i apikale og basale sider af RPE-monolaget. VEGF-koncentrationen blev bestemt ved en ELISA udført efter 10 dages cellevækst på kulturindsatser. Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelse med n = 2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Scanning elektronmikroskopi (SEM) billede af primære svin RPE celler. Celler blev dyrket i 30 dage før billeddannelse. Skalabjælke = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: TEER-aflæsninger udført på RPE-celler dyrket på cellekulturindsatser. Modstandsværdier efter 7, 10 og 14 dages vækst. Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelse med n = 3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Immunocytokemiske billeder, der viser ZO-1-ekspression i RPE-celler hos svin. Brightfield (A) ZO-1 (B), kerner (C) og fusionerede (D) billeder af celler 6 dage efter såning på glasbundsbrøndplader. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver, hvordan man isolerer RPE-celler fra svineøjne. Pigmentering og brostensmorfologi ses inden for 7 dage efter isolation (figur 1B). Desuden indikerer TEER-data tæt forbindelsesdannelse22 og et sundt monolag (figur 5). Disse resultater viser, at RPE-celler isoleret med denne metode ligner human RPE og kan være gavnlige i retinale cellekulturmodeller.
Øjnene, der bruges i dette manuskript, er hentet post mortem fra en lokal slagterbutik, men kan også fås fra andre kilder, såsom akademiske omgivelser med samarbejdspartnere, der bruger svineprodukter. Det er vigtigt at begynde proceduren så hurtigt som muligt efter dyrets død og at holde øjnene kølige inden proceduren. Under isoleringen er det vigtigt ikke at forstyrre RPE før triturering efter trypsinisering. Denne pleje er mest kritisk, når man skræller nethinden af, da manglende forsigtighed kan føre til at gribe Bruchs membran1 med pincetten og indføre andre celletyper i opløsningen.
Selvom denne procedure er optimeret til vores forhold, kan der foretages nogle ændringer i metoden. For eksempel, hvis der ønskes specifikke såtætheder, kan celler tælles efter DNase-inkubationen. Derudover, hvis vakuumaspiration ikke fungerer, kan den neurale nethinden fjernes ved omhyggeligt at trimme med en lille, buet saks. Ved såning til forsøg kan en høj såtæthed såsom 2,5 x 105 celler /cm2 bruges til at forhindre overskydende cellulær deling. Desuden anbefales gentagen passaging ikke, da cellerne kan begynde at miste deres oprindelige fænotyper. Mens denne undersøgelse har brugt passage 1-celler til eksperimenter, kan yderligere passager potentielt bruges, hvis RPE-fænotype og egenskaber opretholdes. Endelig kan en koncentration på 1% FBS bruges til subkultur eller eksperimentering i stedet for 2%, hvis det ønskes.
Der er et par ulemper ved denne metode. For det første er det vanskeligt at replikere eller opnå dyrenes alder, køn, race og dødstidspunkt, som er almindelige problemer i primær celleisolering. For det andet kan overtrypsinisering hurtigt resultere i unormale celler, hvilket også er blevet bemærket af Fietz et al17. I sidste ende tilbyder denne metode imidlertid en billig og effektiv måde at opnå primære RPE-celler på. Disse celler kræver ikke lange differentieringstider som iPSC'er. Disse svin RPE har også medfødt nøglestrukturer, som mikrovilli og pigmentering15,16, i modsætning til deres ikke-differentierede modstykker. Som sådan tilbyder disse celler en mere repræsentativ celletype til retinale undersøgelser. Endelig kan denne metode være meget gavnlig for flere landdistrikter eller institutioner, der ikke har adgang til menneskelige donorøjne til at producere retinale modeller analogt med menneskelige modeller til forståelse af syn og sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Farhad Farjood for hjælp med svin RPE-cellekultur og isolering og Thomas Harris for hjælp med SEM. Forfatterne anerkender støtten fra Microscopy Core Facility ved Utah State University til SEM-analysen. Anlægget vedligeholder et scanningelektronmikroskop erhvervet gennem et National Science Foundation Major Research Instrumentation Grant (CMMI-1337932). Finansiering til denne undersøgelse blev leveret af et National Institutes of Health gennem Grant 1R15EY028732 (Vargis) og et BrightFocus Foundation Grant M2019109 (Vargis). Yderligere finansiering blev ydet af et Undergraduate Research and Creative Opportunities Grant (Weatherston) fra Utah State University's Office of Research og et frøtilskud (Vargis) fra Utah State University's Alzheimers Disease and Dementia Research Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified - calcium - magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch's membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Georgiadis, A., et al. The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice. PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Yang, S., Zhou, J., Li, D. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).
- Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).
- Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function. Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).
- Hellinen, L., et al. Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model. Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Samuel, W., et al. Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells. Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).
- Middleton, S.
- Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis. Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).
- Paterson, C., Cannon, J., Vargis, E. The impact of early RPE cell junction loss on VEGF, Ang-2, and TIMP secretion in vitro. , http://www.molvis.org/molvis/v29/87/ (2023).
- Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures. STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).
- Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).
- Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of bruch's membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).
- Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch's membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).
- Zou, X. L., et al. Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide. International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).
