Summary
Questo protocollo delinea la procedura per ottenere e coltivare cellule epiteliali pigmentate retiniche primarie (RPE) da occhi suini di provenienza locale. Queste cellule rappresentano un'alternativa di alta qualità alle cellule staminali e sono adatte per la ricerca retinica in vitro .
Abstract
L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato cruciale nella retina esterna responsabile del supporto dei fotorecettori. La degenerazione RPE si verifica comunemente in malattie caratterizzate da perdita progressiva della vista, come la degenerazione maculare legata all'età (AMD). La ricerca sull'AMD spesso si basa sugli occhi di donatori umani o sulle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) per rappresentare l'RPE. Tuttavia, queste fonti di RPE richiedono periodi di differenziazione prolungati e una notevole esperienza per la coltura. Inoltre, alcuni istituti di ricerca, in particolare quelli nelle aree rurali, non hanno un facile accesso agli occhi dei donatori. Sebbene esista una linea cellulare RPE immortalizzata disponibile in commercio (ARPE-19), manca delle caratteristiche essenziali di RPE in vivo e non è ampiamente accettata in molte pubblicazioni di ricerca oftalmologica. C'è un urgente bisogno di ottenere cellule RPE primarie rappresentative da una fonte più prontamente disponibile ed economica. Questo protocollo chiarisce l'isolamento e la sottocoltura di cellule RPE primarie ottenute post-mortem da occhi suini, che possono essere reperite localmente da fornitori commerciali o accademici. Questo protocollo richiede materiali comuni che si trovano tipicamente nei laboratori di coltura tissutale. Il risultato è un'alternativa primaria, differenziata ed economica alle iPSC, agli occhi dei donatori umani e alle cellule ARPE-19.
Introduction
L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato situato nella retina esterna tra la membrana di Bruch e i fotorecettori1. Le cellule RPE formano giunzioni strette con proteine come zonula occludens-1 (ZO-1) e possiedono un fenotipo distintivo caratterizzato da pigmentazione e morfologia esagonale 2,3. Queste cellule contribuiscono alla barriera emato-retinica, supportando così la salute dei fotorecettori e mantenendo l'omeostasi retinica 4,5. Inoltre, le cellule RPE svolgono un ruolo fondamentale nella visione assorbendo la luce e riciclando i componenti essenziali per i fotorecettori6. Ad esempio, RPE65, una proteina altamente espressa nelle cellule RPE, converte gli esteri retinilici all-trans in retinolo 11-cis 7,8. Data la moltitudine di funzioni svolte dalle cellule RPE, la loro disfunzione è implicata in varie malattie, tra cui la degenerazione maculare legata all'età e la retinopatia diabetica 9,10. Per migliorare la comprensione delle patologie retiniche e sviluppare nuovi trattamenti, vengono spesso utilizzati modelli in vitro della retina.
Per generare modelli rappresentativi di retine sane o malate, è imperativo utilizzare un tipo di cellula RPE mimetica. La linea cellulare ARPE-19 disponibile in commercio manca di fenotipi nativi, come la pigmentazione, mentre le iPSC possono richiedere mesi per differenziarsi 11,12,13. Sebbene gli occhi dei donatori umani possano essere l'ideale, spesso non sono prontamente disponibili per molti laboratori di ricerca.
Qui, abbiamo ideato un metodo per utilizzare gli occhi suini, che condividono molte somiglianze con gli occhi umani14, per ottenere cellule RPE primarie. Queste cellule RPE primarie suine sono state utilizzate in più modelli retinici 15,16. Non solo queste cellule sono convenienti, ma richiedono anche meno tempo per essere acquisite rispetto alle iPSC o agli occhi dei donatori. Inoltre, presentano caratteristiche native, come la pigmentazione e i microvilli. Sebbene esistano protocolli simili per l'estrazione di RPE suina 17,18,19, questa tecnica semplice e dettagliata convalida ulteriormente la dissociazione enzimatica e impiega materiali comunemente trovati nella maggior parte dei laboratori di colture cellulari.
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Protocol
Gli occhi utilizzati in questa procedura sono ottenuti post-mortem da una macelleria locale, ispezionata dall'USDA, e nessun lavoro viene eseguito utilizzando animali vivi. Dopo che gli animali sono stati sacrificati, passano circa 2 ore prima che gli occhi vengano enucleati. Poiché può iniziare a verificarsi la carie dei tessuti, è importante mantenere gli occhi freschi durante il trasporto per prevenire un'ulteriore carie. In questa procedura, gli occhi vengono immediatamente posti in frigorifero dopo l'enucleazione. Successivamente, la sacca di occhi viene posizionata all'interno di un becher in polipropilene da 1000 ml e circondata da ghiaccio all'interno di un refrigeratore da 8 L. È importante non appoggiare gli occhi direttamente sul ghiaccio. Una volta che gli occhi arrivano in laboratorio, l'isolamento delle cellule RPE viene effettuato all'interno di una cabina di biosicurezza. È fondamentale completare questo processo entro 3-5 ore. Questo protocollo è stato ottimizzato per l'elaborazione di 10 occhi.
1. Preparazione delle aliquote di stock DNase
NOTA: Si consiglia di eseguire questo passaggio prima dell'isolamento.
- Preparare una soluzione di cloruro di calcio 5 mM con acqua deionizzata sterile.
ATTENZIONE: La polvere di cloruro di calcio può causare gravi irritazioni o danni agli occhi. Indossare DPI adeguati. - Aggiungere una soluzione di cloruro di calcio 5 mM alla polvere di DNasi (vedere la tabella dei materiali) per ottenere una concentrazione finale di DNasi di 3 mg/mL. Assicurarsi che la soluzione sia miscelata accuratamente.
ATTENZIONE: La DNasi è un pericolo di sensibilizzazione respiratoria. Non inalare polvere/sostanza. - Aliquote di piccoli volumi, ad esempio 1 mL, in provette per microcentrifuga.
- Congelare le aliquote a -20 °C fino all'utilizzo.
2. Allestimento dell'area di dissezione
- Trasferire gli strumenti sterili di dissezione e l'attrezzatura per la coltura cellulare nell'armadio di biosicurezza: telo chirurgico, piastre di Petri, filtri cellulari, piastre a pozzetti, garze, pinzette, manico per bisturi, lama per bisturi e forbici per iride (vedere Tabella dei materiali).
- Usando una pinzetta, stendi il telo chirurgico. Posizionare una piastra a 6 pozzetti sopra il telo chirurgico e rimuovere il coperchio.
- Posizionare un'aliquota di soluzione salina tamponata con fosfato sterile di Dulbecco (DPBS) su ghiaccio e nell'armadio di biosicurezza.
- Riempire un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti piena a metà (circa 6 ml) di soluzione di iodio povidone al 10%.
- Riempire i pozzetti rimanenti con DPBS refrigerati.
- Rimuovere il coperchio da una delle piastre di Petri e posizionarlo, capovolto, sopra il telo chirurgico. Metti da parte la base della capsula di Petri come contenitore per i rifiuti.
- Mettere un'aliquota di terreno di coltura cellulare (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% di siero fetale bovino (FBS), 1% di antibiotici/antimicotici) e un'aliquota di tripsina/EDTA allo 0,25% in un bagnomaria a 37 °C.
- Rimuovere la soluzione madre DNase dal congelatore (vedere il resto del protocollo per maggiori dettagli).
3. Rimozione del tessuto esterno
NOTA: La rimozione del tessuto esterno può essere eseguita al di fuori dell'armadio di biosicurezza. Ispezionare l'occhio prima del taglio per assicurarsi che la sclera non sia stata perforata, che la pupilla non sia appannata e che sia presente il nervo ottico. Scartare gli occhi che non soddisfano questi criteri.
- Mentre tieni il muscolo attaccato all'occhio con una mano, usa l'altra mano per tagliare delicatamente il tessuto che circonda la sclera con un bisturi. Fare attenzione a non schiacciare l'occhio o tagliare accidentalmente la sclera. Se la sclera è tagliata ed espone l'interno nero, scartare l'occhio.
ATTENZIONE: Si consiglia vivamente di utilizzare un guanto resistente al taglio per la mano che tiene il muscolo per proteggersi da tagli accidentali. - Tagliare il nervo ottico con forbici per iride curve a una lunghezza non superiore a 3 mm. Se il nervo ottico è troppo lungo, l'oculare non si posizionerà correttamente nel filtro cellulare in seguito.
- Appoggia l'occhio sul ghiaccio con la cornea rivolta verso il basso.
- Ripetere i passaggi 3.1-3.3 fino a quando il tessuto esterno non viene rimosso da ciascun occhio.
4. Dissezione dell'occhio
- Utilizzare una pinzetta per trasferire un occhio nella cabina di biosicurezza e nel pozzetto contenente una soluzione di iodio povidone al 10% e ruotare l'occhio per assicurarsi che sia completamente rivestito nella soluzione di iodio. Per mantenere gli strumenti il più sterili possibile, queste pinzette devono essere utilizzate solo per toccare l'esterno dell'occhio.
- Mentre l'occhio è immerso nella soluzione di iodio, posizionare una garza sterile sul coperchio poco profondo e rovesciato della capsula di Petri preparata in precedenza. In una capsula di Petri separata, posizionare un colino per cellule. Utilizzare il filtro cellulare solo per sostenere l'oculare, non per la separazione cellulare.
- Dopo aver lasciato riposare l'occhio in una soluzione di iodio per circa 30 secondi, lavare l'occhio immergendolo nei pozzetti contenenti DPBS per circa 5 secondi ciascuno, spostandosi da un pozzetto all'altro per diluire progressivamente la soluzione di iodio e trasferire l'occhio sulla garza sterile.
- Fai una piccola incisione usando un bisturi sotto l'ora serrata, o circa 1/3 del globo dal bordo dell'iride.
- Dopo l'incisione, utilizzare le forbici per iride per tagliare uniformemente lungo la circonferenza del globo, parallelamente alla cornea. Quando si manovra l'occhio, utilizzare le pinzette solo per toccare l'esterno dell'occhio o la garza per mantenere la sterilità.
- Usa le pinzette per afferrare il nervo ottico e sollevare delicatamente il globo dalla garza. Il vitreo dovrebbe cadere dal globo. Se necessario, scuotere delicatamente l'occhio per aiutare a rimuovere il vitreo.
NOTA: Se il vitreo è molto difficile da rimuovere, provare a tagliare più in basso sul globo. - Posizionare delicatamente l'oculare nel colino per celle preparato, con l'interno dell'oculare rivolto verso l'alto. Se irregolare, usa una pinzetta per regolare l'oculare per ottenere l'incisione il più livellata possibile.
- Aggiungere delicatamente DPBS raffreddato all'oculare in modo che il livello del fluido sia appena al di sotto del punto più basso dell'incisione. Questo DPBS verrà rimosso dopo la rimozione della retina neurale.
NOTA: Il volume di DPBS aggiunto varia a seconda delle dimensioni dell'occhio e della posizione dell'incisione. - Ripetere i passaggi 4.1-4.8 fino a quando tutti gli occhi non sono stati sezionati.
5. Rimozione della retina neurale e dissociazione RPE
NOTA: La sezione seguente è più facile da eseguire in più fasi. In questa configurazione, questo processo viene eseguito su un lotto (di solito 3 conchiglie oculari) alla volta. Per i passaggi da 5.1 a 5.7, ogni passaggio deve essere eseguito sull'intero batch prima di passare al passaggio successivo.
- Sotto una torcia, trova tutte le aree in cui la retina neurale (bianca/rosa) sta iniziando a staccarsi dall'RPE (nera). Quindi, usa una pinzetta smussata per afferrare delicatamente la retina neurale sollevata e staccarla.
NOTA: Se non ci sono aree in cui la retina neurale si sta staccando, usa le pinzette per afferrarla delicatamente vicino alla parte superiore dell'oculare. Utilizzando questo metodo, se viene arrecato un danno all'RPE/coroide, tali cellule non verranno dissociate durante la raccolta dell'RPE. - Raccogli delicatamente la retina neurale vicino al disco ottico.
- Aspirare la retina neurale utilizzando una pipetta Pasteur collegata a un sistema di aspirazione sottovuoto. Si consiglia di sfumare l'aspirazione per aiutare nel processo di rimozione.
NOTA: È possibile posizionare un puntale di pipetta all'estremità di una pipetta Pasteur per ridurre l'aspirazione. - Aggiungere con cautela ulteriori DPBS raffreddati per sostituire ciò che è stato aspirato.
- Rimuovere la retina neurale rimanente aspirando ancora una volta. Questa volta, rimuovere il maggior numero possibile di DPBS senza disturbare l'RPE esposto.
- Aggiungi delicatamente la tripsina alla conchiglia oculare. Mantenere il livello del volume al di sotto della linea di incisione e di eventuali sezioni di RPE danneggiate per ridurre la contaminazione.
ATTENZIONE: La tripsina è un enzima che provoca irritazione alla pelle e agli occhi al contatto. Indossare DPI adeguati. - Dopo aver aggiunto la tripsina a ciascun occhio, assicurarsi che il coperchio della piastra di Petri sia sostituito. Successivamente, trasferire la capsula di Petri in un'incubatrice umidificata a 37 °C e 5% di CO2 per 30 min.
- Ripetere i passaggi 5.1-5.7 per ogni lotto fino a quando tutte le conchiglie oculari non sono state elaborate.
6. Raccolta RPE
- Raccogliere le cellule RPE da ciascun lotto di occhi (2-3 occhi) e inserirle in un'unica provetta da centrifuga da 15 mL per semplificare il processo di semina.
- Sotto una torcia, triturare delicatamente utilizzando una pipetta da 1000 μL per rimuovere le cellule RPE. Se le cellule RPE non si staccano, aggiungere tripsina fresca e incubare per altri 10-15 minuti. Fare attenzione a non raschiare la retina.
- Raccogliere le cellule RPE in una provetta da centrifuga da 15 mL.
- Lavare l'oculare con terreni di coltura cellulare per raccogliere le cellule rimanenti e neutralizzare la tripsina. Assicurarsi che ci sia almeno il doppio del volume di terreno rispetto alla tripsina nella provetta da centrifuga da 15 mL.
- Ripetere il passaggio 6.1 fino a quando le cellule RPE non sono state raccolte da tutte le conchiglie oculari.
- Centrifugare le sospensioni cellulari a 250 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
7. Preparazione della soluzione di lavoro DNase
- Calcolare il volume di 3 mg/mL di soluzione madre di DNasi (preparata nella fase 1) necessaria da aggiungere al terreno di coltura cellulare per una concentrazione finale di 100 μg/mL e un volume finale di 3 mL per provetta di cellule (cioè, per tre provette da centrifuga di cellule, sono necessari 9 mL di soluzione di DNasi da 100 μg/mL).
- Combinare i volumi appropriati di soluzione madre DNasi e terreni di coltura cellulare. L'uso della DNasi nella soluzione di lavoro aiuta a prevenire l'aggregazione cellulare e consente di seminare le cellule in modo uniforme.
8. Semina di cellule RPE
- Dopo la centrifugazione nella fase 6.3, rimuovere i surnatanti da ciascuna provetta da centrifuga da 15 mL, facendo attenzione a non interrompere il pellet cellulare.
- Risospendere ogni pellet cellulare in 3 mL di soluzione di lavoro DNasi.
- Mettere le provette da centrifuga da 15 mL contenenti le cellule risospese in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2 per 15 minuti.
- Dopo l'incubazione, centrifugare le sospensioni cellulari a 150 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere i surnatanti, facendo attenzione a non rompere i pellet cellulari.
- Risospendere ogni pellet cellulare in 3 mL di terreno di coltura cellulare fresco.
- Per ogni provetta da centrifuga contenente 2-3 occhi di cellule RPE, seminare un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti (passaggio 0).
- Trasferire con cautela la piastra a 6 pozzetti seminata in un incubatore umidificato a 37 °C e al 5% di CO2 .
9. Colture cellulari primarie di RPE suina
- Lasciare che le cellule RPE appena seminate si attacchino per 48-72 ore prima di spostare la piastra. Durante il primo cambio del terreno, è possibile eseguire un lavaggio con terreni di coltura cellulare freschi per aiutare a rimuovere i detriti cellulari in eccesso.
- Sostituire il terreno di coltura cellulare ogni 48 ore.
- Quando le cellule raggiungono la confluenza, passare a un terreno di coltura cellulare con una concentrazione di FBS del 2% e mantenerlo fino alla sperimentazione.
10. Validazione della cella RPE
- Colorazione immunocitochimica (ICC)
- Fissare le cellule in formaldeide al 4% in DPBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare due volte con DPBS.
- Permeabilizzare le cellule (se necessario) utilizzando Triton-X 100 allo 0,2% in DPBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare due volte con DPBS.
- Applicare una soluzione bloccante di albumina sierica bovina (BSA) al 3% (p/v) in DPBS per 1 ora a temperatura ambiente.
- Aggiungere l'anticorpo primario alla diluizione 1:100 (o alla concentrazione raccomandata dal produttore) (vedere la tabella dei materiali) e lasciare agire per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C.
- Lavare tre volte con DPBS per 5 minuti ciascuna.
- Aggiungere l'anticorpo secondario (se necessario) a 2 μg/mL (o concentrazione raccomandata dal produttore) (vedere la tabella dei materiali) e lasciare riposare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare tre volte con DPBS per 5 minuti ciascuna se viene applicato l'anticorpo secondario.
- Aggiungere la sonda di colorazione nucleare alla concentrazione del produttore (vedere la tabella dei materiali) e lasciare riposare per 25 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna.
- Se si tratta di un inserto per coltura cellulare, montare sul vetrino del microscopio con un vetrino coprioggetto utilizzando un mezzo di montaggio come descritto da Rickabaugh e Weatherston et al.20. In caso contrario, le celle dell'immagine in DPBS.
- Microscopia elettronica a scansione (SEM)
- Seguire la procedura descritta da Harris et al.21.
- Resistenza elettrica transepiteliale (TEER)
- Seguire il protocollo del produttore per la misurazione del TEER (vedere la tabella dei materiali) con 1 mL di terreno di coltura nella camera basale15.
- Test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)
- Eseguire l'ELISA15 utilizzando un kit di immunoassorbimento enzimatico umano multiplex seguendo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali).
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Representative Results
Utilizzando questa procedura, le cellule RPE primarie sono state isolate con successo dagli occhi suini. La Figura 1A mostra le cellule RPE 3 giorni dopo l'isolamento con pigmentazione caratteristica. Dopo 1 settimana di crescita, le cellule erano completamente confluenti e formavano un monostrato sano (Figura 1B). Le cellule sono state quindi trasferite in inserti di coltura cellulare dove hanno mantenuto la loro pigmentazione e morfologia (Figura 1C), supportando ulteriormente l'efficacia della procedura di isolamento. Le colture che non presentavano queste caratteristiche e mostravano invece una morfologia variante e un'eccessiva pigmentazione (Figura 1D) sono state sospettate di contaminazione cellulare e non sono state utilizzate negli esperimenti. Le cellule RPE isolate in questo manoscritto esprimono RPE65, una proteina altamente espressa nelle cellule RPE (Figura 2). Le aree in cui l'espressione di RPE65 appare più bassa sono probabilmente dovute alla pigmentazione che blocca la fluorescenza, poiché tali aree corrispondono a cellule più fortemente pigmentate (Figura 2A). Un'altra proteina caratteristica espressa dalle cellule RPE isolate era il VEGF. Dopo 10 giorni, il VEGF è stato espresso maggiormente sul lato basale del monostrato RPE con una concentrazione di 2612,5 ± 28,0 pg/mL rispetto al lato apicale con una concentrazione di 2141,2 ± 53,5 pg/mL (Figura 3). Le cellule primarie di RPE suina hanno anche una morfologia di microvilli e ciottoli (Figura 4). Inoltre, quando sono stati coltivati su inserti di coltura cellulare, le letture di TEER sono aumentate da 166,1 ± 75,9 Ω∙cm2 a 7 giorni a 363,4 ± 9,0 Ω∙cm2 dopo 14 giorni (Figura 5), indicando una formazione di giunzioni strette coerente e sana nel tempo22. Per studiare ulteriormente la formazione di giunzioni, le cellule RPE sono state analizzate per l'espressione di ZO-1, che è stata localizzata ai confini cellulari, il che implica la formazione di giunzioni sane e l'integrità del monostrato (Figura 6).
Figura 1: RPE primario dopo essere stato seminato su piastre di pozzetto e subcoltivato. Cellule RPE sane 3 giorni dopo l'isolamento (A), monostrato completamente confluente 7 giorni dopo l'isolamento (B), RPE passato con successo su un inserto di coltura (C) e aree di potenziale contaminazione cellulare (frecce) su una coltura RPE (D). Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini immunocitochimiche che mostrano l'espressione di RPE65 in cellule RPE suine. Immagini in campo chiaro (A), RPE65 (B), nuclei (C) e immagini unite (D) delle cellule 15 giorni dopo la semina. Si noti che lo sfondo granuloso nell'immagine in campo chiaro è la membrana porosa dell'inserto di coltura. Barra della scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Espressione di VEGF nei lati apicale e basale del monostrato RPE. La concentrazione di VEGF è stata determinata mediante un test ELISA eseguito dopo 10 giorni di crescita cellulare su inserti di coltura. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard con n = 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagine al microscopio elettronico a scansione (SEM) di cellule RPE primarie suine. Le cellule sono state coltivate per 30 giorni prima dell'imaging. Barra della scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Letture di TEER eseguite su cellule RPE coltivate su inserti di coltura cellulare. Valori di resistenza dopo 7, 10 e 14 giorni di crescita. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard con n = 3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Immagini immunocitochimiche che mostrano l'espressione di ZO-1 nelle cellule RPE suine. Immagini in campo chiaro (A) ZO-1 (B), nuclei (C) e immagini unite (D) delle cellule 6 giorni dopo la semina su piastre a pozzetti con fondo in vetro. Barra della scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive come isolare le cellule RPE dagli occhi suini. La pigmentazione e la morfologia del ciottolo sono visibili entro 7 giorni dall'isolamento (Figura 1B). Inoltre, i dati TEER indicano la formazione di giunzioni strette22 e un monostrato sano (Figura 5). Questi risultati mostrano che le cellule RPE isolate con questo metodo sono simili all'RPE umano e possono essere utili nei modelli di coltura cellulare retinica.
Gli occhi utilizzati in questo manoscritto sono ottenuti post-mortem da una macelleria locale, ma potrebbero anche essere ottenuti da altre fonti, come ambienti accademici con collaboratori che utilizzano prodotti suini. È importante iniziare la procedura il prima possibile dopo la morte dell'animale e mantenere gli occhi freschi prima della procedura. Durante l'isolamento, è essenziale non interrompere l'RPE fino alla triturazione dopo la tripsinizzazione. Questa cura è molto importante quando si sbuccia la retina neurale, poiché la mancanza di cautela può portare ad afferrare la membrana1 di Bruch con le pinzette e introdurre altri tipi di cellule nella soluzione.
Sebbene questa procedura sia stata ottimizzata per le nostre condizioni, è possibile apportare alcune modifiche alla metodologia. Ad esempio, se si desiderano densità di semina specifiche, le cellule possono essere contate dopo l'incubazione della DNasi. Inoltre, se l'aspirazione sottovuoto non funziona, la retina neurale può essere rimossa tagliando con cura con piccole forbici curve. Durante la semina per gli esperimenti, è possibile utilizzare un'elevata densità di semina come 2,5 x 105 cellule/cm2 per prevenire l'eccessiva divisione cellulare. Inoltre, il passaggio ripetuto non è raccomandato in quanto le cellule possono iniziare a perdere i loro fenotipi nativi. Sebbene questo studio abbia utilizzato cellule di passaggio 1 per gli esperimenti, potrebbero potenzialmente essere utilizzati passaggi aggiuntivi se il fenotipo e le caratteristiche RPE vengono mantenuti. Infine, una concentrazione dell'1% di FBS può essere utilizzata per la sottocoltura o la sperimentazione invece del 2%, se lo si desidera.
Ci sono alcuni svantaggi in questo metodo. In primo luogo, è difficile replicare o ottenere l'età, il sesso, la razza e l'ora di morte degli animali, che sono problemi comuni nell'isolamento delle cellule primarie. In secondo luogo, l'eccessiva tripsinizzazione può portare rapidamente a cellule anormali, che è stato notato anche da Fietz et al17. Tuttavia, in definitiva, questo metodo offre un modo economico ed efficiente per ottenere cellule RPE primarie. Queste cellule non richiedono lunghi tempi di differenziazione come le iPSC. Questi RPE suini hanno anche strutture chiave innate, come i microvilli e la pigmentazione 15,16, a differenza delle loro controparti non differenziate. In quanto tali, queste cellule offrono un tipo di cellula più rappresentativo per gli studi sulla retina. Infine, questo metodo potrebbe essere molto utile per le aree più rurali o per le istituzioni che non hanno accesso agli occhi dei donatori umani per produrre modelli retinici analoghi ai modelli umani per comprendere la vista e la malattia.
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Disclosures
Nessuno.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Farhad Farjood per l'aiuto con la coltura e l'isolamento di cellule RPE suine e Thomas Harris per l'aiuto con il SEM. Gli autori riconoscono il supporto della Microscopy Core Facility presso la Utah State University per l'analisi SEM. La struttura mantiene un microscopio elettronico a scansione acquisito attraverso una sovvenzione della National Science Foundation Major Research Instrumentation Grant (CMMI-1337932). Il finanziamento per questo studio è stato fornito da un National Institutes of Health attraverso la sovvenzione 1R15EY028732 (Vargis) e una sovvenzione della BrightFocus Foundation M2019109 (Vargis). Ulteriori finanziamenti sono stati forniti da una sovvenzione per la ricerca universitaria e le opportunità creative (Weatherston) dell'Ufficio di ricerca della Utah State University e da una sovvenzione iniziale (Vargis) dal Centro di ricerca sulla malattia di Alzheimer e la demenza della Utah State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified - calcium - magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
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