Summary
В этом протоколе описывается процедура получения и культивирования первичных клеток пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) из глаз свиней местного происхождения. Эти клетки служат высококачественной альтернативой стволовым клеткам и подходят для исследований сетчатки in vitro .
Abstract
Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) является важным монослоем во внешней части сетчатки, отвечающим за поддержку фоторецепторов. Дегенерация РПЭ обычно возникает при заболеваниях, характеризующихся прогрессирующей потерей зрения, таких как возрастная макулярная дегенерация (ВМД). Исследования ВМД часто опираются на донорские глаза человека или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) для представления РПЭ. Однако эти источники РПЭ требуют длительных периодов дифференциации и значительного опыта для культивирования. Кроме того, некоторые научно-исследовательские институты, особенно в сельской местности, не имеют легкого доступа к донорским глазам. Несмотря на то, что существует коммерчески доступная иммортализированная клеточная линия RPE (ARPE-19), она не обладает существенными характеристиками RPE in vivo и не получила широкого распространения во многих научных публикациях по офтальмологии. Существует насущная потребность в получении репрезентативных первичных клеток РПЭ из более доступного и экономически эффективного источника. Этот протокол разъясняет изоляцию и субкультуру первичных клеток РПЭ, полученных посмертно из свиных глаз, которые могут быть получены на месте у коммерческих или академических поставщиков. Для этого протокола требуются обычные материалы, которые обычно встречаются в лабораториях для культивирования тканей. В результате получается первичная, дифференцированная и экономически эффективная альтернатива ИПСК, донорским глазам человека и клеткам ARPE-19.
Introduction
Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) представляет собой монослой, расположенный в наружной части сетчатки между мембраной Бруха и фоторецепторами1. Клетки RPE образуют плотные соединения с белками, такими как zonula occludens-1 (ZO-1), и обладают характерным фенотипом, характеризующимся пигментацией и гексагональной морфологией 2,3. Эти клетки вносят свой вклад в гемато-ретинальный барьер, тем самым поддерживая здоровье фоторецепторов и поддерживая гомеостаз сетчатки 4,5. Кроме того, клетки RPE играют важнейшую роль в зрении, поглощая свет и перерабатывая важныекомпоненты для фоторецепторов. Например, RPE65, белок, высоко экспрессируемый в клетках RPE, превращает полностью транс-ретиниловые эфиры в 11-цис-ретинол 7,8. Учитывая множество функций, выполняемых клетками РПЭ, их дисфункция связана с различными заболеваниями, включая возрастную макулярную дегенерацию и диабетическую ретинопатию 9,10. Для углубления понимания патологий сетчатки и разработки новых методов лечения часто используются модели сетчатки in vitro.
Для создания репрезентативных моделей здоровой или больной сетчатки необходимо использовать миметический тип клеток RPE. Коммерчески доступная клеточная линия ARPE-19 не имеет нативных фенотипов, таких как пигментация, в то время как ИПСК могут дифференцироваться месяцами 11,12,13. Несмотря на то, что донорские глаза человека могут быть идеальными, они часто недоступны для многих исследовательских лабораторий.
Здесь мы разработали метод использования свиных глаз, которые имеют много общего с человеческими глазами14, для получения первичных клеток RPE. Эти первичные клетки RPE свиней были использованы в нескольких моделях сетчатки15,16. Эти клетки не только экономически эффективны, но и требуют меньше времени для получения, чем ИПСК или донорские глаза. Кроме того, они проявляют естественные характеристики, такие как пигментация и микроворсинки. Несмотря на то, что существуют аналогичные протоколы для экстракции РПЭ свиней 17,18,19, этот простой и подробный метод дополнительно подтверждает ферментативную диссоциацию и использует материалы, обычно встречающиеся в большинстве лабораторий клеточных культур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Глаза, используемые в этой процедуре, получены посмертно из местной, проверенной Министерством сельского хозяйства США мясной лавки, и никакая работа не выполняется с использованием живых животных. После того, как животные были принесены в жертву, проходит примерно 2 часа, прежде чем глаза будут энуклеированы. Поскольку может начаться разрушение тканей, важно сохранять глаза прохладными во время транспортировки, чтобы предотвратить дальнейшее разрушение. При этой процедуре глаза сразу после энуклеации помещаются в холодильник. Затем мешок с глазами помещается в полипропиленовый стакан объемом 1000 мл и окружается льдом в 8-литровом охладителе. Важно не ставить глаза прямо на лед. После того, как глаза поступают в лабораторию, изоляция клеток РПЭ проводится в шкафу биобезопасности. Очень важно завершить этот процесс в течение 3-5 часов. Этот протокол был оптимизирован для обработки 10 глаз.
1. Подготовка исходных аликвот ДНКазы
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется выполнить этот шаг перед изоляцией.
- Приготовьте раствор хлористого кальция 5 мМ со стерильной деионизированной водой.
ВНИМАНИЕ: Порошок хлорида кальция может вызвать сильное раздражение или повреждение глаз. Носите соответствующие СИЗ. - Добавьте 5 мМ раствора хлорида кальция к порошку ДНКазы (см. Таблицу материалов), чтобы получить конечную концентрацию ДНКазы 3 мг/мл. Убедитесь, что раствор тщательно перемешан.
ВНИМАНИЕ: ДНКаза представляет опасность сенсибилизации в дыхательных путях. Не вдыхайте порошок/вещество. - Аликвотные небольшие объемы, например, 1 мл, в микроцентрифужные пробирки.
- Заморозьте аликвоты при -20 °C до использования.
2. Настройка зоны препарирования
- Перенесите в шкаф биобезопасности стерильные инструменты для диссекции и оборудование для культивирования клеток: хирургическую простыню, чашки Петри, ситечки для клеток, луночные планшеты, марлю, пинцет, ручку скальпеля, лезвие скальпеля и ножницы для радужной оболочки глаза (см. Таблицу материалов).
- С помощью пинцета разложите хирургическую простыню. Поместите одну 6-луночную пластину на хирургическую простыню и снимите крышку.
- Поместите аликвоту стерильного фосфатного солевого буфера (DPBS) Dulbecco на лед и поместите его в шкаф биобезопасности.
- Наполните одну лунку 6-луночной пластины наполовину (примерно 6 мл) 10% раствором повидон-йода.
- Заполните оставшиеся лунки охлажденным ДПБС.
- Снимите крышку с одной из чашек Петри и положите ее в перевернутом виде на хирургическую простыню. Отложите основание чашки Петри в качестве контейнера для отходов.
- Поместите аликвоту питательной среды для клеточных культур (модифицированная среда для орла (DMEM) Dulbecco, 10% фетальная бычья сыворотка (FBS), 1% антибиотики/антимикотики) и аликвоту 0,25% трипсина/ЭДТА на водяную баню с температурой 37 °C.
- Извлеките исходный раствор ДНКазы из морозильной камеры (см. остальную часть протокола для получения более подробной информации).
3. Удаление наружных тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Наружное удаление тканей может быть выполнено за пределами кабинета биобезопасности. Перед разрезом осмотрите глаз, чтобы убедиться, что склера не проколота, зрачок не затуманен, зрительный нерв присутствует. Отбросьте глаза, не соответствующие этим критериям.
- Удерживая одной рукой мышцу, прикрепленную к глазу, другой рукой аккуратно отрежьте скальпелем ткань, окружающую склеру. Будьте осторожны, чтобы не раздавить глаз или случайно не разрезать склеру. Если склера прорезана насквозь и обнажает черную внутреннюю часть, выбросьте глаз.
ВНИМАНИЕ: Перчатка, устойчивая к порезам, настоятельно рекомендуется использовать руку, удерживающую мышцу, для защиты от случайных порезов. - Обрежьте зрительный нерв изогнутыми ножницами по радужной оболочке до длины не более 3 мм. Если зрительный нерв слишком длинный, наглазник не будет правильно располагаться в сетчатом фильтре.
- Положите глаз на лед роговицей вниз.
- Повторяйте шаги 3.1-3.3 до тех пор, пока из каждого глаза не будут удалены наружные ткани.
4. Вскрытие глаз
- С помощью пинцета переместите глаз в шкаф биобезопасности и в лунку, содержащую 10% раствор повидон-йода, и поверните глазок, чтобы убедиться, что он полностью покрыт раствором йода. Чтобы инструменты оставались как можно более стерильными, эти пинцеты следует использовать только для прикосновения к внешней стороне глаза.
- Пока глаз находится в растворе йода, наложите стерильную марлю на неглубокую перевернутую крышку приготовленной ранее чашки Петри. В отдельную чашку Петри поместите ситечко для ячеек. Используйте ситечко для клеток только для поддержки наглазника, а не для разделения клеток.
- После того, как глаз находится в растворе йода в течение примерно 30 с, промойте глаз, окунув его в лунки, содержащие DPBS, примерно на 5 секунд каждая, двигаясь от лунки к лунке, чтобы постепенно разбавлять раствор йода, и переложите глаз на стерильную марлю.
- Сделайте небольшой надрез скальпелем ниже ora serrata или примерно на 1/3 вниз от края радужной оболочки.
- После разреза используйте ножницы для радужной оболочки глаза, чтобы сделать ровный разрез по окружности шара, параллельно роговице. При манипулировании глазом используйте пинцет только для прикосновения к внешней стороне глаза или марлю для поддержания стерильности.
- Используйте пинцет, чтобы захватить зрительный нерв и осторожно отодвинуть шар от марли. Стекловидное тело должно выпасть из земного шара. При необходимости осторожно встряхните глаз, чтобы помочь сместить стекловидное тело.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если стекловидное тело очень трудно удалить, попробуйте разрезать его ниже на глобусе. - Осторожно поместите наглазник в подготовленное ситечко для ячеек внутренней стороной вверх. Если разрез неровный, используйте пинцет, чтобы отрегулировать наглазник, чтобы разрез был как можно ровнее.
- Аккуратно добавьте охлажденный DPBS в наглазник так, чтобы уровень жидкости был чуть ниже самой нижней точки разреза. Этот DPBS будет удален после удаления нервной сетчатки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем добавляемого DPBS будет варьироваться в зависимости от размера глаза и расположения разреза. - Повторяйте шаги 4.1-4.8 до тех пор, пока не будут рассечены все глаза.
5. Удаление нервной сетчатки и диссоциация РПЭ
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий раздел проще выполнять поэтапно. В этой установке этот процесс выполняется для одной партии (обычно 3 стаканов для глаз) за раз. Для шагов 5.1-5.7 каждый шаг должен быть выполнен для всего пакета, прежде чем переходить к следующему шагу.
- Под фонариком найдите области, где нервная сетчатка (белая/розовая) начинает отделяться от RPE (черная). Затем тупым пинцетом аккуратно захватите приподнятую нервную сетчатку и отклейте ее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если нет областей, где нервная сетчатка отделяется, используйте пинцет, чтобы осторожно захватить ее в верхней части наглазника. При использовании этого метода, если поврежден РПЭ/сосудистая оболочка, эти клетки не будут диссоциированы во время сбора РПЭ. - Аккуратно соберите нервную сетчатку рядом со диском зрительного нерва.
- Отсасывайте нервную сетчатку с помощью пипетки Пастера, подключенной к вакуумной аспирационной системе. Рекомендуется перьевая аспирация, чтобы помочь в процессе удаления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечник пипетки можно поместить на конец пипетки Пастера для уменьшения всасывания. - Осторожно добавьте дополнительно охлажденный DPBS, чтобы заменить то, что было аспирировано.
- Удалите оставшуюся нервную сетчатку, сделав аспирацию еще раз. На этот раз удалите как можно больше DPBS, не беспокоя при этом открытый RPE.
- Аккуратно добавьте трипсин в наглазник. Поддерживайте уровень громкости ниже линии разреза и любых участков поврежденных СИЗД, чтобы уменьшить загрязнение.
ВНИМАНИЕ: Трипсин - это фермент, который вызывает раздражение кожи и глаз при контакте. Носите соответствующие СИЗ. - После того, как трипсин будет добавлен в каждый глаз, убедитесь, что крышка чашки Петри заменена. Далее переносят чашку Петри в увлажненный инкубатор при температуре 37 °С и 5%СО2 на 30 мин.
- Повторяйте шаги 5.1–5.7 для каждой партии до тех пор, пока не будут обработаны все наглазники.
6. Сбор СИЗОД
- Соберите клетки RPE из каждой партии глазков (2-3 глазка) и поместите в одну центрифужную пробирку объемом 15 мл, чтобы упростить процесс посева.
- Под фонариком осторожно протрите пипеткой объемом 1000 мкл, чтобы вытеснить клетки RPE. Если клетки РПЭ не отделяются, добавляют свежий трипсин и инкубируют еще 10-15 мин. Будьте осторожны, чтобы не поцарапать сетчатку.
- Соберите клетки RPE в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
- Промойте наглазник питательной средой, чтобы собрать оставшиеся клетки и нейтрализовать трипсин. Убедитесь, что в центрифужной пробирке объемом 15 мл содержится как минимум в два раза больше среды, чем трипсина.
- Повторяйте шаг 6.1 до тех пор, пока клетки RPE не будут собраны из всех наглазников.
- Центрифугируют клеточные суспензии при 250 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
7. Приготовление рабочего раствора ДНКазы
- Рассчитайте объем исходного раствора ДНКазы 3 мг/мл (приготовленного на этапе 1), необходимый для добавления в питательную среду для клеток для получения конечной концентрации 100 мкг/мл и конечного объема 3 мл на пробирку клеток (т. е. для трех центрифужных пробирок клеток требуется 9 мл раствора ДНКазы 100 мкг/мл).
- Смешайте соответствующие объемы исходного раствора ДНКазы и питательной среды для клеток. Использование ДНКазы в рабочем растворе помогает предотвратить слипание клеток и позволяет равномерно засеивать клетки.
8. Посев клеток РПЭ
- После центрифугирования на этапе 6.3 удалите надосадочную жидкость из каждой центрифужной пробирки объемом 15 мл, стараясь не повредить гранулы клеток.
- Ресуспендант каждой клеточной гранулы в 3 мл рабочего раствора ДНКазы.
- Центрифужные пробирки объемом 15 мл, содержащие ресуспендированные клетки, помещают в увлажненный инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2 на 15 минут.
- После инкубации центрифугируют клеточные суспензии при концентрации 150 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалите надосадочную жидкость, стараясь не нарушить клеточные гранулы.
- Ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в 3 мл свежей питательной среды для клеток.
- Для каждой центрифужной пробирки, содержащей 2-3 глазка ячеек РПЭ, засейте одну лунку из 6-луночной пластины (проход 0).
- Осторожно перенесите засеянную 6-луночную пластину в увлажненный инкубатор при температуре 37 °C и 5% CO2.
9. Первичная клеточная культура РПЭ свиней
- Дайте вновь засеянным клеткам РПЭ прикрепиться в течение 48-72 ч, прежде чем перемещать пластину. Во время первой смены среды можно выполнить промывку свежей питательной средой для клеточных культур, чтобы удалить излишки клеточного мусора.
- Заменяйте питатель для клеточных культур каждые 48 часов.
- Когда клетки достигнут слияния, переходят на питательную среду с концентрацией FBS 2% и выдерживают до эксперимента.
10. Валидация ячеек RPE
- Иммуноцитохимическое (ИКК) окрашивание
- Зафиксируйте клетки в 4% формальдегиде в DPBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Дважды вымойте DPBS.
- Пермеабилизацию клеток (при необходимости) с использованием 0,2% Triton-X 100 в DPBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Дважды вымойте DPBS.
- Применяют блокирующий раствор 3% (w/v) бычьего сывороточного альбумина (BSA) в DPBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Добавьте первичные антитела в разведении 1:100 (или рекомендуемую концентрацию производителя) (см. Таблицу материалов) и оставьте на 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 °C.
- Постирайте три раза с DPBS по 5 минут каждый.
- Добавьте вторичные антитела (при необходимости) в концентрации 2 мкг/мл (или рекомендуемая концентрация производителя) (см. Таблицу материалов) и оставьте на 1 ч при комнатной температуре.
- Промыть три раза DPBS в течение 5 минут каждый, если нанесены вторичные антитела.
- Добавьте зонд для ядерного окрашивания в концентрации производителя (см. Таблицу материалов) и оставьте на 25 минут при комнатной температуре.
- Вымойте три раза PBS по 5 минут каждый.
- Если вы находитесь на вкладыше для клеточной культуры, прикрепите его к предметному стеклу микроскопа с помощью покровного стекла, используя монтажную среду, как описано Rickabaugh and Weatherston et al.20. В противном случае ячейки изображения в DPBS.
- Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)
- Следуйте процедуре, описанной Harris et al.21.
- Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER)
- Следуйте протоколу производителя для измерения TEER (см. таблицу материалов) с 1 мл питательной среды в базальной камере15.
- Иммуноферментный анализ (ИФА)
- Проводят ИФА15 с использованием мультиплексного набора иммуноферментного анализа человека в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью этой процедуры первичные клетки RPE были успешно выделены из глаз свиньи. На рисунке 1А показаны клетки RPE через 3 дня после выделения с характерной пигментацией. Через 1 неделю роста клетки полностью слились и образовали здоровый монослой (рис. 1Б). Затем клетки переносили во вставки клеточных культур, где они сохраняли свою пигментацию и морфологию (рис. 1C), что еще раз подтверждает эффективность процедуры выделения. Культуры, которые не проявляли этих характеристик, а вместо этого демонстрировали вариационную морфологию и чрезмерную пигментацию (рис. 1D), подозревались в клеточном загрязнении и не использовались в экспериментах. Клетки RPE, выделенные в этой рукописи, экспрессируют RPE65, белок, высоко экспрессируемый в клетках RPE (рис. 2). Области, в которых экспрессия RPE65 кажется ниже, вероятно, связаны с пигментацией, блокирующей флуоресценцию, поскольку эти области соответствуют более сильно пигментированным клеткам (рис. 2A). Другим характерным белком, экспрессируемым изолированными клетками RPE, был VEGF. Через 10 дней экспрессия VEGF была больше на базальной стороне монослоя РПЭ с концентрацией 2612,5 ± 28,0 пг/мл по сравнению с апикальной стороной с концентрацией 2141,2 ± 53,5 пг/мл (рис. 3). Первичные клетки RPE свиней также имеют морфологию микроворсинок и булыжника (рис. 4). Кроме того, при выращивании на вставках клеточных культур показатели TEER увеличились со 166,1 ± 75,9 Ω∙см2 через 7 дней до 363,4 ± 9,0 Ω∙см2 через 14 дней (рис. 5), что указывает на последовательное, здоровое образование плотных соединений с течением времени22. Для дальнейшего изучения образования соединений клетки RPE были проанализированы на экспрессию ZO-1, которая была локализована на границах клеток, что подразумевает образование здоровых соединений и целостность монослоя (рис. 6).
Рисунок 1: Первичный РПЭ после посева на луночные планшеты и субкультивирования. Здоровые клетки РПЭ через 3 дня после выделения (А), полностью сливающийся монослой через 7 дней после выделения (В), РПЭ успешно пассировали на культуральную вставку (С) и участки потенциального клеточного загрязнения (стрелки) на культуре РПЭ (D). Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Иммуноцитохимические изображения, показывающие экспрессию RPE65 в клетках RPE свиней. Изображения светлопольных (A), RPE65 (B), ядер (C) и объединенных (D) клеток через 15 дней после посева. Обратите внимание, что зернистый фон на светлопольном изображении представляет собой пористую мембрану культуральной вставки. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Экспрессия VEGF в апикальной и базальной сторонах монослоя RPE. Концентрацию VEGF определяли методом ИФА, проводимым через 10 дней роста клеток на культуральных вставках. Столбцы погрешности представляют собой стандартное отклонение при n = 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Изображение первичных клеток RPE свиньи с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Клетки выращивали в течение 30 дней перед визуализацией. Масштабная линейка = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Показания TEER, выполненные на клетках RPE, культивируемых на вставках клеточных культур. Значения резистентности через 7, 10 и 14 дней роста. Столбцы погрешности представляют собой стандартное отклонение при n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Иммуноцитохимические изображения, показывающие экспрессию ZO-1 в клетках RPE свиней. Светлопольные (A) ZO-1 (B), ядра (C) и объединенные (D) изображения клеток через 6 дней после посева на стеклянных донных луночных планшетах. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе описывается, как изолировать клетки RPE от глаз свиньи. Пигментация и морфология булыжника наблюдаются в течение 7 дней после изоляции (рис. 1B). Кроме того, данные TEER указывают на плотное соединение22 и здоровый монослой (рис. 5). Эти результаты показывают, что клетки RPE, выделенные с помощью этого метода, похожи на человеческие RPE и могут быть полезны в моделях клеточных культур сетчатки.
Глаза, использованные в этой рукописи, получены посмертно из местной мясной лавки, но также могут быть получены из других источников, таких как академические учреждения, где сотрудники используют продукты из свинины. Важно начать процедуру как можно скорее после смерти животного и сохранить глаза прохладными перед процедурой. Во время изоляции важно не нарушать РПЭ до тех пор, пока он не разотрится после трипсинизации. Эта осторожность наиболее важна при пилинге нервной сетчатки, так как отсутствие осторожности может привести к захвату пинцетом мембраны Бруха1 и введению в раствор других типов клеток.
Несмотря на то, что эта процедура была оптимизирована для наших условий, в методологию могут быть внесены некоторые изменения. Например, если требуется определенная плотность посева, клетки могут быть подсчитаны после инкубации ДНКазы. Кроме того, если вакуумная аспирация не работает, нервную сетчатку можно удалить, аккуратно обрезав ее маленькими изогнутыми ножницами. При посеве для экспериментов можно использовать высокую плотность посева, например, 2,5 x 105 клеток/см2 , чтобы предотвратить избыточное деление клеток. Кроме того, повторный пассаж не рекомендуется, так как клетки могут начать терять свои нативные фенотипы. Несмотря на то, что в этом исследовании для экспериментов использовались клетки пассажа 1, потенциально могут быть использованы дополнительные пассажи, если фенотип и характеристики RPE будут сохранены. Наконец, концентрация 1% FBS может быть использована для субкультуры или экспериментов вместо 2%, если это необходимо.
У этого метода есть несколько недостатков. Во-первых, трудно воспроизвести или получить возраст, пол, породу и время смерти животных, что является распространенными проблемами при первичной изоляции клеток. Во-вторых, чрезмерная трипсинизация может быстро привести к образованию аномальных клеток, что также было отмечено Fietz et al. 17. Однако, в конечном счете, этот метод предлагает недорогой и эффективный способ получения первичных ячеек RPE. Эти клетки не требуют длительного времени дифференцировки, как ИПСК. Эти свиные RPE также имеют ключевые структуры, такие как микроворсинки и пигментация15,16, в отличие от своих недифференцированных собратьев. Таким образом, эти клетки представляют собой более репрезентативный тип клеток для исследований сетчатки. Наконец, этот метод может быть очень полезен для большего числа сельских районов или учреждений, которые не имеют доступа к человеческим донорским глазам, для создания моделей сетчатки, аналогичных человеческим моделям, для понимания зрения и заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никакой.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Фархада Фарджуда за помощь в культивировании и выделении клеток RPE свиней и Томаса Харриса за помощь в SEM. Авторы выражают признательность Центру микроскопии Университета штата Юта за поддержку СЭМ-анализа. На объекте установлен сканирующий электронный микроскоп, приобретенный в рамках гранта Национального научного фонда (CMMI-1337932). Финансирование этого исследования было предоставлено Национальными институтами здравоохранения в рамках гранта 1R15EY028732 (Vargis) и гранта BrightFocus Foundation M2019109 (Vargis). Дополнительное финансирование было предоставлено грантом на исследования и творческие возможности для студентов (Weatherston) от Управления исследований Университета штата Юта и начальным грантом (Vargis) от Исследовательского центра болезни Альцгеймера и деменции Университета штата Юта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified - calcium - magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch's membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Georgiadis, A., et al. The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice. PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Yang, S., Zhou, J., Li, D. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).
- Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).
- Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function. Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).
- Hellinen, L., et al. Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model. Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Samuel, W., et al. Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells. Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).
- Middleton, S.
- Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis. Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).
- Paterson, C., Cannon, J., Vargis, E. The impact of early RPE cell junction loss on VEGF, Ang-2, and TIMP secretion in vitro. , http://www.molvis.org/molvis/v29/87/ (2023).
- Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures. STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).
- Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).
- Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of bruch's membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).
- Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch's membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).
- Zou, X. L., et al. Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide. International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).
