Summary
Este protocolo descreve o procedimento para obtenção e cultivo de células epiteliais pigmentares primárias da retina (EPR) a partir de olhos suínos de origem local. Essas células servem como uma alternativa de alta qualidade às células-tronco e são adequadas para pesquisas in vitro da retina.
Abstract
O epitélio pigmentado da retina (EPR) é uma monocamada crucial na retina externa responsável pela sustentação dos fotorreceptores. A degeneração do EPR ocorre comumente em doenças marcadas pela perda progressiva da visão, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI). A pesquisa sobre DMRI geralmente se baseia em olhos de doadores humanos ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) para representar o EPR. No entanto, essas fontes de EPR requerem longos períodos de diferenciação e conhecimentos substanciais para o cultivo. Além disso, algumas instituições de pesquisa, particularmente aquelas em áreas rurais, não têm fácil acesso aos olhos dos doadores. Embora exista uma linhagem celular de EPR imortalizada comercialmente disponível (ARPE-19), ela carece de características essenciais de EPR in vivo e não é amplamente aceita em muitas publicações de pesquisa em oftalmologia. Há uma necessidade premente de obter células primárias representativas do EPR a partir de uma fonte mais prontamente disponível e econômica. Este protocolo elucida o isolamento e subcultivo de células primárias de EPR obtidas post-mortem de olhos suínos, que podem ser obtidas localmente de fornecedores comerciais ou acadêmicos. Este protocolo necessita de materiais comuns tipicamente encontrados em laboratórios de cultura de tecidos. O resultado é uma alternativa primária, diferenciada e custo-efetiva para iPSCs, olhos de doadores humanos e células ARPE-19.
Introduction
O epitélio pigmentado da retina (EPR) é uma monocamada localizada na retina externa entre a membrana de Bruch e os fotorreceptores1. As células do EPR formam tight junctions com proteínas como a zonula occludens-1 (ZO-1) e possuem um fenótipo distinto, caracterizado por pigmentação e morfologiahexagonal2,3. Essas células contribuem para a barreira hematorretiniana, apoiando a saúde dos fotorreceptores e mantendo a homeostase retiniana 4,5. Além disso, as células do EPR desempenham um papel crítico na visão, absorvendo luz e reciclando componentes essenciais para os fotorreceptores6. Por exemplo, a RPE65, uma proteína altamente expressa em células de EPR, converte ésteres de retinila trans-trans em retinol 11-cis 7,8. Dada a multiplicidade de funções desempenhadas pelas células do EPR, sua disfunção está implicada em várias doenças, incluindo degeneração macular relacionada à idade e retinopatia diabética 9,10. Para melhorar a compreensão das patologias retinianas e desenvolver novos tratamentos, modelos in vitro da retina são frequentemente empregados.
Para gerar modelos representativos de retinas saudáveis ou doentes, é imperativo usar um tipo de célula RPE mimética. A linhagem celular ARPE-19 comercialmente disponível não possui fenótipos nativos, como pigmentação, enquanto as iPSCs podem levar meses para se diferenciar11,12,13. Embora os olhos de doadores humanos possam ser ideais, eles muitas vezes não estão prontamente disponíveis para muitos laboratórios de pesquisa.
Aqui, desenvolvemos um método para utilizar olhos suínos, que compartilham muitas semelhanças com olhos humanos14, para a obtenção de células primárias do EPR. Essas células primárias do EPR suíno têm sido utilizadas em múltiplos modelos de retina15,16. Essas células não são apenas custo-efetivas, mas também requerem menos tempo para serem adquiridas do que as iPSCs ou os olhos de doadores. Além disso, apresentam características nativas, como pigmentação e microvilosidades. Embora existam protocolos semelhantes para extração de EPR suíno 17,18,19, essa técnica simples e detalhada valida ainda mais a dissociação enzimática e emprega materiais comumente encontrados na maioria dos laboratórios de cultura celular.
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Protocol
Os olhos usados neste procedimento são obtidos post-mortem de um açougue local, inspecionado pelo USDA, e nenhum trabalho é realizado usando animais vivos. Após o sacrifício dos animais, passam aproximadamente 2 h antes que os olhos sejam enucleados. Como a deterioração do tecido pode começar a ocorrer, é importante manter os olhos frescos durante o transporte para evitar mais decaimento. Neste procedimento, os olhos são imediatamente colocados em uma geladeira após a enucleação. Em seguida, a bolsa dos olhos é posicionada dentro de um copo de polipropileno de 1000 mL e cercada por gelo dentro de um resfriador de 8 L. É importante não colocar os olhos diretamente no gelo. Assim que os olhos chegam ao laboratório, o isolamento das células de EPR é realizado dentro de um gabinete de biossegurança. É crucial concluir este processo dentro de 3-5 h. Este protocolo foi otimizado para o processamento de 10 olhos.
1. Preparação das alíquotas de estoque da DNase
Observação : é recomendável que essa etapa seja executada antes do isolamento.
- Preparar uma solução de cloreto de cálcio 5 mM com água deionizada estéril.
CUIDADO: O cloreto de cálcio em pó pode causar irritação ou danos oculares graves. Use EPIs apropriados. - Adicionar 5 mM de solução de cloreto de cálcio ao pó de DNase (ver Tabela de Materiais) para obter uma concentração final de DNase de 3 mg/ml. Certifique-se de que a solução está bem misturada.
CUIDADO: DNase é um risco de sensibilização respiratória. Não inalar pó/substância. - Alíquota pequenos volumes, por exemplo 1 mL, em tubos de microcentrífuga.
- Congelar alíquotas a -20 °C até à utilização.
2. Configuração da área de dissecção
- Transfira os instrumentos de dissecção estéreis e o equipamento de cultura celular para o gabinete de biossegurança: cortina cirúrgica, placas de Petri, filtros de células, placas de poço, gaze, pinça, cabo de bisturi, lâmina de bisturi e tesoura de íris (ver Tabela de Materiais).
- Usando uma pinça, coloque o campo cirúrgico. Coloque uma placa de 6 poços sobre o pano cirúrgico e remova a tampa.
- Coloque uma alíquota de Fosfato Buffered Saline (DPBS) estéril de Dulbecco no gelo e no armário de biossegurança.
- Encher um poço de uma placa de 6 poços meio cheia (aproximadamente 6 mL) de solução de iodopovidona a 10%.
- Encha os poços restantes com DPBS refrigerados.
- Retire a tampa de uma das placas de Petri e coloque-a, invertida, sobre o campo cirúrgico. Separe a base da placa de Petri como recipiente de resíduos.
- Coloque uma alíquota de meio de cultura celular (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1% antibióticos/antimicóticos) e uma alíquota de 0,25% de tripsina/EDTA em banho-maria a 37 °C.
- Remova a solução-mãe DNase do congelador (consulte o resto do protocolo para obter mais detalhes).
3. Remoção de tecido exterior
NOTA: A remoção de tecido exterior pode ser realizada fora do gabinete de biossegurança. Inspecione o olho antes do corte para garantir que a esclera não foi perfurada, a pupila não está embaçada e o nervo óptico está presente. Descarte os olhos que não atendem a esses critérios.
- Ao segurar o músculo preso ao olho com uma mão, use a outra mão para cortar suavemente o tecido ao redor da esclera com um bisturi. Tenha cuidado para não esmagar o olho ou cortar acidentalmente a esclera. Se a esclera for cortada e expor o interior preto, descarte o olho.
CUIDADO: Uma luva resistente ao corte é altamente recomendada para a mão que segura o músculo para proteger contra cortes acidentais. - Corte o nervo óptico com uma tesoura de íris curva até um comprimento não superior a 3 mm. Se o nervo óptico for muito longo, o copo ocular não ficará adequadamente no filtro de células mais tarde.
- Coloque o olho no gelo com a córnea para baixo.
- Repita os passos 3.1-3.3 até que o tecido exterior seja removido de cada olho.
4. Dissecção ocular
- Use uma pinça para transferir um olho para o armário de biossegurança e para o poço contendo solução de iodopovidona a 10% e gire o olho para garantir que ele seja totalmente revestido na solução de iodo. Para manter as ferramentas o mais estéreis possível, essas pinças devem ser usadas apenas para tocar o exterior do olho.
- Enquanto o olho estiver sentado em solução de iodo, coloque uma gaze estéril sobre a pálpebra rasa e invertida da placa de Petri preparada anteriormente. Em uma placa de Petri separada, coloque um filtro de células. Use apenas o filtro de células para apoiar o copo dos olhos, não para a separação celular.
- Depois de permitir que o olho se sente em solução de iodo por aproximadamente 30 s, lave o olho mergulhando-o nos poços contendo DPBS por aproximadamente 5 s cada, movendo-se de poço em poço para diluir progressivamente a solução de iodo e transferir o olho para a gaze estéril.
- Faça uma pequena incisão usando um bisturi abaixo da ora serrata, ou aproximadamente 1/3 abaixo do globo a partir da borda da íris.
- Após a incisão, use tesoura de íris para cortar uniformemente ao longo da circunferência do globo, paralelo à córnea. Ao manobrar o olho, use apenas a pinça para tocar a parte externa do olho ou a gaze para manter a esterilidade.
- Use a pinça para agarrar o nervo óptico e levantar suavemente o globo para longe da gaze. O vítreo deve cair para fora do globo. Se necessário, agite suavemente o olho para ajudar a desalojar o vítreo.
NOTA: Se o vítreo for muito difícil de remover, tente cortar mais baixo no globo. - Coloque suavemente o copo dos olhos no filtro de células preparado, com o interior do copo dos olhos virado para cima. Se estiver irregular, use uma pinça para ajustar o copo ocular para que a incisão fique o mais nivelada possível.
- Adicione suavemente DPBS resfriado ao copo dos olhos para que o nível de líquido fique logo abaixo do ponto mais baixo da incisão. Esta DPBS será removida após a remoção da retina neural.
NOTA: O volume de DPBS adicionado irá variar dependendo do tamanho do olho e da localização da incisão. - Repita os passos 4.1-4.8 até que todos os olhos estejam dissecados.
5. Remoção da retina neural e dissociação do EPR
Observação : a seção a seguir é mais fácil de executar em estágios. Nesta configuração, este processo é realizado em um lote (geralmente 3 copos de olhos) de cada vez. Para as etapas 5.1-5.7, cada etapa deve ser executada em todo o lote antes de passar para a próxima etapa.
- Sob uma lanterna, encontre as áreas onde a retina neural (branca/rosa) está começando a se desprender do EPR (preto). Em seguida, use uma pinça romba para agarrar suavemente a retina neural levantada e descascá-la.
NOTA: Se não houver áreas onde a retina neural está se desprendendo, use a pinça para agarrá-la suavemente perto da parte superior do copo dos olhos. Usando este método, se houver dano ao EPR/coroide, essas células não serão dissociadas durante a coleta do EPR. - Colete suavemente a retina neural perto do disco óptico.
- Aspirar a retina neural usando uma pipeta de Pasteur conectada a um sistema de aspiração a vácuo. Recomenda-se penar a aspiração para ajudar no processo de remoção.
NOTA: Uma ponta de pipeta pode ser colocada na extremidade de uma pipeta Pasteur para reduzir a sucção. - Adicione cuidadosamente DPBS resfriados adicionais para substituir o que foi aspirado.
- Remova a retina neural remanescente aspirando novamente. Desta vez, remova o máximo de DPBS possível, sem perturbar o EPR exposto.
- Adicione suavemente tripsina ao copo dos olhos. Mantenha o nível de volume abaixo da linha de incisão e quaisquer seções de EPR danificadas para reduzir a contaminação.
CUIDADO: A tripsina é uma enzima que causará irritação na pele e nos olhos ao contato. Use EPIs apropriados. - Depois que a tripsina for adicionada a cada olho, certifique-se de que a tampa da placa de Petri seja substituída. Em seguida, transferir a placa de Petri para uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% CO2 por 30 min.
- Repita as etapas 5.1-5.7 para cada lote até que todos os óculos tenham sido processados.
6. Coleta de EPR
- Coletar as células de EPR de cada lote de olhos (2-3 olhos) e colocar em um único tubo de centrífuga de 15 mL para tornar o processo de semeadura simples.
- Sob uma lanterna, triture suavemente usando uma pipeta de 1000 μL para desalojar as células de EPR. Se as células do EPR não estiverem se destacando, adicione tripsina fresca e incube por mais 10-15 min. Tenha cuidado para não raspar a retina.
- Coletar as células de EPR em um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Lave o copo ocular com meios de cultura celular para coletar as células restantes e neutralizar a tripsina. Certifique-se de que há pelo menos o dobro do volume de meio para tripsina no tubo de centrífuga de 15 mL.
- Repetir o passo 6.1 até que as células do EPR tenham sido recolhidas de todos os óculos.
- Centrifugar as suspensões celulares a 250 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente.
7. Preparação da solução de trabalho DNase
- Calcular o volume de 3 mg/mL de solução-mãe de DNase (preparada na etapa 1) necessária para adicionar ao meio de cultura celular para uma concentração final de 100 μg/mL e volume final de 3 mL por tubo de células (ou seja, para três tubos de centrífuga de células, são necessários 9 mL de solução de DNase a 100 μg/mL).
- Combinar os volumes apropriados de solução-mãe de DNase e meios de cultura celular. O uso de DNase na solução de trabalho ajuda a prevenir a aglomeração celular e permite que as células sejam semeadas uniformemente.
8. Semeadura de células RPE
- Após a centrifugação na etapa 6.3, remova os sobrenadantes de cada tubo de centrífuga de 15 mL, com cuidado para não interromper o pellet celular.
- Ressuspender cada pellet de célula em 3 mL de solução de trabalho DNase.
- Colocar os tubos de centrífuga de 15 mL contendo as células ressuspensas em uma estufa umidificada a 37 °C e 5% CO2 por 15 min.
- Após a incubação, centrifugar as suspensões celulares a 150 x g por 5 min à temperatura ambiente.
- Remova os sobrenadantes, com cuidado para não atrapalhar os pellets celulares.
- Ressuspender cada pastilha celular em 3 mL de meio de cultura de células frescas.
- Para cada tubo de centrífuga contendo 2-3 olhos de células de EPR, semeie um poço de uma placa de 6 poços (passagem 0).
- Cuidadosamente, transfira a placa de 6 poços semeada para uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% CO2.
9. Cultivo primário de células de EPR suíno
- Deixe as células de EPR recém-semeadas se fixarem por 48-72 h antes de mover a placa. Durante a primeira troca de meio, uma lavagem com meios de cultura de células frescos pode ser realizada para ajudar a remover o excesso de detritos celulares.
- Substitua o meio de cultura celular a cada 48 h.
- Quando as células atingem a confluência, faça a transição para um meio de cultura celular com uma concentração de FBS de 2% e mantenha até a experimentação.
10. Validação da célula RPE
- Coloração imunocitoquímica (ICC)
- Fixar as células em formaldeído a 4% em DPBS por 10 min à temperatura ambiente.
- Lave duas vezes com DPBS.
- Permeabilizar as células (se necessário) usando Triton-X 100 a 0,2% em DPBS por 10 min à temperatura ambiente.
- Lave duas vezes com DPBS.
- Aplicar solução de bloqueio de albumina de soro bovino (BSA) a 3% (p/v) em DPBS durante 1 h à temperatura ambiente.
- Adicionar o anticorpo primário à diluição de 1:100 (ou concentração recomendada do fabricante) (ver Tabela de Materiais) e deixar descansar durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
- Lave três vezes com DPBS por 5 min cada.
- Adicione o anticorpo secundário (se necessário) a 2 μg/mL (ou concentração recomendada do fabricante) (ver Tabela de Materiais) e deixe descansar por 1 h à temperatura ambiente.
- Lavar três vezes com DPBS durante 5 minutos cada se for aplicado anticorpo secundário.
- Adicione a sonda de coloração nuclear na concentração do fabricante (ver Tabela de Materiais) e deixe descansar por 25 minutos à temperatura ambiente.
- Lave três vezes com PBS por 5 min cada.
- Se em uma cultura de células inserir, montar na lâmina do microscópio com uma lamínula usando meio de montagem como descrito por Rickabaugh e Weatherston et al.20. Caso contrário, células de imagem no DPBS.
- Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
- Siga o procedimento descrito por Harris et al.21.
- Resistência Elétrica Trans Epitelial (TEER)
- Seguir o protocolo do fabricante para medição TEER (ver Tabela de Materiais) com 1 mL de meio de cultura na câmara basal15.
- Ensaio imunoenzimático (ELISA)
- Realizar o ELISA15 usando um kit de ensaio imunoenzimático humano multiplex seguindo o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
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Representative Results
Usando este procedimento, células primárias do EPR foram isoladas com sucesso de olhos suínos. A Figura 1A mostra as células do EPR 3 dias após o isolamento com pigmentação característica. Após 1 semana de crescimento, as células estavam totalmente confluentes e formavam uma monocamada saudável (Figura 1B). As células foram então transferidas para pastilhas de cultura celular, onde mantiveram sua pigmentação e morfologia (Figura 1C), apoiando ainda mais a eficácia do procedimento de isolamento. Culturas que não exibiram essas características e apresentaram morfologia variante e pigmentação excessiva (Figura 1D) foram suspeitas de contaminação celular e não utilizadas nos experimentos. As células de EPR isoladas neste manuscrito expressam RPE65, uma proteína altamente expressa em células de EPR (Figura 2). As áreas onde a expressão de RPE65 parece menor são provavelmente devidas à pigmentação que bloqueia a fluorescência, uma vez que essas áreas correspondem a células mais fortemente pigmentadas (Figura 2A). Outra proteína característica expressa pelas células de EPR isoladas foi o VEGF. Após 10 dias, o VEGF foi expresso mais no lado basal da monocamada de EPR com uma concentração de 2612,5 ± 28,0 pg/mL em comparação com o lado apical com uma concentração de 2141,2 ± 53,5 pg/mL (Figura 3). As células primárias do EPR suíno também apresentam morfologia de microvilosidades e paralelepípedos (Figura 4). Além disso, quando cultivadas em pastilhas de cultura celular, as leituras de TEER aumentaram de 166,1 ± 75,9 Ω∙cm2 aos 7 dias para 363,4 ± 9,0 Ω∙cm2 após 14 dias (Figura 5), indicando formação consistente e saudável de tight junction ao longo do tempo22. Para investigar melhor a formação de junções, as células de EPR foram analisadas quanto à expressão de ZO-1, que estava localizada nos limites celulares, implicando na formação de junções saudáveis e integridade da monocamada (Figura 6).
Figura 1: PSE primário após ser semeado em placas de poço e subcultivado. Células PSE saudáveis 3 dias pós-isolamento (A), monocamada totalmente confluente 7 dias pós-isolamento (B), EPR passado com sucesso para uma pastilha de cultura (C) e áreas de potencial contaminação celular (setas) em uma cultura de EPR (D). Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens imunocitoquímicas mostrando a expressão do RPE65 em células de EPR suíno. Imagens de campo brilhante (A), RPE65 (B), núcleos (C) e mescladas (D) de células 15 dias após a semeadura. Note, o fundo granulado na imagem de campo brilhante é a membrana de inserção de cultura porosa. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Expressão do VEGF nas faces apical e basal da monocamada de EPR. A concentração de VEGF foi determinada por ELISA realizado após 10 dias de crescimento celular em pastilhas de cultura. As barras de erro representam o desvio padrão com n = 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de células primárias de EPR suíno. As células foram cultivadas por 30 dias antes da obtenção de imagens. Barra de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Leituras TEER realizadas em células de EPR cultivadas em insertos de cultura celular. Valores de resistência após 7, 10 e 14 dias de crescimento. As barras de erro representam o desvio padrão com n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imagens imunocitoquímicas mostrando a expressão de ZO-1 em células do EPR suíno. Imagens de campo brilhante (A) ZO-1 (B), núcleos (C) e mescladas (D) de células 6 dias após a semeadura em placas de poço de fundo de vidro. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve como isolar células de EPR de olhos suínos. A pigmentação e a morfologia dos paralelepípedos são observadas em até 7 dias após o isolamento (Figura 1B). Além disso, os dados TEER indicam a formação de tight junction22 e uma monocamada saudável (Figura 5). Esses resultados mostram que as células do EPR isoladas com este método são semelhantes ao EPR humano e podem ser benéficas em modelos de cultura de células da retina.
Os olhos utilizados neste manuscrito são obtidos post-mortem de um açougue local, mas também podem ser obtidos de outras fontes, como ambientes acadêmicos com colaboradores que utilizam produtos suínos. É importante iniciar o procedimento o mais rápido possível após a morte do animal e manter os olhos frescos antes do procedimento. Durante o isolamento, é essencial não interromper a PSE até trituração após a tripsinização. Esse cuidado é mais crítico ao descascar a retina neural, pois a falta de cautela pode levar a agarrar a membrana de Bruch1 com a pinça e introduzir outros tipos de células na solução.
Embora esse procedimento tenha sido otimizado para nossas condições, algumas mudanças podem ser feitas na metodologia. Por exemplo, se densidades específicas de semeadura são desejadas, as células podem ser contadas após a incubação da DNase. Além disso, se a aspiração a vácuo não estiver funcionando, a retina neural pode ser removida aparando cuidadosamente com uma tesoura pequena e curva. Ao semear para experimentos, uma alta densidade de semeadura como 2,5 x 105 células/cm2 pode ser usada para evitar o excesso de divisão celular. Além disso, a passagem repetida não é recomendada, pois as células podem começar a perder seus fenótipos nativos. Embora este estudo tenha usado células de passagem 1 para experimentos, passagens adicionais poderiam potencialmente ser usadas se o fenótipo e as características do EPR fossem mantidos. Por fim, uma concentração de 1% de SFB pode ser usada para subcultivo ou experimentação em vez de 2%, se desejado.
Existem algumas desvantagens neste método. Primeiro, é difícil replicar ou obter idade, sexo, raça e tempo de morte do animal, que são problemas comuns no isolamento celular primário. Em segundo lugar, a tripsinização excessiva pode resultar rapidamente em células anormais, o que também foi observado por Fietz ecols.17. No entanto, em última análise, este método oferece uma maneira barata e eficiente de obter células primárias do EPR. Essas células não requerem longos tempos de diferenciação como as iPSCs. Esses EPR suínos também possuem estruturas chave, como microvilosidades e pigmentação15,16, diferentemente de suas contrapartes não diferenciadas. Como tal, estas células oferecem um tipo celular mais representativo para estudos da retina. Por fim, esse método pode ser muito benéfico para áreas mais rurais ou instituições que não têm acesso a olhos de doadores humanos para produzir modelos de retina análogos aos modelos humanos para entender a visão e a doença.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Farhad Farjood pela ajuda com a cultura e isolamento de células de EPR suíno e a Thomas Harris pela ajuda com MEV. Os autores agradecem o apoio do Microscopy Core Facility da Utah State University para a análise de MEV. A instalação mantém um microscópio eletrônico de varredura adquirido através de uma National Science Foundation Major Research Instrumentation Grant (CMMI-1337932). O financiamento para este estudo foi fornecido por um National Institutes of Health através do Grant 1R15EY028732 (Vargis) e um BrightFocus Foundation Grant M2019109 (Vargis). O financiamento adicional foi fornecido por uma Bolsa de Pesquisa de Graduação e Oportunidades Criativas (Weatherston) do Escritório de Pesquisa da Universidade Estadual de Utah e uma bolsa de sementes (Vargis) do Centro de Pesquisa de Doença de Alzheimer e Demência da Universidade Estadual de Utah.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified - calcium - magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
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