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Biology

इन विट्रो मॉडलिंग के लिए प्राथमिक पोर्सिन रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं का अलगाव

Published: May 3, 2024 doi: 10.3791/66079
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Engineering, Utah State University

Summary

यह प्रोटोकॉल स्थानीय रूप से सोर्स किए गए पोर्सिन आंखों से प्राथमिक रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) कोशिकाओं को प्राप्त करने और संवर्धन करने की प्रक्रिया की रूपरेखा तैयार करता है। ये कोशिकाएं स्टेम कोशिकाओं के लिए एक उच्च गुणवत्ता वाले विकल्प के रूप में काम करती हैं और इन विट्रो रेटिना अनुसंधान के लिए उपयुक्त हैं।

Abstract

रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) बाहरी रेटिना में एक महत्वपूर्ण मोनोलेयर है जो फोटोरिसेप्टर का समर्थन करने के लिए जिम्मेदार है। आरपीई अपघटन आमतौर पर प्रगतिशील दृष्टि हानि द्वारा चिह्नित बीमारियों में होता है, जैसे कि उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी)। एएमडी पर शोध अक्सर आरपीई का प्रतिनिधित्व करने के लिए मानव दाता आंखों या प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) पर निर्भर करता है। हालांकि, इन आरपीई स्रोतों को संवर्धन के लिए विस्तारित भेदभाव अवधि और पर्याप्त विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, कुछ शोध संस्थान, विशेष रूप से ग्रामीण क्षेत्रों में, दाता आंखों तक आसान पहुंच की कमी है। जबकि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अमर आरपीई सेल लाइन (एआरपीई -19) मौजूद है, इसमें विवो आरपीई सुविधाओं में आवश्यक कमी है और कई नेत्र विज्ञान अनुसंधान प्रकाशनों में व्यापक रूप से स्वीकार नहीं किया जाता है। अधिक आसानी से उपलब्ध और लागत प्रभावी स्रोत से प्रतिनिधि प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं को प्राप्त करने की एक दबाव की आवश्यकता है। यह प्रोटोकॉल पोर्सिन आंखों से पोस्ट-मॉर्टम प्राप्त प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं के अलगाव और उपसंस्कृति को स्पष्ट करता है, जिसे वाणिज्यिक या शैक्षणिक आपूर्तिकर्ताओं से स्थानीय रूप से प्राप्त किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल आम तौर पर ऊतक संस्कृति प्रयोगशालाओं में पाया आम सामग्री की आवश्यकता. परिणाम IPSC के लिए एक प्राथमिक, विभेदित, और लागत प्रभावी विकल्प है, मानव दाता आंखों, और ARPE-19 कोशिकाओं.

Introduction

रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) ब्रुच की झिल्ली और फोटोरिसेप्टर1 के बीच बाहरी रेटिना में स्थित एक मोनोलेयर है। आरपीई कोशिकाएं ज़ोनुला ऑक्लुडेंस -1 (ज़ो -1) जैसे प्रोटीन के साथ तंग जंक्शन बनाती हैं और रंजकता और हेक्सागोनल आकृति विज्ञान 2,3 द्वारा विशेषता एक विशिष्ट फेनोटाइप रखती हैं। ये कोशिकाएं रक्त-रेटिना बाधा में योगदान करती हैं, जिससे फोटोरिसेप्टर स्वास्थ्य का समर्थन होता है और रेटिना होमियोस्टेसिस 4,5 को बनाए रखता है। इसके अतिरिक्त, आरपीई कोशिकाएं प्रकाश को अवशोषित करके और फोटोरिसेप्टर 6 के लिए आवश्यक घटकों को रीसाइक्लिंग करके दृष्टि में महत्वपूर्ण भूमिका निभातीहैं। उदाहरण के लिए, RPE65, RPE कोशिकाओं में अत्यधिक व्यक्त एक प्रोटीन, सभी ट्रांस रेटिनिल एस्टर को 11-सीआईएस रेटिनॉल 7,8 में परिवर्तित करता है। आरपीई कोशिकाओं द्वारा किए गए कार्यों की भीड़ को देखते हुए, उनकी शिथिलता विभिन्न रोगों में फंसी है, जिसमें उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन और मधुमेह रेटिनोपैथी 9,10 शामिल हैं। रेटिना विकृति की समझ को बढ़ाने और नए उपचार विकसित करने के लिए, रेटिना के इन विट्रो मॉडल में अक्सर नियोजित होते हैं।

स्वस्थ या रोगग्रस्त रेटिना के प्रतिनिधि मॉडल उत्पन्न करने के लिए, एक नकली आरपीई सेल प्रकार का उपयोग करना अनिवार्य है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एआरपीई -19 सेल लाइन में देशी फेनोटाइप का अभाव है, जैसे कि रंजकता, जबकि आईपीएससीको 11,12,13 में अंतर करने में महीनों लग सकते हैं। यद्यपि मानव दाता आंखें आदर्श हो सकती हैं, वे अक्सर कई शोध प्रयोगशालाओं के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं होती हैं।

यहां, हमने प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए पोर्सिन आंखों का उपयोग करने के लिए एक विधि तैयार की है, जो मानव आंखों14 के साथ कई समानताएं साझा करती है। इन प्राथमिक पोर्सिन आरपीई कोशिकाओं का उपयोग कई रेटिनामॉडल15,16में किया गया है। इतना ही नहीं इन कोशिकाओं लागत प्रभावी हैं, लेकिन वे भी IPSC या दाता आंखों की तुलना में प्राप्त करने के लिए कम समय की आवश्यकता होती है. इसके अतिरिक्त, वे देशी विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं, जैसे रंजकता और माइक्रोविली। जबकि पोर्सिन आरपीई निष्कर्षण के लिए समान प्रोटोकॉल 17,18,19मौजूद हैं, यह सीधी और विस्तृत तकनीक आगे एंजाइमी पृथक्करण को मान्य करती है और आमतौर पर अधिकांश सेल संस्कृति प्रयोगशालाओं में पाई जाने वाली सामग्रियों को नियोजित करती है।

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Protocol

इस प्रक्रिया में उपयोग की जाने वाली आंखों को स्थानीय, यूएसडीए-निरीक्षण कसाई की दुकान से पोस्टमार्टम प्राप्त किया जाता है, और जीवित जानवरों का उपयोग करके कोई काम नहीं किया जाता है। जानवरों की बलि दिए जाने के बाद, आंखों के सामने लगभग 2 घंटे गुजरते हैं। चूंकि ऊतक क्षय होना शुरू हो सकता है, इसलिए आगे क्षय को रोकने के लिए परिवहन के दौरान आंखों को ठंडा रखना महत्वपूर्ण है। इस प्रक्रिया में, आंखों को तुरंत संलयन के बाद रेफ्रिजरेटर में रखा जाता है। इसके बाद, आंखों का बैग 1000 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन बीकर के अंदर स्थित है और 8 एल कूलर के भीतर बर्फ से घिरा हुआ है। यह महत्वपूर्ण है कि आंखों को सीधे बर्फ पर न रखें। एक बार जब आंखें प्रयोगशाला में पहुंच जाती हैं, तो आरपीई कोशिकाओं का अलगाव जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर किया जाता है। यह 3-5 घंटे के भीतर इस प्रक्रिया को पूरा करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल 10 आंखों के प्रसंस्करण के लिए अनुकूलित किया गया है.

1. DNase स्टॉक एलिकोट तैयार करना

नोट: यह अनुशंसा की जाती है कि यह चरण अलगाव से पहले किया जाता है।

  1. बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ एक 5 मिमी कैल्शियम क्लोराइड समाधान तैयार करें।
    सावधानी: कैल्शियम क्लोराइड पाउडर गंभीर आंखों की जलन या क्षति पैदा कर सकता है। उपयुक्त पीपीई पहनें।
  2. 3 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम डीएनएसई एकाग्रता प्राप्त करने के लिए डीएनएसई पाउडर ( सामग्री की तालिकादेखें) में 5 एमएम कैल्शियम क्लोराइड समाधान जोड़ें। सुनिश्चित करें कि घोल अच्छी तरह मिलाया गया है।
    चेतावनी: DNase एक श्वसन संवेदीकरण खतरा है। पाउडर/पदार्थ को अंदर न लें।
  3. विभाज्य छोटे मात्रा, उदाहरण के लिए 1 एमएल, माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में।
  4. उपयोग करने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य फ्रीज.

2. विच्छेदन क्षेत्र की स्थापना

  1. जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ विच्छेदन उपकरणों और सेल संस्कृति उपकरण स्थानांतरण: शल्य चिकित्सा पपड़ा, पेट्री व्यंजन, सेल छलनी, अच्छी तरह से प्लेटें, धुंध, चिमटी, स्केलपेल संभाल, स्केलपेल ब्लेड, और परितारिका कैंची ( सामग्री की तालिकादेखें).
  2. चिमटी का उपयोग करके, सर्जिकल ड्रेप बिछाएं। सर्जिकल ड्रेप के ऊपर एक 6-वेल प्लेट रखें और ढक्कन हटा दें।
  3. बर्फ पर और जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ Dulbecco के फॉस्फेट Buffered खारा (DPBS) का एक विभाज्य रखें.
  4. 10% पोविडोन-आयोडीन समाधान के 6-अच्छी तरह से प्लेट आधे रास्ते (लगभग 6 एमएल) के एक कुएं को भरें।
  5. शेष कुओं को ठंडा डीपीबी से भरें।
  6. पेट्री डिश में से एक से ढक्कन निकालें और इसे शल्य चिकित्सा ड्रेप के ऊपर, उल्टा, जगह है. पेट्री डिश बेस को एक बेकार कंटेनर के रूप में अलग रखें।
  7. सेल कल्चर मीडिया (डुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% एंटीबायोटिक्स / एंटीमायोटिक्स) और 0.25% ट्रिप्सिन / ईडीटीए के एक विभाज्य को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
  8. फ्रीजर से DNase स्टॉक समाधान निकालें (अधिक जानकारी के लिए प्रोटोकॉल के बाकी देखें)।

3. बाहरी ऊतक हटाने

नोट: बाहरी ऊतक हटाने जैव सुरक्षा कैबिनेट के बाहर किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए काटने से पहले आंख का निरीक्षण करें कि श्वेतपटल को पंचर नहीं किया गया है, पुतली धूमिल नहीं है, और ऑप्टिक तंत्रिका मौजूद है। इन मानदंडों को पूरा नहीं करने वाली आंखों को त्याग दें।

  1. एक हाथ से आंख से जुड़ी मांसपेशियों को पकड़ते हुए, दूसरे हाथ का उपयोग स्केलपेल के साथ श्वेतपटल के आसपास के ऊतक को धीरे से काटने के लिए करें। सावधान रहें कि आंख को कुचलने या गलती से श्वेतपटल के माध्यम से कटौती न करें। यदि श्वेतपटल के माध्यम से काट दिया जाता है और काले इंटीरियर को उजागर करता है, तो आंख को त्याग दें।
    चेतावनी: आकस्मिक कटौती से बचाने के लिए मांसपेशियों को पकड़ने वाले हाथ के लिए एक कट प्रतिरोधी दस्ताने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।
  2. 3 मिमी से अधिक नहीं की लंबाई के लिए घुमावदार परितारिका कैंची के साथ ऑप्टिक तंत्रिका ट्रिम. यदि ऑप्टिक तंत्रिका बहुत लंबी है, तो आंख का कप बाद में सेल स्ट्रेनर में ठीक से नहीं बैठेगा।
  3. कॉर्निया के साथ बर्फ पर आंख रखें।
  4. 3.1-3.3 कदम दोहराएँ जब तक बाहरी ऊतक प्रत्येक आंख से हटा दिया जाता है.

4. नेत्र विच्छेदन

  1. चिमटी का उपयोग जैव सुरक्षा कैबिनेट में और अच्छी तरह से 10% povidone-आयोडीन समाधान युक्त में एक आंख हस्तांतरण और यह आयोडीन समाधान में पूरी तरह से लेपित है कि यह सुनिश्चित करने के लिए आंख बारी बारी से. उपकरण को यथासंभव बाँझ रखने के लिए, इन चिमटी का उपयोग केवल आंख के बाहरी हिस्से को छूने के लिए किया जाना चाहिए।
  2. जबकि आंख आयोडीन समाधान में बैठी है, पहले से तैयार पेट्री डिश के उथले, उल्टे ढक्कन पर एक बाँझ धुंध रखें। एक अलग पेट्री डिश में, एक सेल छलनी जगह है. केवल सेल छलनी का उपयोग आंख कप का समर्थन करने के लिए करें, सेल जुदाई के लिए नहीं।
  3. आंख को लगभग 30 एस के लिए आयोडीन समाधान में बैठने की अनुमति देने के बाद, लगभग 5 एस प्रत्येक के लिए डीपीबीएस युक्त कुओं में डुबकी लगाकर आंख को धो लें, आयोडीन समाधान को उत्तरोत्तर पतला करने के लिए अच्छी तरह से आगे बढ़ रहे हैं, और बाँझ धुंध पर आंख को स्थानांतरित कर सकते हैं।
  4. ओरा सेराटा के नीचे एक स्केलपेल का उपयोग करके एक छोटा चीरा बनाएं, या आईरिस किनारे से ग्लोब के नीचे लगभग 1/3 करें।
  5. चीरा के बाद, कॉर्निया के समानांतर, ग्लोब की परिधि के साथ समान रूप से कटौती करने के लिए आईरिस कैंची का उपयोग करें। आंख पैंतरेबाज़ी करते समय, बाँझपन बनाए रखने के लिए आंख या धुंध के बाहर स्पर्श करने के लिए केवल चिमटी का उपयोग करें।
  6. चिमटी का प्रयोग ऑप्टिक तंत्रिका हड़पने और धीरे धुंध से दूर ग्लोब लिफ्ट करने के लिए. कांच का गिलास दुनिया से बाहर गिरना चाहिए। यदि आवश्यक हो, तो कांच को हटाने में मदद करने के लिए धीरे से आंख हिलाएं।
    नोट: यदि कांच को हटाना बहुत मुश्किल है, तो ग्लोब पर कम काटने का प्रयास करें।
  7. धीरे से आई कप को तैयार सेल स्ट्रेनर में रखें, जिसमें आई कप का इंटीरियर ऊपर की ओर हो। यदि असमान है, तो चीरा को यथासंभव स्तर पर लाने के लिए आई कप को समायोजित करने के लिए चिमटी का उपयोग करें।
  8. धीरे से ठंडा डीपीबीएस को आई कप में जोड़ें ताकि द्रव का स्तर चीरे के निम्नतम बिंदु से ठीक नीचे हो। तंत्रिका रेटिना हटाने के बाद इस डीपीबीएस को हटा दिया जाएगा।
    नोट: जोड़े गए डीपीबीएस की मात्रा आंखों के आकार और चीरा स्थान के आधार पर अलग-अलग होगी।
  9. दोहराएँ कदम 4.1-4.8 जब तक सभी आँखें विच्छेदित कर रहे हैं.

5. तंत्रिका रेटिना हटाने और आरपीई पृथक्करण

नोट: निम्नलिखित अनुभाग चरणों में प्रदर्शन करना आसान है। इस सेट अप में, यह प्रक्रिया एक समय में एक बैच (आमतौर पर 3 आई कप) पर की जाती है। चरण 5.1-5.7 के लिए, प्रत्येक चरण अगले चरण पर जाने से पहले पूरे बैच पर किया जाना चाहिए।

  1. एक टॉर्च के तहत, किसी भी क्षेत्र को ढूंढें जहां तंत्रिका रेटिना (सफेद / गुलाबी) आरपीई (काला) से अलग होना शुरू हो रहा है। फिर, धीरे उठा तंत्रिका रेटिना हड़पने और यह दूर छील करने के लिए कुंद चिमटी का उपयोग करें.
    नोट: यदि कोई क्षेत्र नहीं है जहां तंत्रिका रेटिना अलग हो रहा है, तो चिमटी का उपयोग धीरे से आंख कप के शीर्ष के पास इसे पकड़ने के लिए करें। इस पद्धति का उपयोग करते हुए, यदि आरपीई/कोरॉइड को नुकसान होता है, तो आरपीई संग्रह के दौरान उन कोशिकाओं को अलग नहीं किया जाएगा।
  2. धीरे ऑप्टिक डिस्क के पास तंत्रिका रेटिना इकट्ठा.
  3. एक वैक्यूम आकांक्षा प्रणाली से जुड़े एक पाश्चर विंदुक का उपयोग कर तंत्रिका रेटिना बाहर महाप्राण. हटाने की प्रक्रिया में मदद करने की आकांक्षा को पंख लगाने की सिफारिश की जाती है।
    नोट: चूषण को कम करने के लिए एक पाश्चर विंदुक के अंत में एक विंदुक टिप रखा जा सकता है।
  4. जो एस्पिरेटेड था उसे बदलने के लिए सावधानीपूर्वक अतिरिक्त ठंडा डीपीबीएस जोड़ें।
  5. एक बार फिर से एस्पिरेट करके शेष तंत्रिका रेटिना को हटा दें। इस बार, उजागर आरपीई को परेशान न करते हुए जितना संभव हो उतना डीपीबीएस हटा दें।
  6. धीरे से आंख कप में ट्रिप्सिन जोड़ें। संदूषण को कम करने के लिए चीरा लाइन और क्षतिग्रस्त आरपीई के किसी भी खंड के नीचे मात्रा स्तर रखें।
    चेतावनी: ट्रिप्सिन एक एंजाइम है जो संपर्क पर त्वचा और आंखों में जलन पैदा करेगा। उपयुक्त पीपीई पहनें।
  7. ट्रिप्सिन प्रत्येक आंख में जोड़ा जाता है, सुनिश्चित करें कि पेट्री डिश ढक्कन को बदल दिया गया है। अगला, पेट्री डिश को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें और 30 मिनट के लिए 5% सीओ2 ।
  8. प्रत्येक बैच के लिए 5.1-5.7 चरणों को दोहराएं जब तक कि सभी आंखों के कप संसाधित नहीं हो जाते।

6. आरपीई संग्रह

  1. आंखों के प्रत्येक बैच (2-3 आंखों) से आरपीई कोशिकाओं को इकट्ठा करें और बोने की प्रक्रिया को सीधा बनाने के लिए एक एकल 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें।
    1. एक टॉर्च के तहत, धीरे आरपीई कोशिकाओं को नापसंद करने के लिए एक 1000 माइक्रोन विंदुक का उपयोग triturate. यदि आरपीई कोशिकाएं अलग नहीं हो रही हैं, तो ताजा ट्रिप्सिन जोड़ें और अतिरिक्त 10-15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। सावधान रहें कि रेटिना को खुरचें नहीं।
    2. एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में आरपीई कोशिकाओं को लीजिए।
    3. किसी भी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने और ट्रिप्सिन को बेअसर करने के लिए सेल संस्कृति मीडिया के साथ आंख कप धो लें। सुनिश्चित करें कि 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में ट्रिप्सिन के लिए मीडिया की कम से कम दोगुनी मात्रा है।
  2. चरण 6.1 दोहराएं जब तक कि आरपीई कोशिकाओं को सभी आंखों के कप से एकत्र नहीं किया जाता है।
  3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।

7. DNase कार्य समाधान तैयार करना

  1. 100 माइक्रोग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता और कोशिकाओं की ट्यूब प्रति 3 एमएल की अंतिम मात्रा के लिए सेल कल्चर मीडिया में जोड़ने के लिए आवश्यक 3 मिलीग्राम/एमएल डीएनएसई स्टॉक समाधान (चरण 1 में तैयार) की मात्रा की गणना करें (यानी, कोशिकाओं के तीन अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए, 100 माइक्रोग्राम/एमएल डीएनए समाधान के 9 एमएल की आवश्यकता है)।
  2. DNase स्टॉक समाधान और सेल संस्कृति मीडिया के उचित संस्करणों को मिलाएं। कार्यशील समाधान में DNase का उपयोग सेल क्लंपिंग को रोकने में मदद करता है और कोशिकाओं को समान रूप से वरीयता प्राप्त करने की अनुमति देता है।

8. आरपीई सेल सीडिंग

  1. चरण 6.3 में सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, प्रत्येक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब से सुपरनेटेंट को हटा दें, सेल गोली को बाधित न करने के लिए सावधान।
  2. डीएनएसई काम कर रहे समाधान के 3 एमएल में प्रत्येक सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  3. 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में पुनर्गठित कोशिकाओं और 15 मिन के लिए 5% सीओ2 पर रखें।
  4. इनक्यूबेशन के बाद, कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए 150 x ग्राम पर सेल सस्पेंशन को सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. सतह पर तैरनेवाला निकालें, सेल छर्रों को बाधित करने के लिए सावधान नहीं.
  6. ताजा सेल संस्कृति मीडिया के 3 एमएल में प्रत्येक सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  7. आरपीई कोशिकाओं के लायक 2-3 आंखों वाले प्रत्येक अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए, 6-अच्छी तरह से प्लेट (मार्ग 0) के एक अच्छी तरह से बीज।
  8. ध्यान से, वरीयता प्राप्त 6 अच्छी तरह से थाली 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में हस्तांतरण.

9. प्राथमिक पोर्सिन आरपीई सेल संस्कृति

  1. प्लेट को स्थानांतरित करने से पहले नव वरीयता प्राप्त आरपीई कोशिकाओं को 48-72 घंटे के लिए संलग्न करने की अनुमति दें। पहले मीडिया परिवर्तन के दौरान, अतिरिक्त सेल मलबे को हटाने में मदद करने के लिए ताजा सेल संस्कृति मीडिया के साथ एक धोने का प्रदर्शन किया जा सकता है।
  2. सेल संस्कृति मीडिया हर 48 घंटे बदलें.
  3. जब कोशिकाएं संगम तक पहुंचती हैं, तो 2% की एफबीएस एकाग्रता के साथ सेल कल्चर मीडिया में संक्रमण करें और प्रयोग तक बनाए रखें।

10. आरपीई सेल सत्यापन

  1. इम्यूनोसाइटोकेमिकल (आईसीसी) धुंधला हो जाना
    1. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए डीपीबीएस में 4% फॉर्मलाडेहाइड में कोशिकाओं को ठीक करें।
    2. डीपीबीएस के साथ दो बार धो लें।
    3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए डीपीबीएस में 0.2% ट्राइटन-एक्स 100 का उपयोग करके कोशिकाओं (यदि आवश्यक हो) को पारगम्य करें।
    4. डीपीबीएस के साथ दो बार धो लें।
    5. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए डीपीबीएस में 3% (डब्ल्यू / वी) गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के अवरुद्ध समाधान लागू करें।
    6. 1:100 कमजोर पड़ने (या अनुशंसित निर्माता एकाग्रता) पर प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) और कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 1 घंटे के लिए बैठते हैं।
    7. प्रत्येक 5 मिनट के लिए DPBS के साथ तीन बार धो लें.
    8. एमएल (या अनुशंसित निर्माता एकाग्रता) पर माध्यमिक एंटीबॉडी (यदि आवश्यक हो) जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए बैठते हैं।
    9. माध्यमिक एंटीबॉडी लागू होने पर प्रत्येक 5 मिनट के लिए डीपीबीएस के साथ तीन बार धो लें।
    10. निर्माता की एकाग्रता पर परमाणु धुंधला जांच जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) और कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए बैठते हैं।
    11. प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ तीन बार धो लें.
    12. यदि एक सेल संस्कृति डालने पर, बढ़ते माध्यम का उपयोग कर एक कवरस्लिप के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए माउंट के रूप में Rickabaugh और Weatherston एट अल.20 द्वारा उल्लिखित. अन्यथा, DPBS में छवि कक्ष।
  2. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM)
    1. हैरिस एट अल.21 द्वारा उल्लिखित प्रक्रिया का पालन करें।
  3. ट्रांस उपकला विद्युत प्रतिरोध (TEER)
    1. बेसल कक्ष15 में संस्कृति माध्यम के 1 एमएल के साथ टीईईआर माप (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें।
  4. एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा)
    1. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए मल्टीप्लेक्स मानव एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख किट का उपयोग करके एलिसा15 करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।

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Representative Results

इस प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं को पोर्सिन आंखों से सफलतापूर्वक अलग किया गया था। चित्रा 1 ए आरपीई कोशिकाओं को विशेषता रंजकता के साथ अलगाव के 3 दिन बाद दिखाता है। विकास के 1 सप्ताह के बाद, कोशिकाएं पूरी तरह से संगम कर रही थीं और एक स्वस्थ मोनोलेयर(चित्रा 1बी)का गठन किया। कोशिकाओं को तब सेल कल्चर आवेषण में स्थानांतरित किया गया जहां उन्होंने अपने रंजकता और आकृति विज्ञान (चित्रा 1 सी) को बनाए रखा, आगे अलगाव प्रक्रिया की प्रभावकारिता का समर्थन किया। संस्कृतियों है कि इन विशेषताओं का प्रदर्शन नहीं किया और इसके बजाय संस्करण आकृति विज्ञान और अत्यधिक रंजकता (चित्रा 1 डी) दिखाया सेलुलर संदूषण का संदेह था और प्रयोगों में इस्तेमाल नहीं किया. इस पांडुलिपि में पृथक आरपीई कोशिकाएं आरपीई 65 व्यक्त करती हैं, एक प्रोटीन जो आरपीई कोशिकाओं (चित्रा 2) में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है। जिन क्षेत्रों में आरपीई 65 अभिव्यक्ति कम दिखाई देती है, वे प्रतिदीप्ति को अवरुद्ध करने वाले रंजकता के कारण होने की संभावना है, क्योंकि वे क्षेत्र अधिक भारी रंजित कोशिकाओं(चित्रा 2ए)के अनुरूप हैं। पृथक आरपीई कोशिकाओं द्वारा व्यक्त एक और विशेषता प्रोटीन वीईजीएफ था। 10 दिनों के बाद, वीईजीएफ को आरपीई मोनोलेयर के बेसल पक्ष पर 2141.2 ± 53.5 पीजी/एमएल(चित्रा 3)की एकाग्रता के साथ एपिकल पक्ष की तुलना में 2612.5 ± 28.0 पीजी/एमएल की एकाग्रता के साथ अधिक व्यक्त किया गया था। प्राथमिक पोर्सिन आरपीई कोशिकाओं में माइक्रोविली और कोबलस्टोन आकृति विज्ञान(चित्रा 4)भी होता है। इसके अतिरिक्त, जब सेल कल्चर आवेषण पर उगाया जाता है, तो टीईईआर रीडिंग 166.1 ±से बढ़कर 75.9 Ω∙सेमी2 7 दिनों में बढ़कर 363.4 ± 9.0 Ω∙सेमी2 14 दिनों के बाद हो गई(चित्रा 5), समय22 के साथ सुसंगत, स्वस्थ तंग जंक्शन गठन का संकेत देती है। जंक्शन गठन की और जांच करने के लिए, आरपीई कोशिकाओं का विश्लेषण ज़ो-1 अभिव्यक्ति के लिए किया गया था, जिसे सेल सीमाओं के लिए स्थानीयकृत किया गया था, जिसका अर्थ है स्वस्थ जंक्शन गठन और मोनोलेयर अखंडता(चित्रा 6)।

Figure 1
चित्रा 1: अच्छी तरह से प्लेटों और उपसंस्कृति पर वरीयता प्राप्त होने के बाद प्राथमिक आरपीई। स्वस्थ आरपीई कोशिकाओं 3 दिनों के बाद अलगाव (ए), पूरी तरह से संगम मोनोलेयर 7 दिनों के बाद अलगाव (बी), आरपीई सफलतापूर्वक एक संस्कृति डालने (सी), और एक आरपीई संस्कृति (डी) पर संभावित सेलुलर संदूषण (तीर) के क्षेत्रों पर पारित हो गया। स्केल बार = 100 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पोर्सिन आरपीई कोशिकाओं में आरपीई 65 अभिव्यक्ति दिखा इम्यूनोसाइटोकेमिकल छवियां। ब्राइटफील्ड (ए), आरपीई 65 (बी), नाभिक (सी), और विलय (डी) कोशिकाओं की छवियों 15 दिनों के बाद बोने के बाद। ध्यान दें, ब्राइटफील्ड छवि में दानेदार पृष्ठभूमि झरझरा संस्कृति डालने वाली झिल्ली है। स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: आरपीई मोनोलेयर के एपिकल और बेसल पक्षों में वीईजीएफ अभिव्यक्ति। वीईजीएफ एकाग्रता संस्कृति आवेषण पर सेल विकास के 10 दिनों के बाद किए गए एलिसा द्वारा निर्धारित की गई थी। त्रुटि पट्टियाँ n = 2 के साथ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्राथमिक पोर्सिन आरपीई कोशिकाओं की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) छवि। इमेजिंग से पहले 30 दिनों के लिए कोशिकाओं को उगाया गया था। स्केल बार = 5 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: सेल संस्कृति आवेषण पर सुसंस्कृत आरपीई कोशिकाओं पर प्रदर्शन किए गए टीईईआर रीडिंग। 7, 10 और 14 दिनों की वृद्धि के बाद प्रतिरोध मूल्य। त्रुटि पट्टियाँ n = 3 के साथ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: पोर्सिन आरपीई कोशिकाओं में ज़ो -1 अभिव्यक्ति दिखा इम्यूनोसाइटोकेमिकल छवियां। ब्राइटफील्ड (ए) ज़ो -1 (बी), नाभिक (सी), और विलय (डी) कांच तल अच्छी तरह से प्लेटों पर बोने के 6 दिन बाद कोशिकाओं की छवियों. स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल बताता है कि पोर्सिन आंखों से आरपीई कोशिकाओं को कैसे अलग किया जाए। रंजकता और cobblestone आकृति विज्ञान अलगाव (चित्रा 1 बी) के 7 दिनों के भीतर देखा जाता है. इसके अलावा, टीईईआर डेटा तंग जंक्शन गठन22 और एक स्वस्थ मोनोलेयर(चित्रा 5)का संकेत देता है। इन परिणामों से पता चलता है कि इस विधि के साथ पृथक आरपीई कोशिकाएं मानव आरपीई के समान हैं और रेटिना सेल कल्चर मॉडल में फायदेमंद हो सकती हैं।

इस पांडुलिपि में उपयोग की जाने वाली आंखें एक स्थानीय कसाई की दुकान से पोस्टमार्टम प्राप्त की जाती हैं, लेकिन अन्य स्रोतों से भी प्राप्त की जा सकती हैं, जैसे कि पोर्सिन उत्पादों का उपयोग करने वाले सहयोगियों के साथ शैक्षणिक सेटिंग्स। जानवरों की मृत्यु के बाद जितनी जल्दी हो सके प्रक्रिया शुरू करना और प्रक्रिया से पहले आंखों को ठंडा रखना महत्वपूर्ण है। अलगाव के दौरान, ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद ट्रिट्यूरेटिंग तक आरपीई को बाधित नहीं करना आवश्यक है। तंत्रिका रेटिना को छीलते समय यह देखभाल सबसे महत्वपूर्ण है, क्योंकि सावधानी की कमी से चिमटी के साथ ब्रुच की झिल्ली1 को हथियाने और समाधान में अन्य सेल प्रकारों को पेश करने का कारण बन सकता है।

हालांकि इस प्रक्रिया को हमारी स्थितियों के लिए अनुकूलित किया गया है, कार्यप्रणाली में कुछ बदलाव किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, यदि विशिष्ट सीडिंग घनत्व वांछित हैं, तो कोशिकाओं को डीनेस इनक्यूबेशन के बाद गिना जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यदि वैक्यूम आकांक्षा काम नहीं कर रही है, तो तंत्रिका रेटिना को छोटे, घुमावदार कैंची के साथ सावधानीपूर्वक ट्रिमिंग करके हटाया जा सकता है। प्रयोगों के लिए बोने पर, अतिरिक्त सेलुलर विभाजन को रोकने के लिए 2.5 x 105 कोशिकाओं/सेमी2 जैसे उच्च बोने वाले घनत्व का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, बार-बार गुजरने की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि कोशिकाएं अपने मूल फेनोटाइप को खोना शुरू कर सकती हैं। हालांकि इस अध्ययन ने प्रयोगों के लिए मार्ग 1 कोशिकाओं का उपयोग किया है, अतिरिक्त मार्ग संभावित रूप से उपयोग किए जा सकते हैं यदि आरपीई फेनोटाइप और विशेषताओं को बनाए रखा जाता है। अंत में, 1% एफबीएस की एकाग्रता का उपयोग 2% के बजाय उपसंस्कृति या प्रयोग के लिए किया जा सकता है, यदि वांछित हो।

इस पद्धति में कुछ कमियां हैं। सबसे पहले, पशु आयु, लिंग, नस्ल और मृत्यु के समय को दोहराना या प्राप्त करना मुश्किल है, जो प्राथमिक सेल अलगाव में आम समस्याएं हैं। दूसरा, अधिक trypsinization जल्दी से असामान्य कोशिकाओं में परिणाम कर सकते हैं, जो भी Fietz एट अल17 द्वारा नोट किया गया है. हालांकि, अंततः, यह विधि प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक सस्ती और कुशल तरीका प्रदान करती है। इन कोशिकाओं को आईपीएससी की तरह लंबे भेदभाव समय की आवश्यकता नहीं होती है। इन पोर्सिन आरपीई में सहज रूप से प्रमुख संरचनाएं होती हैं, जैसे माइक्रोविली और रंजकता 15,16, उनके गैर-विभेदित समकक्षों के विपरीत। जैसे, ये कोशिकाएं रेटिना अध्ययन के लिए अधिक प्रतिनिधि सेल प्रकार प्रदान करती हैं। अंत में, यह विधि अधिक ग्रामीण क्षेत्रों या संस्थानों के लिए बहुत फायदेमंद हो सकती है, जिनके पास दृष्टि और बीमारी को समझने के लिए मानव मॉडल के अनुरूप रेटिना मॉडल का उत्पादन करने के लिए मानव दाता आंखों तक पहुंच नहीं है।

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Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

लेखक पोर्सिन आरपीई सेल संस्कृति और अलगाव के साथ मदद के लिए फरहाद फरजूद और एसईएम के साथ मदद के लिए थॉमस हैरिस को धन्यवाद देना चाहते हैं। लेखक एसईएम विश्लेषण के लिए यूटा स्टेट यूनिवर्सिटी में माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा से समर्थन स्वीकार करते हैं। यह सुविधा एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन मेजर रिसर्च इंस्ट्रूमेंटेशन ग्रांट (सीएमएमआई -1337932) के माध्यम से प्राप्त एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप को बनाए रखती है। इस अध्ययन के लिए वित्त पोषण अनुदान 1R15EY028732 (वर्गिस) और एक ब्राइटफोकस फाउंडेशन अनुदान M2019109 (वर्गिस) के माध्यम से एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा प्रदान किया गया था। अतिरिक्त वित्त पोषण यूटा स्टेट यूनिवर्सिटी के अनुसंधान कार्यालय से एक स्नातक अनुसंधान और रचनात्मक अवसर अनुदान (वेदरस्टन) और यूटा स्टेट यूनिवर्सिटी के अल्जाइमर रोग और मनोभ्रंश अनुसंधान केंद्र से एक बीज अनुदान (वर्गिस) द्वारा प्रदान किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass Cellvis P06-14-1-N
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco 15240062
Biosafety Cabinet
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% Alfa Aesar L13191.30
Cell Strainer Fisher Scientific  22-363-548 one per eye
Centrifuge
Centrifuge Tubes, 15 mL Fisher Scientific  05-539-12
Cooler, 8 L Igloo 32529
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts Fisher Scientific  07-200-154 Culture inserts
Cut Resistant Glove Dowellife 712971375857
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution Fisher Scientific  SH3026401 for ICC dilutions only 
Deionized Water
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate Corning 10-013-CV
DNase I from Bovine Pancreas Sigma Aldrich DN25
DPBS/Modified - calcium - magnesium Cytiva SH3002B.02 stored at 4 °C
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex)  Quansys Biosciences, Logan, UT
ENDOHM 6 TEER device World Precision Instruments
Fetal Bovine Serum (FBS) Avantor 232B20
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder Fisher Scientific  BP9706100
Flashlight
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem Fisher Scientific  LC146501
Gauze Sponges Fisher Scientific  22-415-504 One per eye
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen Thermo Scientific A32728 RPE65 secondary antibody
Ice  Crushed prefered
Inverted Phase Contrast Microscope
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) Fisher Scientific  R37605
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" Cole-Palmer EW-10818-05
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide Fisher Scientific  50-822-379
LSM-710 Confocal Microscope Zeiss
Petri Dish, 100 mm x 20 mm  Corning 430167 one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste 
Povidone-Iondine Solution, 10% Equate 49035-050-34
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen Thermo Scientific MA116578 RPE65 primary antibody
Scalpel Blades Size 10 Fisher Scientific  22-079-683
Scalpel Handles Style 3 Fisher Scientific  50-118-4164
Surgical Drape, 18 x 26" Fisher Scientific  50-209-1792
Tissue Culture Incubator 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity
Tissue Culture Plates, 6 Wells VWR 10062-892 One for eye wash and one for seeding 
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL Fisher Scientific  14-955-111F
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate Corning 25053Cl
Tweezers Style 20A Fisher Scientific  17-467-231
Tweezers Style 2A Fisher Scientific  50-238-47 for removing neural retina
Tweezers Style 5-SA-PI Fisher Scientific  17-467-168
Vacuum Aspiration System
Water Bath, 37 °C
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen Fisher Scientific  33-911-1 ZO-1 conjugated primary antibody

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References

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जीवविज्ञान अंक 207
<em>इन विट्रो</em> मॉडलिंग के लिए प्राथमिक पोर्सिन रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं का अलगाव
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Paterson, C. A., Weatherston, D., Teeples, T., Vargis, E. Isolation of Primary Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells for In Vitro Modeling. J. Vis. Exp. (207), e66079, doi:10.3791/66079 (2024).

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