Summary
Dit protocol schetst de procedure voor het verkrijgen en kweken van primaire retinale pigmentepitheelcellen (RPE) uit lokaal geproduceerde varkensogen. Deze cellen dienen als hoogwaardig alternatief voor stamcellen en zijn geschikt voor in vitro netvliesonderzoek.
Abstract
Het retinale pigmentepitheel (RPE) is een cruciale monolaag in het buitenste netvlies die verantwoordelijk is voor de ondersteuning van fotoreceptoren. RPE-degeneratie komt vaak voor bij ziekten die worden gekenmerkt door progressief verlies van het gezichtsvermogen, zoals leeftijdsgebonden maculadegeneratie (AMD). Onderzoek naar AMD is vaak gebaseerd op menselijke donorogen of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) om de RPE weer te geven. Deze RPE-bronnen vereisen echter langere differentiatieperioden en substantiële expertise voor de teelt. Bovendien hebben sommige onderzoeksinstellingen, met name die in landelijke gebieden, geen gemakkelijke toegang tot donorogen. Hoewel er een in de handel verkrijgbare onsterfelijke RPE-cellijn (ARPE-19) bestaat, mist deze essentiële in vivo RPE-kenmerken en wordt deze niet algemeen aanvaard in veel oogheelkundige onderzoekspublicaties. Er is een dringende behoefte om representatieve primaire RPE-cellen te verkrijgen uit een gemakkelijker beschikbare en kosteneffectieve bron. Dit protocol verduidelijkt de isolatie en subcultuur van primaire RPE-cellen die post-mortem zijn verkregen uit varkensogen, die lokaal kunnen worden ingekocht bij commerciële of academische leveranciers. Dit protocol vereist gemeenschappelijke materialen die doorgaans worden aangetroffen in weefselkweeklaboratoria. Het resultaat is een primair, gedifferentieerd en kosteneffectief alternatief voor iPSC's, menselijke donorogen en ARPE-19-cellen.
Introduction
Het retinale pigmentepitheel (RPE) is een monolaag die zich in het buitenste netvlies bevindt tussen het membraan van Bruch en de fotoreceptoren. RPE-cellen vormen tight junctions met eiwitten zoals zonula occludens-1 (ZO-1) en bezitten een onderscheidend fenotype dat wordt gekenmerkt door pigmentatie en hexagonale morfologie 2,3. Deze cellen dragen bij aan de bloed-retinale barrière, waardoor de gezondheid van de fotoreceptor wordt ondersteund en de homeostase van het netvlies wordt gehandhaafd 4,5. Bovendien spelen RPE-cellen een cruciale rol bij het gezichtsvermogen door licht te absorberen en essentiële componenten voor de fotoreceptoren terecyclen6. RPE65, een eiwit dat sterk tot expressie komt in RPE-cellen, zet bijvoorbeeld all-trans retinylesters om in 11-cis retinol 7,8. Gezien de veelheid aan functies die door RPE-cellen worden uitgevoerd, is hun disfunctie betrokken bij verschillende ziekten, waaronder leeftijdsgebonden maculaire degeneratie en diabetische retinopathie 9,10. Om het begrip van retinale pathologieën te vergroten en nieuwe behandelingen te ontwikkelen, worden vaak in vitro modellen van het netvlies gebruikt.
Om representatieve modellen van gezonde of zieke netvliezen te genereren, is het absoluut noodzakelijk om een mimetisch RPE-celtype te gebruiken. De in de handel verkrijgbare ARPE-19-cellijn mist inheemse fenotypes, zoals pigmentatie, terwijl het maanden kan duren voordat iPSC's 11,12,13 onderscheiden. Hoewel menselijke donorogen ideaal kunnen zijn, zijn ze vaak niet direct beschikbaar voor veel onderzoekslaboratoria.
Hier hebben we een methode bedacht om varkensogen, die veel overeenkomsten vertonen met menselijke ogen14, te gebruiken voor het verkrijgen van primaire RPE-cellen. Deze primaire RPE-cellen van varkens zijn gebruikt in meerdere retinale modellen15,16. Deze cellen zijn niet alleen kosteneffectief, maar ze hebben ook minder tijd nodig om te verwerven dan iPSC's of donorogen. Bovendien vertonen ze inheemse kenmerken, zoals pigmentatie en microvilli. Hoewel er vergelijkbare protocollen voor RPE-extractie bij varkens bestaan 17,18,19, valideert deze eenvoudige en gedetailleerde techniek de enzymatische dissociatie verder en maakt gebruik van materialen die gewoonlijk in de meeste celkweeklaboratoria worden aangetroffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De ogen die bij deze procedure worden gebruikt, worden post-mortem verkregen van een lokale, door USDA geïnspecteerde slagerij en er wordt niet gewerkt met levende dieren. Nadat de dieren zijn geofferd, duurt het ongeveer 2 uur voordat de ogen zijn ontdaan. Omdat weefselverval kan optreden, is het belangrijk om de ogen tijdens het transport koel te houden om verder verval te voorkomen. Bij deze procedure worden de ogen na enucleatie onmiddellijk in een koelkast geplaatst. Vervolgens wordt de oogzak in een bekerglas van 1000 ml polypropyleen geplaatst en omgeven door ijs in een koeler van 8 liter. Het is belangrijk om de ogen niet direct op het ijs te plaatsen. Zodra de ogen in het laboratorium aankomen, wordt de isolatie van RPE-cellen uitgevoerd in een bioveiligheidskast. Het is van cruciaal belang om dit proces binnen 3-5 uur te voltooien. Dit protocol is geoptimaliseerd voor het verwerken van 10 ogen.
1. Opstellen van de aliquots van de DNase-voorraad
NOTITIE: Het wordt aanbevolen om deze stap uit te voeren vóór de isolatie.
- Bereid een calciumchloride-oplossing van 5 mM met steriel gedeïoniseerd water.
LET OP: Calciumchloridepoeder kan ernstige oogirritatie of -schade veroorzaken. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. - Voeg 5 mM calciumchloride-oplossing toe aan DNase-poeder (zie Materiaaltabel) om een uiteindelijke DNase-concentratie van 3 mg/ml te krijgen. Zorg ervoor dat de oplossing goed gemengd is.
LET OP: DNase is een gevaar voor overgevoeligheid van de luchtwegen. Adem geen poeder/stof in. - Aliquot kleine volumes, bijvoorbeeld 1 ml, in microcentrifugebuisjes.
- Vries aliquots in bij -20 °C tot gebruik.
2. Inrichting van de dissectieruimte
- Breng de steriele dissectie-instrumenten en celkweekapparatuur over in de bioveiligheidskast: chirurgisch laken, petrischaaltjes, celzeven, putplaten, gaas, pincet, scalpelhandvat, scalpelmesje en irisschaar (zie Materiaaltabel).
- Leg met een pincet het operatielaken neer. Plaats een bord met 6 putjes bovenop het operatielaken en verwijder het deksel.
- Plaats een aliquot van steriele Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) op ijs en in de bioveiligheidskast.
- Vul een putje van een bord met 6 putjes voor de helft (ongeveer 6 ml) met 10% povidon-jodiumoplossing.
- Vul de overige kuiltjes met gekoelde DPBS.
- Verwijder het deksel van een van de petrischaaltjes en plaats deze, omgekeerd, bovenop het operatielaken. Zet de bodem van de petrischaal opzij als afvalcontainer.
- Breng een aliquot celkweekmedia (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% foetaal runderserum (FBS), 1% antibiotica/antimycotica) en een aliquot van 0,25% trypsine/EDTA in een waterbad van 37 °C.
- Haal de DNase-bouillonoplossing uit de vriezer (zie de rest van het protocol voor meer details).
3. Verwijdering van uitwendig weefsel
NOTITIE: Uitwendig weefsel verwijderen kan buiten de bioveiligheidskast worden uitgevoerd. Inspecteer het oog voordat u snijdt om er zeker van te zijn dat de sclera niet is doorboord, de pupil niet mistig is en de oogzenuw aanwezig is. Gooi ogen weg die niet aan deze criteria voldoen.
- Terwijl u met één hand de spier vasthoudt die aan het oog vastzit, gebruikt u de andere hand om het weefsel rond de sclera voorzichtig weg te snijden met een scalpel. Pas op dat u het oog niet verplettert of per ongeluk door de sclera snijdt. Als de sclera is doorgesneden en de zwarte binnenkant blootlegt, gooi dan het oog weg.
LET OP: Een snijbestendige handschoen wordt ten zeerste aanbevolen voor de hand die de spier vasthoudt om te beschermen tegen onbedoelde snijwonden. - Knip de oogzenuw met een gebogen irisschaar af tot een lengte van niet meer dan 3 mm. Als de oogzenuw te lang is, zal de oogschelp later niet goed in de celzeef zitten.
- Plaats het oog op ijs met het hoornvlies naar beneden.
- Herhaal stap 3.1-3.3 totdat het uitwendige weefsel uit elk oog is verwijderd.
4. Oogdissectie
- Gebruik een pincet om een oog over te brengen in de bioveiligheidskast en in het putje met 10% povidon-jodiumoplossing en draai het oog om ervoor te zorgen dat het volledig bedekt is met de jodiumoplossing. Om het gereedschap zo steriel mogelijk te houden, mag dit pincet alleen worden gebruikt voor het aanraken van de buitenkant van het oog.
- Terwijl het oog in jodiumoplossing zit, plaatst u een steriel gaasje op het ondiepe, omgekeerde deksel van de eerder bereide petrischaal. Plaats in een aparte petrischaal een celzeef. Gebruik de celzeef alleen om de oogschelp te ondersteunen, niet voor celscheiding.
- Nadat u het oog ongeveer 30 s in jodiumoplossing hebt laten zitten, wast u het oog door het gedurende ongeveer 5 seconden in de putjes met DPBS te dompelen, van put naar put te gaan om de jodiumoplossing geleidelijk te verdunnen en het oog over te brengen op het steriele gaas.
- Maak een kleine incisie met een scalpel onder de ora serrata, of ongeveer 1/3 van de bol vanaf de irisrand.
- Gebruik na de incisie een irisschaar om gelijkmatig langs de omtrek van de bol te knippen, evenwijdig aan het hoornvlies. Gebruik bij het manoeuvreren van het oog alleen het pincet om de buitenkant van het oog of het gaas aan te raken om de steriliteit te behouden.
- Gebruik het pincet om de oogzenuw vast te pakken en til de wereldbol voorzichtig weg van het gaasje. Het glasvocht moet uit de bol vallen. Schud indien nodig voorzichtig met het oog om het glasvocht los te maken.
NOTITIE: Als het glasvocht erg moeilijk te verwijderen is, probeer dan lager op de bol te snijden. - Plaats de oogschelp voorzichtig in de voorbereide celzeef, met de binnenkant van de oogschelp naar boven gericht. Als het ongelijk is, gebruik dan een pincet om de oogschelp aan te passen om de incisie zo waterpas mogelijk te krijgen.
- Voeg voorzichtig afgekoelde DPBS toe aan de oogschelp zodat het vloeistofniveau net onder het laagste punt van de incisie komt. Deze DPBS wordt verwijderd na verwijdering van het neurale netvlies.
OPMERKING: Het volume van de toegevoegde DPBS is afhankelijk van de grootte van het oog en de locatie van de incisie. - Herhaal stap 4.1-4.8 totdat alle ogen zijn ontleed.
5. Neurale netvliesverwijdering en RPE-dissociatie
OPMERKING: Het volgende gedeelte is gemakkelijker in fasen uit te voeren. In deze opstelling wordt dit proces uitgevoerd op één batch (meestal 3 oogschelpen) per keer. Voor de stappen 5.1-5.7 moet elke stap op de hele batch worden uitgevoerd voordat naar de volgende stap wordt gegaan.
- Zoek onder een zaklamp alle gebieden waar het neurale netvlies (wit/roze) begint los te komen van de RPE (zwart). Gebruik vervolgens een stomp pincet om het opgetilde neurale netvlies voorzichtig vast te pakken en weg te trekken.
NOTITIE: Als er geen gebieden zijn waar het neurale netvlies loslaat, gebruik dan het pincet om het voorzichtig vast te pakken in de buurt van de bovenkant van de oogschelp. Met behulp van deze methode, als er schade wordt toegebracht aan de RPE/choroïde, zullen die cellen niet worden gedissocieerd tijdens het verzamelen van RPE. - Verzamel voorzichtig het neurale netvlies in de buurt van de optische schijf.
- Zuig het neurale netvlies op met behulp van een pasteurpipet die is bevestigd aan een vacuümaspiratiesysteem. Het wordt aanbevolen om de aspiratie te veren om te helpen bij het verwijderingsproces.
OPMERKING: Een pipetpunt kan op het uiteinde van een pasteurpipet worden geplaatst om de zuigkracht te verminderen. - Voeg voorzichtig extra gekoelde DPBS toe om te vervangen wat werd opgezogen.
- Verwijder het resterende neurale netvlies door opnieuw op te zuigen. Verwijder deze keer zoveel mogelijk DPBS zonder de blootgestelde RPE te verstoren.
- Voeg voorzichtig trypsine toe aan de oogschelp. Houd het volumeniveau onder de incisielijn en eventuele delen van beschadigde RPE om besmetting te verminderen.
LET OP: Trypsine is een enzym dat bij contact huid- en oogirritatie veroorzaakt. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. - Nadat trypsine aan elk oog is toegevoegd, moet u ervoor zorgen dat het deksel van de petrischaal wordt teruggeplaatst. Breng vervolgens de petrischaal gedurende 30 minuten over naar een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 .
- Herhaal stap 5.1-5.7 voor elke batch totdat alle oogschelpen zijn verwerkt.
6. RPE-collectie
- Verzamel de RPE-cellen van elke batch ogen (2-3 ogen) en plaats ze in een enkele centrifugebuis van 15 ml om het zaaiproces eenvoudig te maken.
- Trituer onder een zaklamp voorzichtig met een pipet van 1000 μl om de RPE-cellen los te maken. Als de RPE-cellen niet loskomen, voeg dan verse trypsine toe en incubeer nog eens 10-15 minuten. Pas op dat u het netvlies niet schraapt.
- Verzamel de RPE-cellen in een centrifugebuisje van 15 ml.
- Was de oogschelp met celkweekmedia om eventuele resterende cellen te verzamelen en de trypsine te neutraliseren. Zorg ervoor dat er ten minste twee keer zoveel media als trypsine in de centrifugebuis van 15 ml zitten.
- Herhaal stap 6.1 totdat RPE-cellen uit alle oogschelpen zijn verzameld.
- Centrifugeer de celsuspensies bij 250 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
7. DNase-werkoplossing voorbereiden
- Bereken het volume van 3 mg/ml DNase-stockoplossing (bereid in stap 1) dat nodig is om toe te voegen aan celkweekmedia voor een eindconcentratie van 100 μg/ml en het uiteindelijke volume van 3 ml per buisje cellen (d.w.z. voor drie centrifugebuisjes met cellen is 9 ml 100 μg/ml DNase-oplossing vereist).
- Combineer de juiste volumes DNase-voorraadoplossing en celkweekmedia. Het gebruik van DNase in de werkoplossing helpt celklontering te voorkomen en zorgt ervoor dat cellen gelijkmatig worden gezaaid.
8. Het zaaien van RPE-cellen
- Verwijder na het centrifugeren in stap 6.3 de supernatanten uit elke centrifugebuis van 15 ml en zorg ervoor dat de celpellet niet wordt verstoord.
- Resuspendeer elke celpellet in 3 ml DNase-werkoplossing.
- Plaats de centrifugebuisjes van 15 ml met de geresuspendeerde cellen gedurende 15 minuten in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 .
- Centrifugeer de celsuspensies na incubatie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 150 x g .
- Verwijder de supernatanten en zorg ervoor dat u de celpellets niet verstoort.
- Resuspendeer elke celpellet in 3 ml verse celkweekmedia.
- Voor elke centrifugebuis met 2-3 ogen aan RPE-cellen, zaait u een putje van een plaat met 6 putjes (doorgang 0).
- Breng de gezaaide plaat met 6 putjes voorzichtig over in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2.
9. Primaire RPE-celkweek bij varkens
- Laat de nieuw gezaaide RPE-cellen 48-72 uur hechten voordat u de plaat verplaatst. Tijdens de eerste mediawissel kan een wasbeurt met verse celkweekmedia worden uitgevoerd om overtollig celafval te helpen verwijderen.
- Vervang de celkweekmedia elke 48 uur.
- Wanneer cellen samenvloeiing bereiken, schakelt u over op een celkweekmedium met een FBS-concentratie van 2% en handhaaft u dit totdat u gaat experimenteren.
10. RPE-cel validatie
- Immunocytochemische (ICC) kleuring
- Fixeer de cellen in 4% formaldehyde in DPBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Was twee keer met DPBS.
- Permeabiliseer cellen (indien nodig) met 0,2% Triton-X 100 in DPBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Was twee keer met DPBS.
- Breng een blokkerende oplossing van 3% (w/v) runderserumalbumine (BSA) aan in DPBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Voeg het primaire antilichaam toe in een verdunning van 1:100 (of de aanbevolen concentratie van de fabrikant) (zie de materiaaltabel) en laat 1 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C staan.
- Was driemaal met DPBS gedurende 5 minuten elk.
- Voeg secundair antilichaam toe (indien nodig) in een dosis van 2 μg/ml (of aanbevolen concentratie van de fabrikant) (zie materiaaltabel) en laat 1 uur op kamertemperatuur staan.
- Was driemaal met DPBS gedurende 5 minuten elk als secundair antilichaam wordt aangebracht.
- Voeg een nucleaire kleuringssonde toe in de concentratie van de fabrikant (zie Materiaaltabel) en laat 25 minuten op kamertemperatuur staan.
- Was drie keer met PBS gedurende 5 minuten.
- Als u zich op een celkweekinzetstuk bevindt, monteer dan op een microscoopglaasje met een dekglaasje met behulp van montagemedium zoals beschreven door Rickabaugh en Weatherston et al.20. Afbeeldingscellen anders in DPBS.
- Scanning elektronenmicroscopie (SEM)
- Volg de procedure beschreven door Harris et al.21.
- Trans-epitheliale elektrische weerstand (TEER)
- Volg het protocol van de fabrikant voor TEER-meting (zie Materiaaltabel) met 1 ml kweekmedium in de basale kamer15.
- Enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA)
- Voer ELISA15 uit met behulp van een multiplex humane enzymgekoppelde immunosorbenttestkit volgens het protocol van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van deze procedure werden primaire RPE-cellen met succes geïsoleerd uit varkensogen. Figuur 1A toont RPE-cellen 3 dagen na isolatie met karakteristieke pigmentatie. Na 1 week groei waren de cellen volledig samenvloeiend en vormden ze een gezonde monolaag (Figuur 1B). Cellen werden vervolgens overgebracht naar celkweekinserts waar ze hun pigmentatie en morfologie behielden (Figuur 1C), wat de doeltreffendheid van de isolatieprocedure verder ondersteunde. Culturen die deze kenmerken niet vertoonden en in plaats daarvan variante morfologie en overmatige pigmentatie vertoonden (Figuur 1D) werden verdacht van cellulaire besmetting en werden niet gebruikt in experimenten. RPE-cellen die in dit manuscript zijn geïsoleerd, brengen RPE65 tot expressie, een eiwit dat sterk tot expressie komt in RPE-cellen (Figuur 2). De gebieden waar de RPE65-expressie lager lijkt, zijn waarschijnlijk te wijten aan pigmentatie die de fluorescentie blokkeert, aangezien die gebieden overeenkomen met zwaarder gepigmenteerde cellen (Figuur 2A). Een ander karakteristiek eiwit dat door de geïsoleerde RPE-cellen tot expressie werd gebracht, was VEGF. Na 10 dagen werd VEGF meer tot expressie gebracht aan de basale zijde van de RPE-monolaag met een concentratie van 2612,5 ± 28,0 pg/ml in vergelijking met de apicale zijde met een concentratie van 2141,2 ± 53,5 pg/ml (Figuur 3). Primaire RPE-cellen van varkens hebben ook microvilli en geplaveide morfologie (Figuur 4). Bovendien stegen de TEER-waarden bij kweek op celkweekinserts van 166,1 ± 75,9 Ω∙cm2 na 7 dagen tot 363,4 ± 9,0 Ω∙cm2 na 14 dagen (Figuur 5), wat wijst op consistente, gezonde tight junction-vorming in de loop van de tijd22. Om de vorming van juncties verder te onderzoeken, werden RPE-cellen geanalyseerd op ZO-1-expressie, die gelokaliseerd was op celgrenzen, wat een gezonde junctievorming en monolaagintegriteit impliceert (Figuur 6).
Figuur 1: Primaire RPE na te zijn gezaaid op putplaten en gesubcultiveerd. Gezonde RPE-cellen 3 dagen na isolatie (A), volledig confluente monolaag 7 dagen na isolatie (B), RPE met succes gepasseerd op een kweekinzetstuk (C) en gebieden met mogelijke cellulaire besmetting (pijlen) op een RPE-cultuur (D). Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Immunocytochemische beelden van RPE65-expressie in RPE-cellen van varkens. Brightfield (A), RPE65 (B), kernen (C) en samengevoegde (D) beelden van cellen 15 dagen na het zaaien. Let op, de korrelige achtergrond in het helderveldbeeld is het poreuze kweekinsteekmembraan. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: VEGF-expressie in apicale en basale zijden van de RPE-monolaag. De VEGF-concentratie werd bepaald door een ELISA die werd uitgevoerd na 10 dagen celgroei op kweekinserts. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie met n = 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Scanning-elektronenmicroscopie (SEM)-beeld van primaire RPE-cellen van varkens. Cellen werden gedurende 30 dagen gekweekt vóór beeldvorming. Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: TEER-metingen uitgevoerd op RPE-cellen gekweekt op celkweekinserts. Weerstandswaarden na 7, 10 en 14 dagen groei. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie met n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Immunocytochemische beelden van ZO-1-expressie in RPE-cellen van varkens. Brightfield (A) ZO-1 (B), kernen (C) en samengevoegde (D) beelden van cellen 6 dagen na het zaaien op glazen bodemputplaten. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft hoe RPE-cellen uit varkensogen kunnen worden geïsoleerd. Pigmentatie en geplaveide morfologie worden gezien binnen 7 dagen na isolatie (Figuur 1B). Bovendien duiden TEER-gegevens op tight junction-vorming22 en een gezonde monolaag (figuur 5). Deze resultaten tonen aan dat RPE-cellen die met deze methode zijn geïsoleerd, vergelijkbaar zijn met menselijke RPE en nuttig kunnen zijn in retinale celkweekmodellen.
De ogen die in dit manuscript worden gebruikt, zijn post-mortem verkregen van een plaatselijke slagerij, maar kunnen ook worden verkregen uit andere bronnen, zoals academische instellingen met medewerkers die varkensproducten gebruiken. Het is belangrijk om zo snel mogelijk na de dood van het dier met de procedure te beginnen en de ogen voorafgaand aan de procedure koel te houden. Tijdens de isolatie is het essentieel om de RPE niet te verstoren tot trituratie na trypsinisatie. Deze zorg is het meest cruciaal bij het pellen van het neurale netvlies, omdat een gebrek aan voorzichtigheid ertoe kan leiden dat Bruch's membraan1 met het pincet wordt vastgepakt en andere celtypen in de oplossing worden ingebracht.
Hoewel deze procedure is geoptimaliseerd voor onze omstandigheden, kunnen er enkele wijzigingen in de methodologie worden aangebracht. Als bijvoorbeeld specifieke zaaidichtheden gewenst zijn, kunnen cellen worden geteld na de DNase-incubatie. Bovendien, als vacuümaspiratie niet werkt, kan het neurale netvlies worden verwijderd door voorzichtig te knippen met een kleine, gebogen schaar. Bij het zaaien voor experimenten kan een hoge zaaidichtheid zoals 2,5 x 105 cellen/cm2 worden gebruikt om overmatige celdeling te voorkomen. Bovendien wordt herhaald passeren niet aanbevolen, omdat de cellen hun oorspronkelijke fenotypes kunnen beginnen te verliezen. Hoewel deze studie passage 1-cellen heeft gebruikt voor experimenten, kunnen mogelijk extra passages worden gebruikt als het RPE-fenotype en de kenmerken behouden blijven. Ten slotte kan desgewenst een concentratie van 1% FBS worden gebruikt voor subcultuur of experimenten in plaats van 2%.
Er zijn een paar nadelen aan deze methode. Ten eerste is het moeilijk om de leeftijd, het geslacht, het ras en het tijdstip van overlijden van dieren te repliceren of te verkrijgen, wat veelvoorkomende problemen zijn bij primaire celisolatie. Ten tweede kan overtrypsinisatie snel resulteren in abnormale cellen, wat ook is opgemerkt door Fietz et al17. Uiteindelijk biedt deze methode echter een goedkope en efficiënte manier om primaire RPE-cellen te verkrijgen. Deze cellen hebben geen lange differentiatietijden nodig zoals iPSC's. Deze varkens-RPE hebben ook van nature belangrijke structuren, zoals microvilli en pigmentatie15,16, in tegenstelling tot hun niet-gedifferentieerde tegenhangers. Als zodanig bieden deze cellen een meer representatief celtype voor netvliesstudies. Ten slotte zou deze methode zeer nuttig kunnen zijn voor meer landelijke gebieden of instellingen die geen toegang hebben tot menselijke donorogen om netvliesmodellen te produceren die analoog zijn aan menselijke modellen om zicht en ziekte te begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
De auteurs willen Farhad Farjood bedanken voor zijn hulp bij het kweken en isoleren van RPE-cellen bij varkens en Thomas Harris voor zijn hulp bij SEM. De auteurs erkennen de steun van de Microscopy Core Facility aan de Utah State University voor de SEM-analyse. De faciliteit onderhoudt een scanning-elektronenmicroscoop die is verkregen via een National Science Foundation Major Research Instrumentation Grant (CMMI-1337932). Financiering voor deze studie werd verstrekt door een National Institutes of Health via Grant 1R15EY028732 (Vargis) en een BrightFocus Foundation Grant M2019109 (Vargis). Aanvullende financiering werd verstrekt door een Undergraduate Research and Creative Opportunities Grant (Weatherston) van het Office of Research van de Utah State University en een startsubsidie (Vargis) van het Alzheimer's Disease and Dementia Research Center van de Utah State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified - calcium - magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch's membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Georgiadis, A., et al. The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice. PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Yang, S., Zhou, J., Li, D. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).
- Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).
- Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function. Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).
- Hellinen, L., et al. Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model. Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Samuel, W., et al. Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells. Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).
- Middleton, S.
- Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis. Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).
- Paterson, C., Cannon, J., Vargis, E. The impact of early RPE cell junction loss on VEGF, Ang-2, and TIMP secretion in vitro. , http://www.molvis.org/molvis/v29/87/ (2023).
- Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures. STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).
- Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).
- Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of bruch's membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).
- Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch's membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).
- Zou, X. L., et al. Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide. International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).
