Summary
Ce protocole décrit la procédure d’obtention et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes primaires (EPR) à partir d’yeux porcins d’origine locale. Ces cellules constituent une alternative de haute qualité aux cellules souches et conviennent à la recherche rétinienne in vitro .
Abstract
L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche cruciale dans la rétine externe responsable du soutien des photorécepteurs. La dégénérescence de l’EPR survient généralement dans les maladies marquées par une perte de vision progressive, comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). La recherche sur la DMLA repose souvent sur des yeux de donneurs humains ou des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) pour représenter l’EPR. Cependant, ces sources d’EPR nécessitent des périodes de différenciation prolongées et une expertise substantielle pour la culture. De plus, certains instituts de recherche, en particulier ceux des zones rurales, n’ont pas facilement accès aux yeux des donneurs. Bien qu’il existe une lignée cellulaire d’EPR immortalisée disponible dans le commerce (ARPE-19), elle ne présente pas les caractéristiques essentielles de l’EPR in vivo et n’est pas largement acceptée dans de nombreuses publications de recherche en ophtalmologie. Il est urgent d’obtenir des cellules primaires représentatives de l’EPR à partir d’une source plus facilement disponible et plus rentable. Ce protocole élucide l’isolement et de la sous-culture de cellules primaires de l’EPR obtenues post-mortem à partir d’yeux porcins, qui peuvent être obtenues localement auprès de fournisseurs commerciaux ou universitaires. Ce protocole nécessite des matériaux courants que l’on trouve généralement dans les laboratoires de culture tissulaire. Le résultat est une alternative primaire, différenciée et rentable aux iPSC, aux yeux de donneurs humains et aux cellules ARPE-19.
Introduction
L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche située dans la rétine externe entre la membrane de Bruch et les photorécepteurs1. Les cellules de l’EPR forment des jonctions serrées avec des protéines telles que la zonula occludens-1 (ZO-1) et possèdent un phénotype distinctif caractérisé par la pigmentation et la morphologie hexagonale 2,3. Ces cellules contribuent à la barrière hémato-rétinienne, soutenant ainsi la santé des photorécepteurs et maintenant l’homéostasie rétinienne 4,5. De plus, les cellules RPE jouent un rôle essentiel dans la vision en absorbant la lumière et en recyclant les composants essentiels pour les photorécepteurs6. Par exemple, RPE65, une protéine fortement exprimée dans les cellules RPE, convertit les esters de rétinyle tout-trans en rétinol 11-cis 7,8. Compte tenu de la multitude de fonctions remplies par les cellules EPR, leur dysfonctionnement est impliqué dans diverses maladies, notamment la dégénérescence maculaire liée à l’âge et la rétinopathie diabétique 9,10. Pour améliorer la compréhension des pathologies rétiniennes et développer de nouveaux traitements, des modèles in vitro de la rétine sont fréquemment utilisés.
Pour générer des modèles représentatifs de rétines saines ou malades, il est impératif d’utiliser un type de cellule RPE mimétique. La lignée cellulaire ARPE-19 disponible dans le commerce n’a pas de phénotypes natifs, tels que la pigmentation, tandis que les iPSC peuvent prendre des mois pour se différencier 11,12,13. Bien que les yeux de donneurs humains puissent être idéaux, ils ne sont souvent pas facilement accessibles à de nombreux laboratoires de recherche.
Ici, nous avons conçu une méthode pour utiliser les yeux porcins, qui partagent de nombreuses similitudes avec les yeux humains14, pour obtenir des cellules primaires de l’EPR. Ces cellules primaires de l’EPR porcine ont été utilisées dans plusieurs modèles rétiniens15,16. Non seulement ces cellules sont rentables, mais elles nécessitent également moins de temps à acquérir que les iPSC ou les yeux du donneur. De plus, ils présentent des caractéristiques natives, telles que la pigmentation et les microvillosités. Bien qu’il existe des protocoles similaires pour l’extraction de l’EPR porcin 17,18,19, cette technique simple et détaillée valide davantage la dissociation enzymatique et utilise des matériaux couramment trouvés dans la plupart des laboratoires de culture cellulaire.
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Protocol
Les yeux utilisés dans cette procédure sont obtenus post-mortem d’une boucherie locale inspectée par l’USDA, et aucun travail n’est effectué avec des animaux vivants. Après le sacrifice des animaux, environ 2 heures s’écoulent avant que les yeux ne soient énucléés. Comme la carie des tissus peut commencer à se produire, il est important de garder les yeux au frais pendant le transport pour éviter d’autres caries. Dans cette procédure, les yeux sont immédiatement placés dans un réfrigérateur après l’énucléation. Par la suite, la poche d’yeux est placée à l’intérieur d’un bécher en polypropylène de 1000 mL et entourée de glace dans une glacière de 8 L. Il est important de ne pas placer les yeux directement sur la glace. Une fois les yeux arrivés au laboratoire, l’isolement des cellules EPR est effectué dans une enceinte de biosécurité. Il est crucial de terminer ce processus dans les 3 à 5 heures. Ce protocole a été optimisé pour le traitement de 10 yeux.
1. Préparation des aliquotes de base DNase
REMARQUE : Il est recommandé d’effectuer cette étape avant l’isolement.
- Préparez une solution de chlorure de calcium de 5 mM avec de l’eau désionisée stérile.
ATTENTION : La poudre de chlorure de calcium peut provoquer une irritation ou des lésions oculaires graves. Portez l’EPI approprié. - Ajouter 5 mM de solution de chlorure de calcium à la poudre de DNase (voir le tableau des matériaux) pour obtenir une concentration finale de DNase de 3 mg/mL. Assurez-vous que la solution est bien mélangée.
ATTENTION : La DNase présente un risque de sensibilisation respiratoire. Ne pas inhaler la poudre/substance. - Aliquote de petits volumes, par exemple 1 mL, dans des tubes de microcentrifugation.
- Congeler les aliquotes à -20 °C jusqu’à utilisation.
2. Mise en place de la zone de dissection
- Transférez les instruments de dissection stériles et le matériel de culture cellulaire dans l’enceinte de biosécurité : champ chirurgical, boîtes de Pétri, passoires cellulaires, plaques à puits, gaze, pince à épiler, manche de scalpel, lame de scalpel et ciseaux à iris (voir tableau des matériaux).
- À l’aide d’une pince à épiler, disposez le champ chirurgical. Placez une plaque à 6 puits sur le champ chirurgical et retirez le couvercle.
- Placer une aliquote de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) stérile sur de la glace et dans l’enceinte de biosécurité.
- Remplir un puits d’une plaque de 6 puits à moitié pleine (environ 6 ml) de solution de povidone iodée à 10 %.
- Remplissez les puits restants avec du DPBS réfrigéré.
- Retirez le couvercle de l’une des boîtes de Pétri et placez-le, à l’envers, sur le champ chirurgical. Mettez de côté la base de la boîte de Pétri comme récipient à déchets.
- Placer une aliquote de milieu de culture cellulaire (milieu modifié Eagle de Dulbecco (DMEM), 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 1 % d’antibiotiques/antimycosiques) et une aliquote de 0,25 % de trypsine/EDTA dans un bain-marie à 37 °C.
- Retirez la solution mère de DNase du congélateur (voir le reste du protocole pour plus de détails).
3. Retrait des tissus extérieurs
REMARQUE : L’ablation des tissus extérieurs peut être effectuée à l’extérieur de l’enceinte de biosécurité. Inspectez l’œil avant de couper pour vous assurer que la sclérotique n’a pas été perforée, que la pupille n’est pas embuée et que le nerf optique est présent. Jetez les yeux qui ne répondent pas à ces critères.
- Tout en tenant le muscle attaché à l’œil d’une main, utilisez l’autre main pour couper doucement le tissu entourant la sclère avec un scalpel. Veillez à ne pas écraser l’œil ou à ne pas couper accidentellement la sclère. Si la sclérotique est coupée et expose l’intérieur noir, jetez l’œil.
ATTENTION : Un gant résistant aux coupures est fortement recommandé pour la main qui tient le muscle afin de se protéger contre les coupures accidentelles. - Coupez le nerf optique avec des ciseaux à iris incurvés à une longueur ne dépassant pas 3 mm. Si le nerf optique est trop long, l’œilleton ne s’installera pas correctement dans la crépine cellulaire plus tard.
- Placez l’œil sur de la glace avec la cornée vers le bas.
- Répétez les étapes 3.1 à 3.3 jusqu’à ce que le tissu externe soit retiré de chaque œil.
4. Dissection oculaire
- Utilisez une pince à épiler pour transférer un œil dans l’enceinte de sécurité biologique et dans le puits contenant une solution de povidone iodée à 10 % et faites pivoter l’œil pour vous assurer qu’il est entièrement recouvert de la solution d’iode. Pour garder les outils aussi stériles que possible, ces pinces à épiler ne doivent être utilisées que pour toucher l’extérieur de l’œil.
- Pendant que l’œil est assis dans une solution d’iode, placez une gaze stérile sur le couvercle inversé peu profond de la boîte de Pétri préparée précédemment. Dans une boîte de Pétri séparée, placez une passoire cellulaire. N’utilisez la crépine que pour soutenir l’œilleton, et non pour séparer les cellules.
- Après avoir laissé l’œil reposer dans une solution d’iode pendant environ 30 s, lavez-le en le plongeant dans les puits contenant du DPBS pendant environ 5 s chacun, en vous déplaçant de puits en puits pour diluer progressivement la solution d’iode, et transférez l’œil sur la gaze stérile.
- Faites une petite incision à l’aide d’un scalpel sous l’ora serrata, ou à environ 1/3 du globe à partir du bord de l’iris.
- Après l’incision, utilisez des ciseaux à iris pour couper uniformément le long de la circonférence du globe, parallèlement à la cornée. Lorsque vous manœuvrez l’œil, utilisez uniquement la pince à épiler pour toucher l’extérieur de l’œil ou la gaze pour maintenir la stérilité.
- Utilisez la pince à épiler pour saisir le nerf optique et soulevez doucement le globe de la gaze. Le vitré devrait tomber du globe. Si nécessaire, secouez doucement l’œil pour aider à déloger le vitré.
REMARQUE : Si le vitré est très difficile à enlever, essayez de couper plus bas sur le globe. - Placez délicatement l’œilleton dans la passoire à cellules préparée, avec l’intérieur de l’œilleton vers le haut. Si elle est inégale, utilisez une pince à épiler pour ajuster l’œilleton afin d’obtenir l’incision aussi plane que possible.
- Ajoutez doucement du DPBS refroidi dans l’œilleton de manière à ce que le niveau de liquide soit juste en dessous du point le plus bas de l’incision. Ce DPBS sera retiré après l’ablation de la rétine neurale.
REMARQUE : Le volume de DPBS ajouté varie en fonction de la taille de l’œil et de l’emplacement de l’incision. - Répétez les étapes 4.1 à 4.8 jusqu’à ce que tous les yeux soient disséqués.
5. Élimination de la rétine neurale et dissociation de l’EPR
REMARQUE : La section suivante est plus facile à réaliser par étapes. Dans cette configuration, ce processus est effectué sur un lot (généralement 3 œilletons) à la fois. Pour les étapes 5.1 à 5.7, chaque étape doit être effectuée sur l’ensemble du lot avant de passer à l’étape suivante.
- Sous une lampe de poche, trouvez les zones où la rétine neurale (blanche/rose) commence à se détacher de l’EPR (noir). Ensuite, utilisez une pince à épiler émoussée pour saisir doucement la rétine neurale soulevée et la décoller.
REMARQUE : S’il n’y a pas de zones où la rétine neurale se détache, utilisez la pince à épiler pour la saisir doucement près du haut de l’œilleton. En utilisant cette méthode, si des dommages sont causés à l’EPR/choroïde, ces cellules ne seront pas dissociées lors de la collecte de l’EPR. - Prélevez doucement la rétine neurale près du disque optique.
- Aspirer la rétine neurale à l’aide d’une pipette Pasteur fixée à un système d’aspiration intra-utérine. Il est recommandé d’adoucir l’aspiration pour faciliter le processus d’élimination.
REMARQUE : Une pointe de pipette peut être placée à l’extrémité d’une pipette Pasteur pour réduire l’aspiration. - Ajoutez soigneusement des DPBS refroidis supplémentaires pour remplacer ce qui a été aspiré.
- Retirez la rétine neurale restante en aspirant une fois de plus. Cette fois, retirez autant de DPBS que possible sans perturber l’EPR exposé.
- Ajoutez délicatement de la trypsine dans l’œilleton. Gardez le niveau de volume en dessous de la ligne d’incision et de toute section d’EPR endommagée pour réduire la contamination.
ATTENTION : La trypsine est une enzyme qui provoque une irritation de la peau et des yeux au contact. Portez l’EPI approprié. - Après avoir ajouté de la trypsine à chaque œil, assurez-vous que le couvercle de la boîte de Pétri est remplacé. Ensuite, transférez la boîte de Pétri dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 30 min.
- Répétez les étapes 5.1 à 5.7 pour chaque lot jusqu’à ce que tous les œilletons aient été traités.
6. Collecte RPE
- Prélevez les cellules EPR de chaque lot d’yeux (2-3 yeux) et placez-les dans un seul tube à centrifuger de 15 ml pour faciliter le processus d’ensemencement.
- Sous une lampe de poche, triturer doucement à l’aide d’une pipette de 1000 μL pour déloger les cellules EPR. Si les cellules de l’EPR ne se détachent pas, ajoutez de la trypsine fraîche et incubez pendant 10 à 15 minutes supplémentaires. Attention à ne pas gratter la rétine.
- Recueillir les cellules EPR dans un tube à centrifuger de 15 ml.
- Lavez l’œilleton avec un milieu de culture cellulaire pour recueillir les cellules restantes et neutraliser la trypsine. S’assurer qu’il y a au moins deux fois le volume de milieu à trypsine dans le tube à centrifuger de 15 ml.
- Répétez l’étape 6.1 jusqu’à ce que les cellules EPR aient été prélevées sur tous les œilletons.
- Centrifuger les suspensions cellulaires à 250 x g pendant 5 min à température ambiante.
7. Préparation de la solution de travail DNase
- Calculer le volume de solution mère de DNase à 3 mg/mL (préparée à l’étape 1) à ajouter au milieu de culture cellulaire pour une concentration finale de 100 μg/mL et un volume final de 3 mL par tube de cellules (c.-à-d. pour trois tubes à centrifuger de cellules, 9 mL de solution de DNase à 100 μg/mL sont nécessaires).
- Combinez les volumes appropriés de solution mère de DNase et de milieux de culture cellulaire. L’utilisation de DNase dans la solution de travail aide à prévenir l’agglutination des cellules et permet aux cellules d’être ensemencées uniformément.
8. Ensemencement de cellules EPR
- Après la centrifugation à l’étape 6.3, retirer les surnageants de chaque tube à centrifuger de 15 mL, en prenant soin de ne pas perturber la pastille cellulaire.
- Remettre en suspension chaque pastille de cellule dans 3 mL de solution de travail DNase.
- Placer les tubes à centrifuger de 15 mL contenant les cellules remises en suspension dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 15 min.
- Après l’incubation, centrifuger les suspensions cellulaires à 150 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Retirez les surnageants en prenant soin de ne pas perturber les granulés cellulaires.
- Remettre chaque pastille de cellule en suspension dans 3 mL de milieu de culture cellulaire frais.
- Pour chaque tube à centrifuger contenant 2 à 3 yeux de cellules EPR, ensemencer un puits d’une plaque à 6 puits (passage 0).
- Transférez délicatement la plaque ensemencée à 6 puits dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.
9. Culture primaire de cellules EPR porcines
- Laissez les cellules RPE nouvellement ensemencées se fixer pendant 48 à 72 h avant de déplacer la plaque. Lors du premier changement de milieu, un lavage avec un milieu de culture cellulaire frais peut être effectué pour aider à éliminer les débris cellulaires en excès.
- Remplacez le milieu de culture cellulaire toutes les 48 h.
- Lorsque les cellules atteignent la confluence, passer à un milieu de culture cellulaire avec une concentration de FBS de 2 % et maintenir jusqu’à l’expérimentation.
10. Validation des cellules RPE
- Coloration immunocytochimique (ICC)
- Fixer les cellules dans du formaldéhyde à 4 % dans du DPBS pendant 10 min à température ambiante.
- Laver deux fois avec DPBS.
- Perméabiliser les cellules (si nécessaire) en utilisant 0,2 % de Triton-X 100 dans DPBS pendant 10 min à température ambiante.
- Laver deux fois avec DPBS.
- Appliquer une solution bloquante d’albumine sérique bovine (BSA) à 3 % (p/v) dans le DPBS pendant 1 h à température ambiante.
- Ajouter l’anticorps primaire à une dilution de 1:100 (ou concentration recommandée par le fabricant) (voir le tableau des matières) et laisser reposer pendant 1 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.
- Lavez trois fois avec DPBS pendant 5 min chacune.
- Ajouter l’anticorps secondaire (au besoin) à 2 μg/mL (ou concentration recommandée par le fabricant) (voir le tableau des matières) et laisser reposer pendant 1 h à température ambiante.
- Laver trois fois avec du DPBS pendant 5 minutes chacune si des anticorps secondaires sont appliqués.
- Ajouter la sonde de coloration nucléaire à la concentration du fabricant (voir le tableau des matériaux) et laisser reposer 25 min à température ambiante.
- Lavez trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune.
- S’il s’agit d’un insert de culture cellulaire, monter sur une lame de microscope à l’aide d’une lamelle de recouvrement en utilisant un milieu de montage comme décrit par Rickabaugh et Weatherston et al.20. Sinon, imagez les cellules dans DPBS.
- Microscopie électronique à balayage (MEB)
- Suivez la procédure décrite par Harris et al.21.
- Résistance électrique trans-épithéliale (TEER)
- Suivre le protocole du fabricant pour la mesure de la FEER (voir le tableau des matières) avec 1 mL de milieu de culture dans la chambre basale15.
- Test immuno-enzymatique (ELISA)
- Effectuer l’ELISA15 à l’aide d’une trousse de dosage immuno-enzymatique humain multiplex en suivant le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).
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Representative Results
En utilisant cette procédure, les cellules primaires de l’EPR ont été isolées avec succès des yeux porcins. La figure 1A montre les cellules EPR 3 jours après l’isolement avec une pigmentation caractéristique. Après 1 semaine de croissance, les cellules étaient complètement confluentes et formaient une monocouche saine (Figure 1B). Les cellules ont ensuite été transférées dans des inserts de culture cellulaire où elles ont conservé leur pigmentation et leur morphologie (Figure 1C), ce qui a renforcé l’efficacité de la procédure d’isolement. Les cultures qui ne présentaient pas ces caractéristiques et présentaient plutôt une morphologie variée et une pigmentation excessive (figure 1D) ont été soupçonnées de contamination cellulaire et n’ont pas été utilisées dans les expériences. Les cellules de l’EPR isolées dans ce manuscrit expriment la protéine RPE65, une protéine fortement exprimée dans les cellules de l’EPR (Figure 2). Les zones où l’expression de RPE65 semble plus faible sont probablement dues à la pigmentation bloquant la fluorescence, car ces zones correspondent à des cellules plus fortement pigmentées (Figure 2A). Une autre protéine caractéristique exprimée par les cellules RPE isolées était le VEGF. Après 10 jours, le VEGF était davantage exprimé sur la face basale de la monocouche d’EPR avec une concentration de 2612,5 ± 28,0 pg/mL par rapport à la face apicale avec une concentration de 2141,2 ± 53,5 pg/mL (figure 3). Les cellules primaires de l’EPR porcine ont également une morphologie de microvillosités et de pavés (Figure 4). De plus, lorsqu’ils sont cultivés sur des inserts de culture cellulaire, les lectures de TEER sont passées de 166,1 ± 75,9 Ω∙cm2 à 7 jours à 363,4 ± 9,0 Ω∙cm2 après 14 jours (Figure 5), indiquant une formation de jonctions serrées constante et saine au fil du temps22. Pour étudier plus en détail la formation des jonctions, les cellules RPE ont été analysées pour l’expression de ZO-1, qui a été localisée aux limites cellulaires, ce qui implique la formation de jonctions saines et l’intégrité de la monocouche (Figure 6).
Figure 1 : EPR primaire après avoir été ensemencé sur des plaques de puits et sous-cultivé. Cellules EPR saines 3 jours après l’isolement (A), monocouche entièrement confluente 7 jours après l’isolement (B), EPR passé avec succès sur un insert de culture (C) et zones de contamination cellulaire potentielle (flèches) sur une culture EPR (D). Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images immunocytochimiques montrant l’expression de RPE65 dans les cellules porcines de l’EPR. Images en fond clair (A), RPE65 (B), noyaux (C) et fusionnées (D) de cellules 15 jours après l’ensemencement. Notez que le fond granuleux de l’image en fond clair est la membrane poreuse de l’insert de culture. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Expression du VEGF dans les côtés apical et basal de la monocouche EPR. La concentration de VEGF a été déterminée par un test ELISA effectué après 10 jours de croissance cellulaire sur des inserts de culture. Les barres d’erreur représentent l’écart-type avec n = 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Image de microscopie électronique à balayage (MEB) de cellules primaires porcines d’EPR. Les cellules ont été cultivées pendant 30 jours avant l’imagerie. Barre d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Lectures TEER effectuées sur des cellules EPR cultivées sur des inserts de culture cellulaire. Valeurs de résistance après 7, 10 et 14 jours de croissance. Les barres d’erreur représentent l’écart-type avec n = 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Images immunocytochimiques montrant l’expression de ZO-1 dans les cellules EPR porcines. Images en fond clair (A) ZO-1 (B), noyaux (C) et fusionnées (D) de cellules 6 jours après l’ensemencement sur des plaques à fond de verre. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole décrit comment isoler les cellules EPR des yeux porcins. La pigmentation et la morphologie des pavés sont observées dans les 7 jours suivant l’isolement (Figure 1B). De plus, les données TEER indiquent la formation de jonctions serrées22 et une monocouche saine (Figure 5). Ces résultats montrent que les cellules EPR isolées avec cette méthode sont similaires à l’EPR humaine et peuvent être bénéfiques dans les modèles de culture cellulaire rétinienne.
Les yeux utilisés dans ce manuscrit sont obtenus post-mortem dans une boucherie locale, mais pourraient également être obtenus auprès d’autres sources, telles que des contextes universitaires avec des collaborateurs utilisant des produits porcins. Il est important de commencer la procédure le plus tôt possible après la mort de l’animal et de garder les yeux frais avant la procédure. Pendant l’isolement, il est essentiel de ne pas perturber l’EPR jusqu’à la trituration après trypsinisation. Ce soin est particulièrement important lors du pelage de la rétine neurale, car un manque de prudence peut conduire à saisir la membrane1 de Bruch avec la pince à épiler et à introduire d’autres types de cellules dans la solution.
Bien que cette procédure ait été optimisée pour nos conditions, certaines modifications peuvent être apportées à la méthodologie. Par exemple, si des densités d’ensemencement spécifiques sont souhaitées, les cellules peuvent être comptées après l’incubation de la DNase. De plus, si l’aspiration intra-utérine ne fonctionne pas, la rétine neurale peut être retirée en coupant soigneusement avec de petits ciseaux incurvés. Lors de l’ensemencement pour les expériences, une densité d’ensemencement élevée telle que 2,5 x 105 cellules/cm2 peut être utilisée pour éviter une division cellulaire excessive. De plus, le passage répété n’est pas recommandé car les cellules peuvent commencer à perdre leurs phénotypes natifs. Bien que cette étude ait utilisé des cellules de passage 1 pour des expériences, des passages supplémentaires pourraient potentiellement être utilisés si le phénotype et les caractéristiques de l’EPR sont maintenus. Enfin, une concentration de 1 % de FBS peut être utilisée pour la sous-culture ou l’expérimentation au lieu de 2 %, si vous le souhaitez.
Cette méthode présente quelques inconvénients. Premièrement, il est difficile de reproduire ou d’obtenir l’âge, le sexe, la race et l’heure de la mort des animaux, qui sont des problèmes courants dans l’isolement cellulaire primaire. Deuxièmement, une trypsinisation excessive peut rapidement entraîner des cellules anormales, ce qui a également été noté par Fietz et al17. Cependant, en fin de compte, cette méthode offre un moyen peu coûteux et efficace d’obtenir des cellules primaires de l’EPR. Ces cellules ne nécessitent pas de longs temps de différenciation comme les iPSC. Ces EPR porcins ont également des structures clés de manière innée, comme les microvillosités et la pigmentation15,16, contrairement à leurs homologues non différenciés. En tant que telles, ces cellules offrent un type de cellule plus représentatif pour les études rétiniennes. Enfin, cette méthode pourrait être très bénéfique pour les zones plus rurales ou les institutions qui n’ont pas accès aux yeux de donneurs humains pour produire des modèles rétiniens analogues aux modèles humains pour comprendre la vision et la maladie.
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Disclosures
Aucun.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Farhad Farjood pour son aide dans la culture et l’isolement de cellules EPR porcines et Thomas Harris pour son aide dans le MEB. Les auteurs remercient le soutien de la plateforme de microscopie de l’Université d’État de l’Utah pour l’analyse MEB. L’installation entretient un microscope électronique à balayage acquis grâce à une subvention d’instrumentation de recherche majeure de la National Science Foundation (CMMI-1337932). Le financement de cette étude a été fourni par les National Institutes of Health par le biais de la subvention 1R15EY028732 (Vargis) et d’une subvention de la Fondation BrightFocus M2019109 (Vargis). Un financement supplémentaire a été fourni par une subvention de recherche de premier cycle et d’opportunités créatives (Weatherston) du Bureau de la recherche de l’Université d’État de l’Utah et une subvention de démarrage (Vargis) du Centre de recherche sur la maladie d’Alzheimer et la démence de l’Université d’État de l’Utah.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified - calcium - magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
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