Summary
이 프로토콜은 국소에서 공급된 돼지 눈에서 원발성 망막 색소 상피(RPE) 세포를 얻고 배양하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이 세포는 줄기 세포의 고품질 대안 역할을 하며 체외 망막 연구에 적합합니다.
Abstract
망막 색소 상피(RPE)는 광수용체를 지지하는 역할을 하는 외막 외막의 중요한 단층입니다. RPE 변성은 일반적으로 연령 관련 황반 변성(AMD)과 같은 점진적인 시력 상실을 특징으로 하는 질병에서 발생합니다. AMD에 대한 연구는 RPE를 나타내기 위해 인간 기증자의 눈 또는 유도만능줄기세포(iPSC)에 의존하는 경우가 많습니다. 그러나 이러한 RPE 소스는 배양을 위해 연장된 분화 기간과 상당한 전문 지식이 필요합니다. 또한 일부 연구 기관, 특히 농촌 지역의 연구 기관은 기증자의 눈에 쉽게 접근할 수 없습니다. 상업적으로 이용 가능한 불멸의 RPE 세포주(ARPE-19)가 존재하지만, 생체 내 필수 RPE 기능이 부족하고 많은 안과 연구 간행물에서 널리 받아들여지지 않습니다. 보다 쉽게 구할 수 있고 비용 효율적인 소스에서 대표적인 1차 RPE 세포를 확보해야 할 필요성이 시급합니다. 이 프로토콜은 돼지 눈에서 사후 검시한 1차 RPE 세포의 분리 및 하위 배양을 설명하며, 이는 상업 또는 학술 공급업체로부터 현지에서 공급받을 수 있습니다. 이 프로토콜에는 조직 배양 실험실에서 일반적으로 볼 수 있는 일반적인 재료가 필요합니다. 그 결과 iPSC, 인간 기증자 눈 및 ARPE-19 세포에 대한 1차적이고 차별화된 비용 효율적인 대안이 탄생했습니다.
Introduction
망막 색소 상피(RPE)는 브루흐 막과 광수용체 사이의 외막 망막에 위치한 단층이다1. RPE 세포는 zonula occludens-1 (ZO-1)과 같은 단백질과 긴밀한 연접을 형성하고 색소 침착 및 육각형 형태 2,3을 특징으로하는 독특한 표현형을 가지고 있습니다. 이 세포는 혈액-망막 장벽에 기여하여 광수용체 건강을 지원하고 망막 항상성을 유지합니다 4,5. 또한 RPE 세포는 빛을 흡수하고 광수용체의 필수 구성 요소를 재활용함으로써 시력에 중요한 역할을 합니다6. 예를 들어, RPE 세포에서 고도로 발현되는 단백질인 RPE65는 all-trans 레티닐 에스테르를 11-시스 레티놀 7,8로 전환합니다. RPE 세포가 수행하는 다양한 기능을 감안할 때, RPE 세포의 기능 장애는 연령 관련 황반 변성 및 당뇨병성 망막병증을 포함한 다양한 질병과 관련이 있습니다 9,10. 망막 병리학에 대한 이해를 높이고 새로운 치료법을 개발하기 위해 망막의 체외 모델이 자주 사용됩니다.
건강한 망막 또는 병든 망막의 대표 모델을 생성하려면 모방 RPE 세포 유형을 사용하는 것이 필수적입니다. 상업적으로 이용 가능한 ARPE-19 세포주는 색소 침착과 같은 네이티브 표현형이 없는 반면, iPSC는 11,12,13을 분화하는 데 수개월이 걸릴 수 있습니다. 인간 기증자의 눈이 이상적일 수 있지만 많은 연구실에서 쉽게 사용할 수 없는 경우가 많습니다.
여기에서, 우리는 1차 RPE 세포를 얻기 위해 인간의 눈(14)과 많은 유사성을 공유하는 돼지 눈을 활용하는 방법을 고안했다. 이들 일차 돼지 RPE 세포는 다수의 망막 모델에서 이용되어 왔다15,16. 이러한 세포는 비용 효율적일 뿐만 아니라 iPSC 또는 기증자의 눈보다 획득하는 데 더 적은 시간이 필요합니다. 또한 색소 침착 및 미세 융모와 같은 고유 특성을 나타냅니다. 돼지 RPE 추출을 위한 유사한 프로토콜이 존재하지만(17,18,19), 이 간단하고 상세한 기술은 효소 해리를 추가로 검증하고 대부분의 세포 배양 실험실에서 흔히 볼 수 있는 물질을 사용합니다.
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Protocol
이 절차에 사용된 눈은 USDA가 검사한 현지 정육점에서 사후 검시한 것이며 살아있는 동물을 사용하여 작업을 수행하지 않습니다. 동물을 희생 제물로 바친 후 약 2시간이 지나야 눈이 적출됩니다. 조직 부패가 발생하기 시작할 수 있으므로 더 이상의 충치를 방지하기 위해 이송 중에 눈을 시원하게 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차에서 눈은 적출 후 즉시 냉장고에 넣습니다. 그 후, 눈 주머니는 1000mL 폴리프로필렌 비커 안에 배치되고 8L 쿨러 내에서 얼음으로 둘러싸여 있습니다. 얼음에 직접 눈을 대지 않는 것이 중요합니다. 눈이 실험실에 도착하면 RPE 세포의 분리는 생물 안전 캐비닛 내에서 수행됩니다. 3-5시간 이내에 이 프로세스를 완료하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 10개의 눈을 처리하는 데 최적화되어 있습니다.
1. DNase 원료 부분 표본 준비
알림: 이 단계는 격리 전에 수행하는 것이 좋습니다.
- 멸균 탈이온수로 5mM 염화칼슘 용액을 준비합니다.
주의 : 염화칼슘 분말은 눈에 심한 자극이나 손상을 일으킬 수 있습니다. 적절한 PPE를 착용하십시오. - 5mM 염화칼슘 용액을 DNase 분말( 재료 표 참조)에 첨가하여 최종 DNase 농도 3mg/mL를 얻습니다. 용액이 완전히 혼합되었는지 확인하십시오.
주의 : DNase는 호흡기 감작 위험입니다. 분말/물질을 흡입하지 마십시오. - 소량(예: 1mL)을 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다.
- 사용할 때까지 -20°C에서 부분 표본을 동결합니다.
2. 해부 영역 설정
- 멸균 해부 기구 및 세포 배양 장비를 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다: 수술용 드레이프, 페트리 접시, 세포 여과기, 웰 플레이트, 거즈, 핀셋, 메스 손잡이, 메스 칼날 및 홍채 가위( 재료 표 참조).
- 핀셋을 사용하여 수술용 드레이프를 배치합니다. 수술용 드레이프 위에 6웰 플레이트 하나를 놓고 뚜껑을 제거합니다.
- 멸균 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 부분 표본을 얼음 위에 놓고 생물 안전 캐비닛에 넣습니다.
- 6웰 플레이트의 웰 하나를 반쯤 채운 것(약 6mL)에 10% 포비돈-요오드 용액을 채웁니다.
- 나머지 우물을 식힌 DPBS로 채웁니다.
- 페트리 접시 중 하나에서 뚜껑을 제거하고 수술용 드레이프 위에 거꾸로 놓습니다. 페트리 접시 받침대를 쓰레기통으로 따로 보관하십시오.
- 세포 배양 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), 10% FBS(Fetal Bovine Serum), 1% 항생제/항진균제)의 부분 표본과 0.25% 트립신/EDTA의 부분 표본을 37°C 수조에 넣습니다.
- 냉동실에서 DNase 원액을 꺼냅니다(자세한 내용은 프로토콜의 나머지 부분 참조).
3. 외부 조직 제거
알림: 외부 조직 제거는 생물 안전 캐비닛 외부에서 수행할 수 있습니다. 절개하기 전에 눈을 검사하여 공막에 구멍이 뚫리지 않았는지, 동공에 안개가 끼지 않았는지, 시신경이 있는지 확인하십시오. 이 기준을 충족하지 않는 눈은 버리십시오.
- 한 손으로 눈에 붙은 근육을 잡고 다른 손으로 메스로 공막 주위의 조직을 부드럽게 잘라냅니다. 눈을 짓누르거나 실수로 공막을 자르지 않도록 주의하십시오. 공막이 뚫려 검은 내부가 노출되면 눈을 버리십시오.
주의 : 우발적인 절단으로부터 보호하기 위해 근육을 잡고 있는 손에는 절단 방지 장갑을 사용하는 것이 좋습니다. - 구부러진 홍채 가위로 시신경을 3mm 이하의 길이로 자릅니다. 시신경이 너무 길면 나중에 안구가 세포 여과기에 제대로 안착되지 않습니다.
- 각막을 아래로 향하게 하여 눈을 얼음 위에 놓습니다.
- 각 눈에서 외부 조직이 제거될 때까지 3.1-3.3단계를 반복합니다.
4. 눈 해부
- 핀셋을 사용하여 눈을 생물 안전 캐비닛과 10% 포비돈-요오드 용액이 포함된 웰로 옮기고 눈을 회전시켜 요오드 용액에 완전히 코팅되도록 합니다. 도구를 가능한 한 멸균 상태로 유지하려면 이 핀셋을 눈 외부를 만질 때만 사용해야 합니다.
- 눈이 요오드 용액에 있는 동안 이전에 준비한 페트리 접시의 얕고 거꾸로 된 뚜껑에 멸균 거즈를 놓습니다. 별도의 페트리 접시에 셀 스트레이너를 놓습니다. 세포 분리용이 아닌 안구를 지지할 때만 세포 여과기를 사용하십시오.
- 눈을 요오드 용액에 약 30초 동안 담근 후 DPBS가 포함된 우물에 각각 약 5초 동안 담가 눈을 씻고 우물에서 우물로 이동하여 요오드 용액을 점진적으로 희석하고 눈을 멸균 거즈로 옮깁니다.
- 오라 세라타 아래 또는 홍채 가장자리에서 지구의 약 1/3 아래로 메스를 사용하여 작게 절개합니다.
- 절개 후 홍채 가위를 사용하여 각막과 평행하게 구체 둘레를 따라 고르게 자릅니다. 눈을 조작할 때는 핀셋을 사용하여 눈 바깥쪽을 만지거나 거즈만 사용하여 멸균 상태를 유지하십시오.
- 핀셋을 사용하여 시신경을 잡고 거즈에서 지구본을 부드럽게 들어 올립니다. 유리체는 지구에서 떨어져야 합니다. 필요한 경우 눈을 부드럽게 흔들어 유리체를 제거합니다.
알림: 유리체를 제거하기가 매우 어려운 경우 지구본에서 더 낮게 절단해 보십시오. - 아이컵의 내부가 위를 향하도록 하여 아이컵을 준비된 세포 여과기에 부드럽게 놓습니다. 울퉁불퉁한 경우 핀셋을 사용하여 아이컵을 조정하여 절개 부위가 최대한 수평이 되도록 합니다.
- 냉각된 DPBS를 아이컵에 부드럽게 추가하여 체액 레벨이 절개 부위의 가장 낮은 지점 바로 아래에 오도록 합니다. 이 DPBS는 신경 망막 제거 후 제거됩니다.
참고: 추가되는 DPBS의 양은 눈 크기와 절개 위치에 따라 달라집니다. - 모든 눈이 절개될 때까지 4.1-4.8단계를 반복합니다.
5. 신경 망막 제거 및 RPE 해리
참고: 다음 섹션은 단계별로 수행하는 것이 더 쉽습니다. 이 설정에서 이 프로세스는 한 번에 하나의 배치(일반적으로 3개의 아이컵)에서 수행됩니다. 5.1-5.7단계의 경우 다음 단계로 이동하기 전에 전체 배치에서 각 단계를 수행해야 합니다.
- 손전등 아래에서 신경 망막(흰색/분홍색)이 RPE(검은색)에서 분리되기 시작하는 영역을 찾습니다. 그런 다음 뭉툭한 핀셋을 사용하여 들어 올린 신경 망막을 부드럽게 잡고 벗겨냅니다.
알림: 신경 망막이 분리되는 부분이 없으면 핀셋을 사용하여 안구 컵 상단 근처를 부드럽게 잡습니다. 이 방법을 사용하면 RPE/맥락막에 손상이 가해지면 RPE 수집 중에 해당 세포가 해리되지 않습니다. - 시신경 디스크 근처의 신경 망막을 부드럽게 수집합니다.
- 진공 흡인 시스템에 부착된 파스퇴르 피펫을 사용하여 신경 망막을 흡인합니다. 제거 과정에 도움이 되도록 열망을 깃털로 만드는 것이 좋습니다.
알림: 흡입을 줄이기 위해 파스퇴르 피펫 끝에 피펫 팁을 놓을 수 있습니다. - 흡인된 DPBS를 교체하기 위해 냉각된 DPBS를 조심스럽게 추가합니다.
- 한 번 더 흡인하여 남아 있는 신경 망막을 제거합니다. 이번에는 노출된 RPE를 방해하지 않으면서 가능한 한 많은 DPBS를 제거합니다.
- 트립신을 아이컵에 부드럽게 첨가합니다. 오염을 줄이기 위해 절개선과 손상된 RPE 부분보다 부피 수준을 낮게 유지하십시오.
주의: 트립신은 접촉 시 피부와 눈에 자극을 유발하는 효소입니다. 적절한 PPE를 착용하십시오. - 트립신을 각 눈에 첨가한 후 페트리 접시 뚜껑을 교체했는지 확인하십시오. 다음으로, 페트리 접시를 37 ° C 및 5 % CO2 의 가습 인큐베이터로 30 분 동안 옮깁니다.
- 모든 아이컵이 처리될 때까지 각 배치에 대해 5.1-5.7단계를 반복합니다.
6. RPE 수집
- 각 눈 배치(2-3개의 눈)에서 RPE 세포를 수집하고 단일 15mL 원심분리 튜브에 넣어 파종 과정을 간단하게 만듭니다.
- 손전등 아래에서 1000μL 피펫을 사용하여 RPE 세포를 제거하기 위해 부드럽게 삼중 처리합니다. RPE 세포가 분리되지 않으면 신선한 트립신을 추가하고 추가로 10-15분 동안 배양합니다. 망막이 긁히지 않도록 주의하십시오.
- 15mL 원심분리 튜브에서 RPE 세포를 수집합니다.
- 세포 배양 배지로 아이컵을 세척하여 남아 있는 세포를 수집하고 트립신을 중화합니다. 15mL 원심분리 튜브에 트립신에 대한 배지 부피가 최소 두 배 이상 있는지 확인합니다.
- 모든 아이컵에서 RPE 세포가 수집될 때까지 6.1단계를 반복합니다.
- 실온에서 250 x g 에서 5분 동안 셀 현탁액을 원심분리합니다.
7. DNase 작업 솔루션 준비
- 최종 농도 100μg/mL 및 세포 튜브당 최종 부피 3mL를 위해 세포 배양 배지에 추가하는 데 필요한 3mg/mL DNase 원액(1단계에서 준비)의 부피를 계산합니다(즉, 세포 원심분리기 튜브 3개의 경우 100μg/mL DNase 용액 9mL가 필요함).
- 적절한 용량의 DNase 원액과 세포 배양 배지를 결합합니다. 작업 용액에서 DNase를 사용하면 세포 응집을 방지하고 세포를 고르게 파종할 수 있습니다.
8. RPE 세포 파종
- 6.3 단계에서 원심분리한 후 각 15mL 원심분리 튜브에서 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의합니다.
- 각 세포 펠릿을 3mL의 DNase 작업 용액에 재현탁시킵니다.
- 재현탁 세포가 들어 있는 15mL 원심분리 튜브를 37°C 및 5%CO2 의 가습 인큐베이터에 15분 동안 넣습니다.
- 배양 후 세포 현탁액을 실온에서 150 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 상층액을 제거합니다.
- 각 세포 펠릿을 3mL의 신선한 세포 배양 배지에 재현탁시킵니다.
- 2-3개의 눈 분량의 RPE 세포가 들어 있는 각 원심분리기 튜브에 대해 6웰 플레이트(통로 0)의 웰 하나를 시드합니다.
- 조심스럽게 파종된 6웰 플레이트를 37°C 및 5%CO2의 가습 인큐베이터로 옮깁니다.
9. 1차 돼지 RPE 세포 배양
- 플레이트를 이동하기 전에 새로 파종된 RPE 셀이 48-72시간 동안 부착되도록 합니다. 첫 번째 배지 교체 중에 신선한 세포 배양 배지로 세척하여 과도한 세포 파편을 제거할 수 있습니다.
- 48시간마다 세포 배양 배지를 교체합니다.
- 세포가 밀도에 도달하면 FBS 농도가 2%인 세포 배양 배지로 전환하고 실험할 때까지 유지합니다.
10. RPE 셀 검증
- 면역세포화학(ICC) 염색
- 실온에서 10분 동안 DPBS의 4% 포름알데히드에 세포를 고정합니다.
- DPBS로 두 번 씻으십시오.
- 실온에서 10분 동안 DPBS에서 0.2% Triton-X 100을 사용하여 세포를 투과시킵니다(필요한 경우).
- DPBS로 두 번 씻으십시오.
- 실온에서 1시간 동안 DPBS에 3%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)의 차단 용액을 적용합니다.
- 1:100 희석(또는 권장 제조업체 농도)으로 1차 항체를 추가하고( 재료 표 참조) 실온에서 1시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 그대로 둡니다.
- DPBS로 각각 5분씩 3회 세척합니다.
- 2 μg/mL (또는 권장 제조업체 농도)에서 2차 항체(필요한 경우)를 추가하고( 재료 표 참조) 실온에서 1시간 동안 그대로 두십시오.
- 2차 항체가 도포된 경우 DPBS로 각각 5분씩 3회 세척합니다.
- 제조업체의 농도로 핵 염색 프로브를 추가하고( 재료 표 참조) 실온에서 25분 동안 그대로 두십시오.
- PBS로 각각 5분씩 세 번 씻습니다.
- 세포 배양 삽입물에 있는 경우 Rickabaugh 및 Weatherston et al.20에 설명된 대로 장착 배지를 사용하여 커버슬립으로 현미경 슬라이드에 장착합니다. 그렇지 않으면 DPBS의 이미지 셀입니다.
- 주사전자현미경(SEM)
- Harris et al.21에서 설명한 절차를 따릅니다.
- 트랜스 상피 전기 저항(TEER)
- 기저 챔버15에서 1mL의 배양 배지를 사용하여 TEER 측정에 대한 제조업체의 프로토콜(재료 표 참조)을 따릅니다.
- 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)
- 제조업체의 프로토콜에 따라 다중 인간 효소 결합 면역 흡착 분석 키트를 사용하여 ELISA15 를 수행합니다( 재료 표 참조).
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Representative Results
이 절차를 사용하여 일차 RPE 세포를 돼지 눈에서 성공적으로 분리했습니다. 그림 1A 는 특징적인 색소 침착이 있는 분리 3일 후 RPE 세포를 보여줍니다. 1주일 성장 후 세포가 완전히 합쳐져 건강한 단층을 형성했습니다(그림 1B). 그런 다음 세포를 세포 배양 삽입물로 옮겨 색소 침착 및 형태를 유지하여(그림 1C) 분리 절차의 효능을 더욱 뒷받침했습니다. 이러한 특성을 나타내지 않고 대신 변이체 형태 및 과도한 색소 침착을 보인 배양물(그림 1D)은 세포 오염이 의심되어 실험에 사용되지 않았습니다. 이 원고에서 분리된 RPE 세포는 RPE 세포에서 고도로 발현되는 단백질인 RPE65를 발현합니다(그림 2). RPE65 발현이 더 낮게 나타나는 영역은 색소 침착이 형광을 차단하기 때문일 가능성이 높으며, 해당 영역은 색소가 더 많이 함유된 세포에 해당하기 때문입니다(그림 2A). 분리된 RPE 세포에 의해 발현된 또 다른 특징적인 단백질은 VEGF였다. 10일 후, VEGF는 2141.2 ±± 53.5pg/mL 농도의 정점 측과 비교하여 2612.5 28.0pg/mL의 농도로 RPE 단층의 기저 측에서 더 많이 발현되었습니다(그림 3). 일차 돼지 RPE 세포는 또한 미세융모 및 조약돌 형태를 가지고 있습니다(그림 4). 또한 세포 배양 삽입물에서 성장한 경우 TEER 판독값은 7일 후 166.1 ± 75.9 Ω∙cm2 에서 14일 후 363.4 ± 9.0 Ω∙cm2 로 증가했으며(그림 5), 이는 시간이 지남에 따라 일관되고 건강한 단단한 접합 형성을 나타냅니다22. 접합 형성을 추가로 조사하기 위해 RPE 세포의 ZO-1 발현을 분석했으며, 이는 세포 경계에 국한되어 건강한 접합 형성 및 단층 무결성을 의미합니다(그림 6).
그림 1: 웰 플레이트에 파종하고 하위 배양한 후의 1차 RPE. 분리 후 3일 후(A), 분리 7일 후 완전히 합류한 단층(B), 배양 삽입물에 성공적으로 통과한 RPE(C) 및 RPE 배양물(D)의 잠재적인 세포 오염 영역(화살표). 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 돼지 RPE 세포에서 RPE65 발현을 보여주는 면역세포화학적 이미지. 파종 후 15일 동안 세포의 명시야(A), RPE65(B), 핵(C) 및 병합(D) 이미지. 명시야 이미지의 거친 배경은 다공성 배양 삽입 멤브레인입니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: RPE 단층의 정점 및 기저 부에서의 VEGF 발현. VEGF 농도는 배양 삽입물에서 세포 성장 10일 후에 수행된 ELISA에 의해 결정되었다. 오차 막대는 n = 2인 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 1차 돼지 RPE 세포의 주사전자현미경(SEM) 이미지. 이미징 전에 세포를 30일 동안 성장시켰습니다. 눈금 막대 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 세포 배양 삽입물에서 배양된 RPE 세포에서 수행된 TEER 판독값. 7일, 10일, 14일 성장한 후의 저항 값. 오차 막대는 n = 3인 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 돼지 RPE 세포에서 ZO-1 발현을 보여주는 면역세포화학적 이미지. 유리 바닥 웰 플레이트에 파종 후 6일 동안 세포의 명시야(A) ZO-1(B), 핵(C) 및 병합(D) 이미지. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 돼지 눈에서 RPE 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 색소 침착 및 조약돌 형태는 분리 후 7일 이내에 관찰됩니다(그림 1B). 더욱이, TEER 데이터는 단단한 접합 형성(22 )과 건강한 단층을 나타낸다(그림 5). 이러한 결과는 이 방법으로 분리한 RPE 세포가 인간 RPE와 유사하며 망막 세포 배양 모델에 도움이 될 수 있음을 보여줍니다.
이 원고에 사용된 눈은 지역 정육점에서 사후 입수한 것이지만, 돼지 제품을 사용하는 공동 연구자들과의 학술 환경과 같은 다른 출처에서도 얻을 수 있습니다. 동물이 죽은 후 가능한 한 빨리 시술을 시작하고 시술 전에 눈을 시원하게 유지하는 것이 중요합니다. 격리하는 동안 트립신화 후 트리터링될 때까지 RPE를 방해하지 않는 것이 중요합니다. 신경 망막을 박리할 때 이러한 관리가 가장 중요한데, 주의가 부족하면 핀셋으로 Bruch's membrane1 을 잡고 다른 유형의 세포를 용액에 주입할 수 있기 때문입니다.
이 절차는 우리의 조건에 최적화되어 있지만 방법론을 일부 변경할 수 있습니다. 예를 들어, 특정 파종 밀도가 필요한 경우 DNase 배양 후 세포를 계수할 수 있습니다. 또한 진공 흡인이 작동하지 않는 경우 작고 구부러진 가위로 조심스럽게 다듬어 신경 망막을 제거할 수 있습니다. 실험을 위해 파종할 때 2.5 x 105 cells/cm2 와 같은 높은 파종 밀도를 사용하여 과도한 세포 분열을 방지할 수 있습니다. 또한, 반복적인 패시징은 세포가 본래의 표현형을 잃기 시작할 수 있으므로 권장되지 않습니다. 이 연구는 실험을 위해 통로 1 세포를 사용했지만 RPE 표현형과 특성이 유지되면 잠재적으로 추가 통로를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 원하는 경우 2% 대신 1% FBS 농도를 하위 배양 또는 실험에 사용할 수 있습니다.
이 방법에는 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 동물의 나이, 성별, 품종 및 사망 시간을 복제하거나 얻기가 어려우며, 이는 일차 세포 분리에서 흔히 발생하는 문제입니다. 둘째, 과잉 트립신화는 비정상적인 세포를 빠르게 초래할 수 있으며, 이는 Fietz et al17에서도 지적되었습니다. 그러나 궁극적으로 이 방법은 1차 RPE 셀을 얻는 저렴하고 효율적인 방법을 제공합니다. 이러한 세포는 iPSC처럼 긴 분화 시간이 필요하지 않습니다. 이 돼지 RPE는 또한 선천적으로 미세 융모 및 색소 침착15,16과 같은 주요 구조를 가지고 있으며, 이는 분화되지 않은 RPE와 다릅니다. 따라서 이 세포는 망막 연구를 위한 보다 대표적인 세포 유형을 제공합니다. 마지막으로, 이 방법은 시력과 질병을 이해하기 위해 인간 모델과 유사한 망막 모델을 생성하기 위해 인간 기증자의 눈에 접근할 수 없는 더 많은 농촌 지역이나 기관에 매우 유용할 수 있습니다.
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Disclosures
없음.
Acknowledgments
저자는 돼지 RPE 세포 배양 및 분리에 도움을 준 Farhad Farjood와 SEM에 도움을 준 Thomas Harris에게 감사의 뜻을 전합니다. 저자들은 SEM 분석을 위해 유타 주립 대학의 현미경 핵심 시설(Microscopy Core Facility)의 지원을 인정합니다. 이 시설은 미국 국립과학재단(National Science Foundation) 주요 연구 기기 보조금(CMMI-1337932)을 통해 획득한 주사 전자 현미경을 보유하고 있습니다. 이 연구에 대한 자금은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에서 보조금 1R15EY028732(Vargis)와 BrightFocus Foundation 보조금 M2019109(Vargis)을 통해 제공되었습니다. 추가 기금은 유타 주립 대학교 연구실의 학부 연구 및 창의적 기회 보조금(Weatherston)과 유타 주립 대학교 알츠하이머병 및 치매 연구 센터의 종자 보조금(Vargis)으로 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified - calcium - magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
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