Summary
Fissionsjäst används här som en heterolog värd för att uttrycka bakteriella cytoskelettproteiner såsom FtsZ och MreB som translationella fusionsproteiner med GFP för att visualisera deras polymerisation. Föreningar som påverkar polymerisationen identifieras också genom avbildning med hjälp av ett fluorescensmikroskop.
Abstract
Bakteriella cytoskelettproteiner som FtsZ och MreB utför viktiga funktioner som celldelning och underhåll av cellform. Vidare har FtsZ och MreB dykt upp som viktiga mål för nya antimikrobiella upptäckter. Flera analyser har utvecklats för att identifiera föreningar som riktar sig mot nukleotidbindning och polymerisation av dessa cytoskelettproteiner, främst med fokus på FtsZ. Dessutom är många av analyserna antingen mödosamma eller kostnadskrävande, och att fastställa om dessa proteiner är det cellulära målet för läkemedlet kräver ofta flera metoder. Slutligen utgör läkemedlens toxicitet för eukaryota celler också ett problem. Här beskriver vi en cellbaserad analys i ett steg för att upptäcka nya molekyler som riktar sig mot bakteriella cytoskelett och minimera träffar som kan vara potentiellt giftiga för eukaryota celler. Fissionsjäst är mottaglig för skärmar med hög genomströmning baserade på mikroskopi, och en visuell skärm kan enkelt identifiera vilken molekyl som helst som förändrar polymerisationen av FtsZ eller MreB. Vår analys använder standardplattan med 96 brunnar och förlitar sig på förmågan hos de bakteriella cytoskelettproteinerna att polymerisera i en eukaryot cell såsom fissionsjästen. Medan protokollen som beskrivs här är för fissionsjäst och använder FtsZ från Staphylococcus aureus och MreB från Escherichia coli, är de lätta att anpassa till andra bakteriella cytoskelettproteiner som lätt samlas till polymerer i alla eukaryota uttrycksvärdar. Metoden som beskrivs här bör bidra till att underlätta ytterligare upptäckt av nya antimikrobiella medel som riktar sig mot bakteriella cytoskelettproteiner.
Introduction
Den utbredda resistensen mot nästan alla antibiotika som för närvarande används för att bekämpa bakteriella infektioner har skapat ett omedelbart behov av nya kategorier av antibiotika. En rapport från 2019 visade att antibiotikaresistenta infektioner ledde till att 1,27 miljoner liv gick förlorade, vilket bidrog till en total siffra på 4,95 miljoner dödsfall när man tar hänsyn till komplikationer från resistenta bakterieinfektioner1. Även om den nuvarande arsenalen av antibiotika fortfarande är effektiv i klinisk praxis, riktar den sig främst mot ett smalt spektrum av cellulära processer, främst med fokus på cellvägg, DNA och proteinsyntes. Under det senaste halvseklet har färre än 30 proteiner utnyttjats kommersiellt som mål för utveckling av nya antibakteriella medel 2,3. Detta begränsade utbud av livskraftiga måltavlor skapar betydande hinder för att upptäcka nya antibiotika eller deras derivat för att bekämpa antibiotikaresistenta bakterier. För att komma till rätta med det framväxande problemet med antibiotikaresistens finns det därför ett behov av att utveckla nya antibiotika med nya mål och verkningsmekanismer.
Ett antibakteriellt mål bör helst vara en viktig komponent i bakteriecellernas tillväxt, bevaras i hela den fylogenetiskt olika arten, uppvisa minst eukaryot homologi och vara tillgängligt för antibiotika4. Sedan upptäckten av bakteriella cytoskelettproteiner som är involverade i celldelning och upprätthållande av cellform har de framstått som en lovande fokuspunkt för utveckling av antibakteriella föreningar5. Dessa proteiner är viktiga för bakteriell livskraft och spelar en avgörande roll för att upprätthålla cellform (MreB, CreS), delning (FtsZ, FtsA) och DNA-segregering (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), liknande cytoskelettet i eukaryota celler. Noterbart är att FtsZ uppvisar en anmärkningsvärt hög bevarandenivå över ett brett spektrum av prokaryota organismer, medan MreB finns i nästan alla stavformade bakterier. En sådan bred distribution och relevans för cellviabilitet gör dessa proteiner till ett fascinerande mål inom antibiotikaforskning 5,6,7.
Det är avgörande att anta ett mångsidigt tillvägagångssätt som kombinerar in vivo-observationer, in vitro-interaktioner och enzymatiska experiment för att grundligt validera bakteriella cytoskelettproteiner som det primära målet för en potentiell hämmare7. Mödosamma procedurer eller betydande kostnadskonsekvenser belastar många tillgängliga analyser för detta ändamål. Dessa är anmärkningsvärda hinder för deras utbredda användning i screening av ledande föreningar som kan påverka det bakteriella cytoskelettet. Bland dessa sticker mikroskopi ut som en exceptionellt effektiv och snabb metod för att bedöma effektiviteten hos föreningar genom att direkt undersöka förändringar i cellmorfologi. Men den hetero-associationen av målprotein med andra cytoskelettkomplex, indirekta effekter på grund av off-target-bindning och förändringar i membranpotential, svårigheter att penetrera cellen effektivt och närvaron av effluxpumpar, särskilt i gramnegativa bakterier, gör det kollektivt komplicerat att fastställa den exakta orsaken till bakteriell celldeformation 8,9,10.
Schizosaccharomyces pombe, eller fissionsjäst som den är allmänt känd, är en stavformad encellig eukaryot organism. Fissionsjäst används i stor utsträckning som en modellorganism inom cellulär och molekylärbiologi på grund av det extraordinära bevarandet i cellulära processer såsom cellcykeln och delningen, cellulär organisation och kromosomreplikation med högre eukaryoter, inklusive människor11,12. Dessutom uttryckte Errington och kollegor ett pollokaliserat bakteriellt cytoskelettprotein DivIVA i fissionsjäst för att visa att DivIVA ackumulerades på negativt krökta ytor13. Återigen hade Balasubramanian och hans grupp först etablerat fissionsjäst som ett cellulärt modellsystem för att ge nya insikter om mekanismen, sammansättningen och dynamiken hos E. coli-aktincytoskelettproteinet som MreB14 och tubulinhomolog FtsZ15. De visar också förmågan hos A22 att effektivt hindra polymerisationen av MreB genom epifluorescensmikroskopi när den uttrycks i jäst14. Efter detta har andra grupper också framgångsrikt använt fissionsjäst för att studera sammansättningsegenskaperna hos kloroplastproteinerna FtsZ1 och FtsZ216. På senare tid har vi etablerat ett proof-of-concept för genomförbarheten av användningen av fissionsjäst som en cellulär plattform för att specifikt screena för bakteriella cytoskeletthämmare genom att genomföra en omfattande bedömning av effekten av tre kända FtsZ-hämmare - sanguinarin, berberin och PC190723-on FtsZ-proteiner som härrör från två patogena bakterier, nämligen Staphylococcus aureus och Helicobacter pylori17. Dessutom visar sig denna enstegs cellbaserade analys vara avgörande för att minimera risken för att identifiera föreningar som kan vara potentiellt giftiga för eukaryota celler.
I denna rapport, med hjälp av fissionsjästsystemet, föreslår vi ett systematiskt arbetsflöde med hjälp av standardplattan med 96 brunnar för halvautomatisk screening och kvantifiering av effekten av småmolekylära hämmare riktade mot FtsZ från Staphylococcus aureus och MreB från Escherichia coli. Här sätter vi upp och optimerar det halvautomatiska arbetsflödet med hjälp av de etablerade hämmarna PC190723 och A22 som specifikt riktar sig mot FtsZ respektive MreB. Detta arbetsflöde använder ett epifluorescensmikroskop utrustat med ett motoriserat högprecisionssteg och automatiserad bildinsamling i en standard 96-brunnars platta för att förbättra den nuvarande standardiseringen. Därför kan den tillämpas på skärmar med medelhög och hög genomströmning av syntetiska kemiska bibliotek och kringgår några av de utmaningar som anges ovan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Uttryck av GFP-märkta bakteriella cytoskelettproteiner i S. pombe
OBS: Se Tabell 1 för information om alla plasmider och stammar som används här. Se tabell 2 för alla mediesammansättningar.
- Utför kloning av E. coli MreB med en N-terminal GFP-fusion (GFP-MreB) och S. aureus FtsZ som bär en C-terminal GFP (SaFtsZ-GFP) in i S. pombe-expressionsvektorn, pREP42 med en medelstark tiamin-repressibel promotor, nmt4118,19 som tidigare beskrivits14,15. Upprätthåll, amplifiera och isolera plasmiderna från E. coli-stammar (DH10β) enligt beskrivningen i20,21.
OBS: Andra E. coli-stammar som DH5α, XL1Blue, TOP10 etc. eller andra kommersiellt tillgängliga kompetenta celler som rutinmässigt används för molekylär kloning kan också användas. - Omvandling av plasmiderna pREP42-GFP-EcMreB och pREP42-SaFtsZ-GFP till S. pombe
- Transformera plasmiderna pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) och pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) till S. pombe-stam (h-leu1-32 ura4-D18) med hjälp av litiumacetatmetoden22, som nämns i stegen nedan.
- Dag 1 - Primär odling: Inokulera en slinga av nystrimmig S. pombe-kultur i 3 ml autoklaverat jästextrakt och kosttillskott (YES) buljong. Inkubera den i en orbital shaker vid 30 °C över natten (O/N).
- Dag 2:
- Sekundär odling: Tillsätt ca 500 μl primärkultur till 30 ml autoklaverad YES-buljong. Inkubera vid 30 °C i 3-4 timmar med omskakning tills OD600 når 0,4 - 0,6.
OBS: För varje omvandling används 30 ml. - Pelletera 30 ml kulturen vid 2 500 x g i 6-8 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och tvätta cellerna med 50 ml sterilt destillerat vatten (D/W). Pellet ner igen och kassera supernatant. Återsuspendera cellerna i 1 ml steril D/W och överför den till ett 2 ml centrifugrör. Centrifugera enligt ovan och kassera supernatant.
- Tillsätt 1 ml 0,1 M litiumacetat, Tris-EDTA (LiAc-TE) lösning och centrifugera enligt ovan. Kassera supernatanten och suspendera den på nytt i 1 ml 0,1 M LiAc-TE. Centrifugera och kassera supernatanten och lämna kvar 100 μL lösning.
- Tillsätt 10 - 20 μg bärar-DNA (laxspermie-DNA; denaturerat och blixtkylt på is) och 2 - 3 μg av plasmid-DNA, som behöver omvandlas. Blanda försiktigt. Inkubera i rumstemperatur i 10 min.
- Tillsätt 260 μl 40 % PEG/LiAc-TE. Blanda försiktigt. Inkubera i 60 minuter i shakern eller en termomixer vid 30 °C med skonsam blandning. Tillsätt 43 μl DMSO. Blanda försiktigt.
- Värmechock vid 42 °C i 10 min i termomixern. Pellet på 2 500 x g i 6-8 minuter och kassera supernatant. Tvätta pelleten 1x med 1 ml steril D/W.
- Pellet, kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 μL steril D/W. Platta 100 μL på Edinburgh minimal medium (EMM) plattor som innehåller 5 μg/ml tiamin (för att undertrycka nmt41-promotorn ) och aminosyratillskotten adenin (0,225 mg/ml), histidin (0,225 mg/ml) och leucin (0,225 mg/ml) men saknar uracil (selektionsmarkör för pREP42-plasmid).
OBS: Växelvis platta 70 μL och 130 μL i två olika plattor. Två olika volymer (70 μL och 130 μL) pläteras för att erhålla isolerade kolonier på minst en av plattorna beroende på omvandlingseffektiviteten, som kan variera från experiment till experiment. - Inkubera plattorna vid 30 °C i 2-3 dagar tills kolonier uppstår. Blanda ett enda samhälle med 100 μL steril D/W och sprid ut på en ny EMM-platta som innehåller tiamin men saknar uracil enligt beskrivningen ovan.
- Inkubera vid 30 °C i 2-3 dagar tills en komplett gräsmatta dyker upp. Skrota den odlade gräsmattan från celler med hjälp av en inokuleringsslinga och återsuspendera den till 1 ml YES-media som innehåller 30 % glycerol i en kryoflaska.
- Snabbfrys kryoflaskan i flytande kväve och förvara vid -80 °C för att bevara de frysta jästlagren.
- Sekundär odling: Tillsätt ca 500 μl primärkultur till 30 ml autoklaverad YES-buljong. Inkubera vid 30 °C i 3-4 timmar med omskakning tills OD600 når 0,4 - 0,6.
- Uttryck av bakteriella cytoskelettproteiner i fissionsjäst
- Stryk aseptiskt ett plåster från glycerolstammen på en ny jästspecifik platta för att få tillräckligt med kultur för ytterligare experiment.
OBS: I fallet med pREP42 använde vi en EMM-agarplatta (minimalt media) som innehöll adenin, histidin och leucin (som vid användning av S. pombe-stam (h-leu1-32 ura4-D18)) utan uracil (uracil som finns i pREP42 som en selektionsmarkör). Vi tillsätter 15 - 20 μM tiamin till agarplattorna (eftersom pREP42 har tiaminrepressibel nmt41-promotor ) för att undertrycka uttrycket av genen av intresse när den växer på plattan. - Inokulera en liten ögla av inokulatet från den strimmiga fläcken i 5 ml jästspecifikt EMM-medium som saknar tiamin och inkubera det i 10–12 timmar vid 30 °C.
OBS: Uttrycket av FtsZ och MreB från olika arter under nmt41-promotorn i S. pombe kan variera, vanligtvis från 16 till 30 timmar. Den optimala tiden för proteinuttryck av GFP-EcMreB och SaFtsZ-GFP i S. pombe är 20-24 timmar respektive 16-20 timmar vid 30 °C, utan tiamin.
- Stryk aseptiskt ett plåster från glycerolstammen på en ny jästspecifik platta för att få tillräckligt med kultur för ytterligare experiment.
2. Behandling av S. pombe-kulturer som uttrycker GFP-märkta bakteriella cytoskelettproteiner
OBS: Ett antal olika läkemedelsmolekyler testas på den jästkultur som odlats över natten i en platta med 96 brunnar.
- Inokulera en färsk kultur genom att överföra 50 μL av nattkulturen till varje brunn på en 96-hålsplatta som innehåller 150 μL färsk jäst EMM-media med hjälp av det halvautomatiska flerkanaliga pipetteringsinstrumentet med 96 brunnar.
- Medan du pipetterar in och ut för korrekt blandning med hjälp av en halvautomatisk flerkanalspipett med 96 brunnar, introducerar du långsamt olika ökande koncentrationer av läkemedel i den växande kulturen, var och en gjord i tre exemplar som visas i schemat i figur 1.
- Som en positiv kontroll, använd de redan kända läkemedlen, PC190723 för (S. aureus FtsZ) och A22 (för E. coli MreB) i duplikat.
OBS: Som tidigare rapporterats användes PC190723 och A22 i koncentrationerna 56,2 μM17 respektive 72,6 μM 14,17. Samtidigt fungerade A22-behandling av SaFtsZ respektive PC190723 behandling av EcMreB som negativa kontroller. - Använd DMSO som lösningsmedelskontroll vid tre olika koncentrationer beroende på de lägsta och högsta koncentrationerna av läkemedel.
OBS: Lösningsmedlet som läkemedlen löses upp i används som lösningsmedelskontroll. - Inkubera kontroll- och behandlingskulturerna vid 30 °C i 6-10 timmar (tills cellerna visar uttrycket av bakteriefluorescerande proteiner) och avbilda sedan med epifluorescensmikroskopi.
3. Visualisering av polymererna
- Applicera en beläggning på 20 μl av 1 mg/ml konanavalin A på varje brunn på den optiskt transparenta bottenplattan med 96 brunnar (svartväggig för fluorescensavbildning) och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur. Aspirera vätska och låt den lufttorka i 10 min.
- Överför 20 μL celler från odlingsplattan till respektive brunn och låt stå i 10 min. Tvätta cellen 3-4 gånger med det sterila EMM-mediet.
- Med objektivlinsen som ska användas på plats (se steg 3.6), använd navigatorläget i insamlingspanelen i bildinsamlingsprogramvaran för 96-håls plattjustering och brunnstäckning. Rikta in väl kanterna på navigatorn.
- Välj sedan parametrarna för brunnens täckning, som inkluderar ett val av flera positioner för det intressanta området i brunnen, och använd adaptiv autofokuskontroll med on-demand-läge för att hålla provet i fokus under avbildningen.
- Ta bilder med hjälp av differentiell interferenskontrast (DIC) och fluorescens. Ställ in excitations- och emissionsfilter på 475/28 nm respektive 525/48 nm för att avbilda de GFP-märkta bakterieproteinerna som uttrycks i jäst. Erhåll Z-stackar med en stegstorlek på 0,2 μm genom tjockleken på jästcellerna (5 μm).
- Ta bilder med ett inverterat epifluorescensmikroskop utrustat med ett 100x, 1,4-NA oljeimmersionsobjektiv och en 2 000 x 2 000 sCMOS-kamera (6,5 μm x 6,5 μm pixelstorlek). Använd ett LED-belysningssystem för excitation av fluoroforen.
OBS: Alla epifluorescensmikroskopsystem som har ett motoriserat steg för en 96-håls platta med exakt flerpunktspositionering bör vara lämpliga. Samla in alla cellbilder av kontroll- och läkemedelsbehandlade med en liknande exponeringstid (vanligtvis i intervallet 0,3 - 0,5 s) vid en binning på 1 x 1 och belysning vid 15 % - 20 % för att minimera experimentvariablerna och bibehålla konsistens.
4. Kvantifiering av bilderna med hjälp av ImageJ
- Bearbeta cellbilder och mät antalet fläckar per cell och densitet för FtsZ17. När det gäller MreB, mät densitet och anisotropi23 och jämför mellan kontrollceller och behandlade celler med hjälp av Fiji (v2.0.0-rc-69/1.52p)24.
- Med hjälp av bilderna från DIC-kanalen skisserar du först de enskilda jästcellerna med hjälp av frihandsritverktyget och sparar dem som ett intresseområde (ROI) i ROI-hanteraren. Detta steg är ännu inte automatiserat, men nyligen utvecklade verktyg som använder maskininlärning25,26 kan försökas och införlivas inom en snar framtid.
- Maskera den yttre delen av cellen och fyll i svart enligt beskrivningen i27.
- Använd OPS-tröskeln IJ1 analysera makro, en inbyggd funktion i Fiji, för att räkna antalet punkter24.
- Använd otsu-metoden för automatisk tröskeldragning och maskera de segmenterade partiklarna. Kör plugin-programmet för att analysera partiklar med hjälp av ett makro.
- För att mäta polymerdensitet (mängden cytoskelett per ytenhet i en cell), bearbeta bilder enligt beskrivningen, inklusive maskerings- och skelettiseringssteg27,28. Använd Lpx 2Dfilter i lpx-plugin-programmet för att skelettera bilderna.
- Mer information finns i den här nya publikationen17. Utför EcMreB-polymerkvantifiering som tidigare nämnts i23, använd anisotropi för att kvantifiera rumslig organisation med hjälp av FibrilTool29 som beskrivits tidigare23.
OBS: Dessa analysmetoder kan användas för att kvantifiera alla andra bakteriella cytoskelettproteiner som behandlas eller inte behandlas av läkemedlen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uppsättning av plattan med 96 brunnar för screening av läkemedel
Användning av S. pombe för att uttrycka en C- terminalt GFP märkt S. aureus FtsZ från en vektor (pREP42) som innehåller den medelstarka tiaminrepressibla promotorn nmt41har tidigare fastställts17 och på liknande sätt uttrycktes E. coli MreB märkt med N-terminal GFP också i S. pombe14. Vi har också visat att PC190723, en specifik hämmare av SaFtsZ och A22, en MreB-hämmare, kan utöva sina effekter på respektive bakteriella cytoskelettproteiner på ett specifikt sätt när de uttrycks i jäst14,17.
Här föreslår vi att använda jästuttryckssystemet för att utveckla en screening med medelhög eller hög genomströmning av antibakteriella läkemedel som riktar sig mot de bakteriella cytoskelettproteinerna. Ett epifluorescensmikroskop med ett motoriserat steg kan automatiseras för att avbilda en 96-håls platta, och kommersiella läkemedelsbibliotek är också lätt tillgängliga i 96-håls plattformat. Vi föredrar därför att använda en platta med 96 brunnar för den föreslagna screeningen av läkemedel. Plattorna är inställda som visas i figur 1. Den första raden (figur 1A) består av SaFtsZ-GFP som uttrycker jästkultur. Den andra raden (figur 1B) består av jästkulturer som uttrycker GFP-EcMreB. De två första kolumnerna i de två första raderna (A1:B2) är tomma i media. De följande sex kolumnerna i de två första raderna (A3:B12) är inställda som DMSO-kontroll med tre olika koncentrationer beroende på läkemedelsutspädningarna i duplikat. Därefter tillsätts PC190723 (56,2 μM) och A22 (72,6 μM) till jästceller som uttrycker SaFtsZ-GFP eller GFP-EcMreB. PC190723 och A22 fungerar som positiva kontroller för FtsZ respektive MreB. Alla andra brunnar (C1:F12) används för att tillsätta olika läkemedel (i tre olika koncentrationer och i duplikat) som används i skärmen för att identifiera effektorer av de bakteriella cytoskelettproteinerna, SaFtsZ eller EcMreB. Jästkulturer som uttrycker GFP-märkta SaFtsZ eller MreB dispenseras i dessa 96-brunnars plattor och odlas tills effekterna av läkemedlen på sammansättningen av polymerer visualiseras.
Bedömning av tillväxteffekter på jästceller
Efter inkubation av de 96 brunnar som innehåller subodlade celler vid 30 °C i 6–10 timmar mäts jästkulturens optiska densitet (OD) med hjälp av en mikroplattläsare. Mätningen av OD hjälper till att bedöma eventuella tillväxthämmande effekter av läkemedlen mot de eukaryota jästcellerna och möjligen skadliga effekter på mänskliga celler. Således kan denna analys användas för att sålla bort flera läkemedel baserat på deras toxicitet i jästsystemet. Varken PC190723 eller A22 uppvisar dock några tillväxteffekter eller toxicitet för jästceller, och OD600 i de kulturer som uttrycker SaFtsZ-GFP behandlade med DMSO, PC190723 eller A22 var 0,38 ± 0,03, 0,44 ± 0,02 respektive 0,43 ± 0,06 (N ≥ 4). På samma sätt var OD600 för de kulturer som uttryckte GFP-EcMreB och behandlades med DMSO, PC190723 eller A22 0,38 ± 0,04, 0,44 ± 0,07 respektive 0,41 ± 0,08 (N ≥ 4).
Visualisering av effekten av läkemedlen på de polymera strukturer som satts samman av SaFtsZ och EcMreB uttryckt i S. pombe
För att bedöma effekten av läkemedlen på polymerisationen av SaFtsZ eller EcMreB, överförs en alikvot av jästcellerna från den ovan nämnda 96-brunnsplattan som innehåller läkemedel till en annan 96-hålsplatta med optiskt klar glasbotten 96-brunnar lämplig för fluorescensavbildning. Denna 96-hålsplatta är också belagd med concanavalin A för att möjliggöra vidhäftning av jästcellerna som uttrycker GFP-märkta SaFtsZ eller EcMreB. Plattan med 96 brunnar avbildas med hjälp av ett epifluorescensmikroskop som täcker alla plattans 96 brunnar vid de förutbestämda positionerna som styrs av programvaran för bildinsamling (figur 2). I kontrollbrunnarna (DMSO-behandlade) uppvisade jästceller som uttryckte SaFtsZ-GFP polymera strukturer i form av fläckar eller fläckar fördelade över cellerna, efter 16 - 18 timmars tillväxt i frånvaro av tiamin. Men 10-12 timmar efter tillväxt i avsaknad av tiamin uppvisade cellerna endast diffus fluorescens eller få fläckar, vilket tyder på att FtsZ-GFP-uttrycket inte hade nått den kritiska koncentration som krävs för polymerisation (Figur 3A). Tvärtom visade det stabiliserande läkemedlet FtsZ, PC190723, en betydande ökning av de polymera strukturerna (fläckar eller fläckar) av SaFtsZ-GFP jämfört med DMSO-kontroll efter 12 timmars tillväxt (Figur 3B), vilket fungerade som den positiva kontrollen. Däremot visade celler som behandlades med A22 ingen skillnad i de SaFtsZ-GFP-strukturer som monterats (Figur 3C). Till skillnad från kulturer som behandlats med PC190723 samlades SaFtsZ-GFP i fläckar i obehandlade kulturer endast när de inducerades under längre perioder, vilket visar att PC190723 verkade för att minska den kritiska polymerisationskoncentrationen av SaFtsZ (Figur 3D). På samma sätt bildade GFP-EcMreB uttryckt i S. pombe linjära matriser av långa filament längs den längsgående axeln av fissionsjäst (figur 4A). Även om PC190723 inte visade sig ha någon effekt på EcMreB-polymerisation (Figur 4B), resulterade behandling av celler med A22 i diffus fluorescens i hela cytoplasman hos jästcellerna (Figur 4C). Bilderna från resten av plattorna med 96 brunnar inspekteras visuellt med avseende på eventuella stabiliserande eller hämmande effekter av läkemedlen på SaFtsZ eller EcMreB, beroende på vad som är fallet.
Läkemedlens inverkan på sammansättningen av bakteriella cytoskelettproteiner kan sedan kvantifieras med hjälp av bildanalysverktyg och plug-ins i ImageJ eller Fiji, som tidigare rapporterats för SaFtsZ17 och EcMreB21. Den automatiserade bildinsamlingen i 96-brunnars plattformat och implementeringen av anpassade makron och skript för bildbehandling kan påskynda avbildningstiden och kvantifieringen av effekterna av läkemedlen. Genom att använda den encelliga eukaryota jästen, S. pombe, som värdsystem, föreslår vi att en screening med medelhög eller hög genomströmning för små molekyler som riktar sig mot de bakteriella cytoskelettproteinerna kan genomföras framgångsrikt, vilket så småningom leder till upptäckten av nya antibiotika.
Figur 1: Schematisk visning av användningen av fissionsjästceller för att screena för läkemedel som riktar sig mot sammansättningen av bakteriella cytoskelettproteiner SaFtsZ eller EcMreB. FtsZ från S. aureus och MreB från E. coli klonades in i jästuttrycksvektorn, pREP42 hade GFP-tagg vid C- respektive N-terminalen, och omvandlades till S. pombe för den fenotypiska och läkemedelsstudien. Kulturerna odlades i 8 - 12 timmar. Därefter subodlades odlingarna i 96-håls plattor med lämpliga kontroller och de olika läkemedlen screenades. Vidare inkuberades plattan vid 30 °C i 6 - 8 timmar tills OD600 når 0,5-0,6, och den optiska densiteten mäts med hjälp av en mikroplattläsare för att bedöma läkemedlens toxicitet mot jästceller. En annan optiskt klar glasplatta med 96 brunnar var förbelagd med concanavalin A för vidhäftning av jästceller. Denna platta med 96 brunnar användes för visualisering och bildinsamling med ett epifluorescensmikroskop. De erhållna bilderna analyserades sedan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schematisk bild av programvaran för bildinsamling för automatiserad avbildning av en platta med 96 brunnar. Med hjälp av navigatorn i ett bildinsamlingsprogram justerades en platta med 96 brunnar genom att markera kanterna. Brunnstäckningsparametrar som antalet bilder som behöver tas från varje brunn och dess plats (slumpmässigt eller från mitten av brunnen) valdes efter önskemål. Slutligen, bildparametrar som den filteruppsättning som ska användas (DIC och FITC-filter; Ex 475/28 nm och Em 525/48 nm) ställdes procentuell intensitet för belysningsljus, autofokus och exponeringstid för bildtagning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Visualisering av effekten av PC190723- och A22-läkemedel på SaFtsZ-GFP uttryckt i S. pombe. S. pombe-kultur som uttrycker SaFtsZ-GFP odlades i frånvaro av tiamin i 8 - 9 timmar vid 30 °C före DMSO och läkemedelsbehandling. Kulturen odlades vidare i en platta med 96 brunnar i 7-9 timmar vid 30 °C i närvaro eller frånvaro av läkemedlen. (A) Vid DMSO-kontroll, där en motsvarande mängd DMSO tillsattes, uppvisade cellerna ett fåtal polymera strukturer. (B) I närvaro av PC190723 (56,2 μM) uttrycker SaFtsZ jästceller som uppvisar en avsevärd ökning av de polymera strukturerna jämfört med DMSO-kontrollen. (C) MreB-hämmaren, A22 (72,6 μM), påverkade inte SaFtsZ-GFP-strukturer. (D) Längre timmar av proteinuttryck var nödvändiga för SaFtsZ-GFP-montering i frånvaro av PC190723, och därför uppvisar kontrollkulturer som odlats vid 30 °C i 12-15 timmar efter subkulturodling i 96-hålsplattor innehållande DMSO också FtsZ-polymerer. Skalstapeln är 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Visualisering av effekten av PC190723- och A22-läkemedel på GFP-EcMreB uttryckt i S. pombe. S. pombe-kultur som uttrycker GFP-EcMreB odlades i frånvaro av tiamin i 9 - 11 timmar vid 30 °C innan DMSO eller läkemedlen (A22 eller PC190723 tillsattes). Kulturen odlades vidare i en platta med 96 brunnar under 8 - 10 timmar vid 30 °C med och utan läkemedel som kontroll. (A) I odlingar där en motsvarande mängd DMSO tillsattes som kontroll, uppvisade cellerna linjära filament av EcMreB orienterade längs jästcellernas längsgående axel. (B) Sammansättningen av GFP-EcMreB påverkades inte i kulturer som behandlades med PC190723 (56,2 μM). (C) Den lilla molekylen A22 (72,6 μM), en känd hämmare av MreB-polymerisation, förhindrade sammansättningen av GFP-EcMreB i fissionsjästceller. Skalstapeln är 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Stammar och plasmider som användes i denna studie. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Sammansättning av medier och buffertar som användes i denna studie. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Antimikrobiell resistens (AMR) är ett allvarligt globalt hälsohot, och det finns ett akut behov av nya antibiotika med nya mål. Det bakteriella cytoskelettet har visat sig vara ett attraktivt mål för att utveckla nya antibiotika, med småmolekylära hämmare av celldelningsproteinet FtsZ, såsom TXA709, redan i kliniska fas I-studier30. Flera metoder har utvecklats för att identifiera hämmare av FtsZ-polymerisation 7,31. Vi har nyligen använt den eukaryota fissionsjästen i en cellbaserad analys för att visa att det stabiliserande läkemedlet FtsZ, PC190723, kan verka mot HpFtsZ17. Dessutom visade vi också att även om läkemedel som berberin och sanguinarin påverkade polymerisationen av FtsZ, påverkade de också jästcellernas morfologi17. Föranledda av dessa studier och observationer bestämde vi oss för att utveckla en cellbaserad analys i ett steg för att screena för små molekylmodulatorer av det bakteriella cytoskelettet med hjälp av plattformen för uttryck av fissionsjäst. Eftersom screeningen bygger på hämning av sammansättningen av GFP-märkta cytoskelettproteiner, kan små molekyler som delar liknande fluoroforegenskaper ge upphov till falska positiva resultat. Att undvika långpassfilter och välja smala bandpassfilter kan bidra till att minska dessa falska positiva resultat som uppstår från fluorescerande små molekyler. Här visar vi de steg som är involverade i att sätta upp en skärm med medelhög genomströmning med hjälp av ett epifluorescensmikroskop utrustat med en 96-brunnars plattstegshållare som kan användas för att screena för läkemedel riktade mot SaFtsZ eller EcMreB. Arbetsflödet omfattar halvautomatisk insamling och analys av bilder, som enkelt kan skalas upp till skärmar med hög genomströmning i framtiden med hjälp av robotiserade vätskehanteringssystem och bildbehandlingspipelines.
Vidare bör screeningen vara användbar för andra bakteriella cytoskelettproteiner, såsom aktinvecklingen som innehåller plasmidunderhållsproteinet ParM32 och mot alla proteiner som samlas till polymera strukturer i fissionsjäst. Optimala uttrycksnivåer för varje protein av intresse måste dock standardiseras innan de används i några läkemedelsskärmar. För FtsZs har vi funnit att nmt41 är en optimal promotor, men för andra proteiner av intresse är det en starkare eller svagare version av nmt1-promotorn (Promotorstyrka (och läckage): nmt1 > nmt41 > nmt81) eller andra konstitutiva promotorer som jästen adh1 eller act118,33 Kan provas för att uppnå optimala nivåer av uttryck och montering av polymera strukturer. Dessutom, vid användning av episomala plasmider, utgör variationer i antalet kopior från cell till cell också problem för enhetligt genuttryck. För att kringgå dessa problem har man nyligen utvecklat flera vektorer som kan integreras i fissionsjästgenomet (SIV för stabila integrationsvektorer) som bär promotorer av olika styrka34. Användningen av dessa vektorer kan ge mer enhetliga och kvantitativa resultat jämfört med de episomala vektorer som används i denna studie här. Användningen av SIV skulle kunna undvika den stora heterogeniteten i uttrycksnivåer, som ses som en variation i fluorescensintensiteten mellan cellerna, och bör vara bättre lämpad för skärmar med hög genomströmning.
Dessutom verkar läkemedel som PC190723 för att stabilisera FtsZ-polymererna, vilket resulterar i tidig montering av FtsZ-filament jämfört med obehandlade celler. Även om skärmen är lämplig för screening av läkemedel som hämmar polymerisation av bakteriella cytoskelettproteiner, på grund av visuell bedömning av diffus fluorescens vid slutpunkten, kräver screening av läkemedel som stabiliserar FtsZ-polymerer ytterligare optimering av proteinuttrycksnivåer och den tid som krävs för att uppnå maximalt antal celler som har polymerer. Det är därför viktigt att ha en rimlig uppskattning av den tid som krävs för proteinuttryck för att uppnå den kritiska koncentration som krävs för montering och bestämma slutpunkten för analysen därefter. När det gäller läkemedel som kan verka för att minska den kritiska koncentration som krävs för polymerisation av proteinet, skulle valet av slutpunkt vanligtvis vara en tidpunkt då en betydande population av obehandlade celler uppvisar diffus fluorescens, men kulturer som behandlats med läkemedel skulle uppvisa polymersammansättningar.
En av begränsningarna, som också är ett tidskrävande steg i arbetsflödet, är kravet på att identifiera och segmentera enskilda celler för kvantitativ bildanalys. För närvarande, i det föreslagna schemat, är detta ett manuellt steg för att identifiera enskilda jästceller och tilldela intresseområdet (ROI) för kvantifiering av effekten av läkemedlen. Vi föreställer oss dock att de nyligen utvecklade maskininlärningsalgoritmerna som använder träningsuppsättningar som de som kan implementeras i ilastik35 bör minimera behovet av manuella ingripanden.
Även om vårt tillvägagångssätt här med jästplattformen är användbart för att identifiera träffar och potentiella små molekyler som riktar sig mot bakteriens cytoskelett, kommer man så småningom att behöva testa deras antibakteriella aktivitet med hjälp av standardtesterna för minimal hämmande koncentration och effektivitet i djurmodeller. Den största utmaningen för den globala ökningen av antimikrobiell resistens (AMR) ligger dock fortfarande i den yttre membranpermeabiliteten hos de gramnegativa bakterierna och de många effluxpumparna hos många patogena bakteriearter. Dessutom kan effluxpumpar i fissionsjäst också orsaka liknande problem och högre läkemedelskoncentrationer kan krävas för screeningprocessen. Alternativt kan fissionsjäststammar som är överkänsliga för läkemedel (S. pombe MDR-supML), som ett resultat av deletionen av de sju multiresistenta generna, inklusive fyra transportgener och en transkriptionsfaktor, användas som värdar för screening32,33. Framtida utveckling av teknik som kombinerar den riktade antibakteriella upptäckten och tar itu med resistens på grund av allmänna fenomen som membranpermeabilitet kommer att vara nödvändig för att ta itu med den växande antimikrobiella resistensen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Samtliga författare uppger att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
SMP, SR och AKS erkänner de stipendier som mottagits från National Institute of Science Education and Research, Department of Atomic Energy. RS erkänner intramuralt finansieringsstöd från Institutionen för atomenergi, och detta arbete stöds genom ett forskningsanslag till RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) från Institutionen för bioteknik (DBT). Författarna tackar också V Badireenath Konkimalla för hans kommentarer, förslag och diskussioner under utvecklingen av protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black | Thermo Scientific™ | 160376 | |
| 96-well plate | Corning | CLS3370 | |
| A22 Hydrochloride | Sigma | SML0471 | Dissolved in DMSO |
| Adenine | FormediumTM | DOC0229 | 225 mg/L of media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | |
| DMSO | Sigma | 317275 | |
| Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth) | FormediumTM | PMD0210 | See below for composition |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| epMotion® 96 with 2-position slider | Eppendorf | 5069000101 | |
| Histidine | FormediumTM | DOC0144 | 225 mg/L of media |
| Leica DMi8 inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | German company | |
| Leucine | FormediumTM | DOC0157 | 225 mg/L of media |
| Lithium acetate | Sigma | 517992-100G | |
| PC190723 | Merck | 344580 | Dissolved in DMSO |
| Polyethylene glycol (PEG) | Sigma | 202398 | |
| Thiamine | Sigma | T4625 | Filter sterilised |
| Tris-Hydrochloride | MP | 194855 | |
| Uracil | FormediumTM | DOC0214 | 225 mg/L of media, Store solution at 36°C |
| YES (Yeast extract + supplements) Agar | FormediumTM | PCM0410 | See below for composition |
| YES (Yeast extract + supplements) Broth | FormediumTM | PCM0310 | See below for composition |
| Yeast (S. pombe) media | |||
| Yeast extract + supplements (YES) | |||
| Composition | g/L | ||
| Yeast extract | 5 | ||
| Dextrose | 30 | ||
| Agar | 17 | ||
| Adenine | 0.05 | ||
| L-Histidine | 0.05 | ||
| L-Leucine | 0.05 | ||
| L-Lysine HCl | 0.05 | ||
| Uracil | 0.05 | ||
| Edinburg minimal medium (EMM) | |||
| Composition | g/L | concentration | |
| potassium hydrogen phthallate | 3 | 14.7mM | |
| Na2HPO4 | 2.2 | 15.5 mM | |
| NH4Cl | 5 | 93.5 mM | |
| glucose | 2% (w/v) or 20 g/L | 111 mM | |
| Salts (stock x 50) | 20 mL/L (v/v) | ||
| Vitamins (stock x 1000) | 1 mL/L (v/v) | ||
| Minerals (Stock x 10,000) | 0.1 mL/L (v/v) | ||
| Salts x 50 | 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) | 52.5 | 0.26 M |
| 0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) | 0.000735 | 4.99 mM | |
| 50 g/l KCl (0.67 M) | 50 | 0.67 M | |
| 2 g/l Na2SO4 (14.l mM) | 2 | 14.1 mM | |
| Vitamins x 1000 | 1 g/l pantothenic acid | 1 | 4.20 mM |
| 10 g/l nicotinic acid | 10 | 81.2 mM | |
| 10 g/l inositol | 10 | 55.5 mM | |
| 10 mg/l biotin | 0.01 | 40.8 µM | |
| Minerals x 10,000 | boric acid | 5 | 80.9 mM |
| MnSO4 | 4 | 23.7 mM | |
| ZnSO4.7H2O | 4 | 13.9 mM | |
| FeCl2.6H2O | 2 | 7.40 mM | |
| molybdic acid | 0.4 | 2.47 mM | |
| KI | 1 | 6.02 mM | |
| CuSO4.5H2O | 0.4 | 1.60 mM | |
| citric acid | 10 | 47.6 mM | |
| Strains/ Plasmids | |||
| Strains | Description | Reference | |
| CCD190 | Escherichia coli DH10β | Invitrogen | |
| CCDY4 | MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| CCDY340 | CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 | |
| CCDY346 | MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-] | Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR) | |
| Plasmids | |||
| pCCD3 | pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| pCCD713 | pREP42-SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 |
References
- Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
- Haselbeck, R., et al. Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery. Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).
- Wang, J., et al. Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics. J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).
- Sanchez, S., Demain, A. L. Antibiotics: current innovations and future trends. , Caister Academic Press. (2015).
- Vollmer, W. The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics. Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).
- Vollmer, W.
- Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue. ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).
- Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria. Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).
- Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ. Antibiotics. 9 (2), 69 (2020).
- Piddock, L. J. V. Multidrug-resistance efflux pumps - not just for resistance. Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).
- Käufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence. Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).
- Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism. Curr Prot. 1 (6), e151 (2021).
- Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast. EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).
- Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast. Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).
- Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast. Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).
- TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling. J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).
- Sharma, A. K., et al. A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen. Mol Biol Cell. 34 (3), ar16 (2023).
- Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility. Gene. 123 (1), 131-136 (1993).
- Moreno, M. B., Durán, A., Carlos Ribas, J. A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast. Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).
- Green, M. R., Sambrook, J.
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
- Bähler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state. J Cell Biol. 221 (5), e202106092 (2022).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Zhang, L. Machine learning for enumeration of cell colony forming units. Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26 (2022).
- Moen, E., et al. Deep learning for cellular image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).
- Higaki, T. Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis. Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).
- Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).
- Boudaoud, A., et al. an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).
- Butler, M. S., Paterson, D. L. Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019. J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).
- Andreu, J. M., Huecas, S., Araújo-Bazán, L., Vázquez-Villa, H., Martín-Fontecha, M. The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites. Biomedicines. 10 (8), 1825 (2022).
- Vještica, A., et al. A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Cell Sci. 133 (1), jcs240754 (2020).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Shaevitz, J. W., Gitai, Z. The structure and function of bacterial actin homologs. Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364 (2010).
- Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
- Aoi, Y., et al. Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast. Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).
- Zhang, J., et al. Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model. Pathogens. 11 (7), 804 (2022).
