Summary
Fissiongær bruges her som en heterolog vært til at udtrykke bakterielle cytoskeletale proteiner såsom FtsZ og MreB som translationelle fusionsproteiner med GFP for at visualisere deres polymerisation. Også forbindelser, der påvirker polymerisation, identificeres ved billeddannelse ved anvendelse af et fluorescensmikroskop.
Abstract
Bakterielle cytoskeletale proteiner såsom FtsZ og MreB udfører væsentlige funktioner såsom celledeling og vedligeholdelse af celleform. Desuden har FtsZ og MreB vist sig at være vigtige mål for ny antimikrobiel opdagelse. Flere assays er blevet udviklet til at identificere forbindelser rettet mod nukleotidbinding og polymerisering af disse cytoskeletale proteiner, primært fokuseret på FtsZ. Desuden er mange af analyserne enten besværlige eller omkostningsintensive, og det kræver ofte flere metoder at fastslå, om disse proteiner er lægemidlets cellulære mål. Endelig udgør lægemidlernes toksicitet for eukaryote celler også et problem. Her beskriver vi et enkelttrins cellebaseret assay for at opdage nye molekyler rettet mod bakterielt cytoskelet og minimere hits, der kan være potentielt giftige for eukaryote celler. Fissiongær er modtagelig for skærme med høj kapacitet baseret på mikroskopi, og en visuel skærm kan let identificere ethvert molekyle, der ændrer polymerisationen af FtsZ eller MreB. Vores analyse bruger standard 96-brøndpladen og er afhængig af de bakterielle cytoskeletale proteiners evne til at polymerisere i en eukaryot celle såsom fissionsgæren. Mens protokollerne beskrevet her er til fissionsgær og bruger FtsZ fra Staphylococcus aureus og MreB fra Escherichia coli, kan de let tilpasses andre bakterielle cytoskeletale proteiner, der let samles i polymerer i enhver eukaryot ekspressionsvært. Den metode, der beskrives her, skal bidrage til at lette yderligere opdagelse af nye antimikrobielle stoffer rettet mod bakterielle cytoskeletale proteiner.
Introduction
Den udbredte resistens over for næsten alle antibiotika, der i øjeblikket anvendes til bekæmpelse af bakterielle infektioner, har skabt et øjeblikkeligt behov for nye kategorier af antibiotika. En rapport fra 2019 viste, at antibiotikaresistente infektioner resulterede i tab af 1.27 millioner liv, hvilket bidrog til en samlet optælling på 4.95 millioner dødsfald, når man overvejer komplikationer fra resistente bakterielle infektioner1. Selvom det stadig er effektivt i klinisk praksis, er det nuværende arsenal af antibiotika overvejende rettet mod et smalt spektrum af cellulære processer, primært med fokus på cellevæg, DNA og proteinsyntese. I løbet af det sidste halve århundrede er færre end 30 proteiner blevet udnyttet kommercielt som mål for udviklingen af nye antibakterielle midler 2,3. Denne begrænsede række levedygtige mål skaber betydelige begrænsninger for opdagelse af nye antibiotika eller derivater heraf til bekæmpelse af antibiotikaresistente bakterier. For at overvinde det nye problem med antibiotikaresistens er der derfor behov for udvikling af nye antibiotika med nye mål og virkningsmekanismer.
Et antibakterielt mål bør ideelt set være en væsentlig bestanddel af bakteriel cellevækst, bevares i hele de fylogenetisk forskellige arter, vise mindst eukaryot homologi og være tilgængelig for antibiotika4. Siden opdagelsen af bakterielle cytoskeletale proteiner, der er involveret i celledeling og vedligeholdelse af celleform, har de vist sig at være et lovende omdrejningspunkt for udvikling af antibakterielle forbindelser5. Disse proteiner er afgørende for bakteriel levedygtighed og spiller en afgørende rolle i opretholdelsen af celleform (MreB, CreS), division (FtsZ, FtsA) og DNA-adskillelse (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), beslægtet med cytoskelettet i eukaryote celler. Især udviser FtsZ et bemærkelsesværdigt højt bevaringsniveau på tværs af en bred vifte af prokaryote organismer, mens MreB findes i næsten alle stavformede bakterier. En sådan bred fordeling og relevans i cellelevedygtighed gør disse proteiner til et fascinerende mål i antibiotikaforskning 5,6,7.
Det er afgørende at vedtage en flerstrenget tilgang, der kombinerer in vivo-observationer, in vitro-interaktioner og enzymatiske eksperimenter for grundigt at validere bakterielle cytoskeletproteiner som det primære mål for en potentiel hæmmer7. Besværlige procedurer eller betydelige omkostningsimplikationer belaster mange tilgængelige analyser til dette formål. Disse er bemærkelsesværdige hindringer for deres udbredte anvendelse i screening af blyforbindelser, der kan påvirke det bakterielle cytoskelet. Blandt disse skiller mikroskopi sig ud som en usædvanlig effektiv og hurtig metode til vurdering af effektiviteten af forbindelser ved direkte at undersøge ændringer i cellemorfologi. Alligevel gør hetero-associeringen af målprotein med andre cytoskeletkomplekser, indirekte virkninger på grund af binding uden for målet og ændringer i membranpotentiale, vanskeligheder med at trænge effektivt ind i cellen og tilstedeværelse af effluxpumper, især i gramnegative bakterier, det kollektivt komplekst at lokalisere den nøjagtige årsag til bakteriel celledeformation 8,9,10.
Schizosaccharomyces pombe, eller fissionsgær som det er almindeligt kendt, er en stangformet encellet eukaryot organisme. Fissiongær anvendes i vid udstrækning som modelorganisme i cellulær og molekylærbiologi på grund af den ekstraordinære bevarelse i cellulære processer såsom cellecyklus og deling, cellulær organisation og kromosomreplikation med højere eukaryoter, herunder mennesker11,12. Desuden udtrykte Errington og kolleger et pollokaliseret bakterielt cytoskeletalt protein DivIVA i fissionsgær for at demonstrere, at DivIVA akkumulerede på negativt buede overflader13. Igen havde Balasubramanian og gruppe først etableret fissionsgær som et cellulært modelsystem for at bringe ny indsigt i mekanismen, samlingen og dynamikken af E. coli actin cytoskeletproteinet som MreB14 og tubulin homolog FtsZ15. De demonstrerer også A22's evne til effektivt at hindre polymerisationen af MreB gennem epifluorescensmikroskopi, når den udtrykkes i gær14. Efter dette har andre grupper også med succes anvendt fissionsgær til at studere samlingsegenskaberne af chloroplast FtsZ1 og FtsZ2 proteiner16. For nylig har vi etableret et proof-of-concept for levedygtigheden af brugen af fissionsgær som en cellulær platform til specifikt at screene for bakterielle cytoskelethæmmere ved at foretage en omfattende vurdering af virkningen af tre kendte FtsZ-hæmmere-sanguinarine-, berberine- og PC190723-on FtsZ-proteiner afledt af to patogene bakterier, nemlig Staphylococcus aureus og Helicobacter pylori17. Derudover viser dette enkelttrins cellebaserede assay sig medvirkende til at minimere risikoen for at identificere forbindelser, der kan være potentielt giftige for eukaryote celler.
I denne rapport, ved hjælp af fissionsgærsystemet, foreslår vi en systematisk arbejdsgang ved hjælp af standard 96-brøndpladen til halvautomatisk screening og kvantificering af effekten af små molekylehæmmere rettet mod FtsZ fra Staphylococcus aureus og MreB fra Escherichia coli. Her opsætter og optimerer vi det semiautomatiserede workflow ved hjælp af de etablerede inhibitorer PC190723 og A22, der specifikt er målrettet henholdsvis FtsZ og MreB. Denne arbejdsgang bruger et epifluorescensmikroskop udstyret med et motoriseret højpræcisionstrin og automatiseret billedoptagelse i en standard 96-brøndplade for at forbedre den nuværende standardisering. Derfor kan det anvendes på mellemstore såvel som high-throughput skærme af syntetiske kemiske biblioteker og omgå nogle af de udfordringer, der er anført ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ekspression af GFP-mærkede bakterielle cytoskeletproteiner i S. pombe
BEMÆRK: Se tabel 1 for information om alle plasmider og stammer, der anvendes her. Se tabel 2 for alle mediekompositioner.
- Udfør kloning af E. coli MreB med en N-terminal GFP-fusion (GFP-MreB) og S. aureus FtsZ, der bærer en C-terminal GFP (SaFtsZ-GFP) ind i S. pombe-ekspressionsvektoren, pREP42 med en mediumstærk thiamin-repressibel promotor, nmt4118,19 som tidligere beskrevet14,15. Opret, forstærk og isoler plasmiderne fra E. coli-stammer (DH10β) som beskrevet i20,21.
BEMÆRK: Andre E. coli-stammer såsom DH5α, XL1Blue, TOP10 osv. eller andre kommercielt tilgængelige kompetente celler, der rutinemæssigt anvendes til molekylær kloning, kan også anvendes. - Omdannelse af plasmider pREP42-GFP-EcMreB og pREP42-SaFtsZ-GFP til S. pombe
- Omdan plasmiderne pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) og pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) til S. pombe-stamme (h-leu1-32 ura4-D18) ved hjælp af lithiumacetatmetoden22, som nævnt i nedenstående trin.
- Dag 1 - Primær kultur: Pod en sløjfe af friskstribet S. pombe-kultur i 3 ml autoklaveret gærekstrakt og kosttilskud (JA) bouillon. Den inkuberes i en orbitalryster ved 30 °C natten over (O/N).
- Dag 2:
- Sekundær kultur: Tilsæt ca. 500 μL primærkultur til 30 ml autoklaveret JA bouillon. Der inkuberes ved 30 °C i 3 - 4 timer under omrystning, indtil OD600 når 0,4 - 0,6.
BEMÆRK: For hver transformation anvendes 30 ml. - Pellet 30 ml kulturen ved 2.500 x g i 6-8 min ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, og cellerne vaskes med 50 ml sterilt destilleret vand (D/W). Pellet ned igen og kassér supernatanten. Resuspender cellerne i 1 ml steril D/W og overfør det til et 2 ml centrifugeglas. Der centrifugeres som ovenfor og kasseres supernatanten.
- Der tilsættes 1 ml 0,1 M lithiumacetat, Tris-EDTA (LiAc-TE) opløsning og centrifugeres som ovenfor. Supernatanten kasseres og resuspenderes i 1 ml 0,1 M LiAc-TE. Supernatanten centrifugeres og kasseres, så der efterlades 100 μl opløsning.
- Tilsæt 10 - 20 μg bærer-DNA (laksesæd-DNA; denatureret og flashkølet på is) og 2 - 3 μg plasmid-DNA, som skal transformeres. Bland forsigtigt. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
- Der tilsættes 260 μL 40 % PEG/LiAc-TE; Bland forsigtigt. Der inkuberes i 60 minutter i rysteren eller en termomixer ved 30 °C med forsigtig blanding. Der tilsættes 43 μL DMSO; Bland forsigtigt.
- Varmechok ved 42 °C i 10 minutter i termomixeren. Pellet ved 2.500 x g i 6-8 min og kassér supernatant. Pellet vaskes 1x med 1 ml steril D/W.
- Pellet, kassér supernatant og genopslæm pellet i 200 μL steril D/W. Plade 100 μL på Edinburgh minimalmedium (EMM) plader indeholdende 5 μg/ ml thiamin (til undertrykkelse af nmt41-promotor ) og aminosyretilskud adenin (0,225 mg / ml), histidin (0,225 mg / ml) og leucin (0,225 mg / ml), men mangler uracil (selektionsmarkør for pREP42-plasmid).
BEMÆRK: Alternativt plade 70 μL og 130 μL i to forskellige plader. To forskellige volumener (70 μL og 130 μL) er belagt for at opnå isolerede kolonier på mindst en af pladerne afhængigt af transformationseffektiviteten, som kan variere fra eksperiment til eksperiment. - Pladerne inkuberes ved 30 °C i 2-3 dage, indtil kolonierne vises. Bland en enkelt koloni med 100 μL steril D / W og spred ud på en frisk EMM-plade, der indeholder thiamin, men mangler uracil som beskrevet ovenfor.
- Inkuber ved 30 °C i 2-3 dage, indtil en komplet græsplæne vises. Skrot den dyrkede græsplæne af celler ved hjælp af en podningssløjfe og resuspender den til 1 ml JA-medie indeholdende 30% glycerol i et kryohætteglas.
- Flashfryse kryohætteglasset i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C for at bevare de frosne gærlagre.
- Sekundær kultur: Tilsæt ca. 500 μL primærkultur til 30 ml autoklaveret JA bouillon. Der inkuberes ved 30 °C i 3 - 4 timer under omrystning, indtil OD600 når 0,4 - 0,6.
- Ekspression af bakterielle cytoskeletproteiner i fissionsgær
- Aseptisk stribe et plaster fra glycerolstammen på en frisk gærspecifik plade for at opnå tilstrækkelig kultur til yderligere eksperimenter.
BEMÆRK: I tilfælde af pREP42 brugte vi en EMM-agarplade (minimale medier) indeholdende adenin, histidin og leucin (som ved hjælp af S. pombe-stamme (h- leu1-32 ura4-D18)) uden uracil (uracil til stede i pREP42 som markeringsmarkør). Vi tilføjer 15 - 20 μM thiamin til agarpladerne (da pREP42 har thiaminrepressibel nmt41-promotor ) for at undertrykke ekspressionen af genet af interesse, når det vokser på pladen. - Pod en lille sløjfe af podematerialet fra det stribede plaster i 5 ml gærspecifikke EMM-medier, der mangler thiamin, og inkuber det i 10-12 timer ved 30 °C.
BEMÆRK: Ekspressionen af FtsZ og MreB fra forskellige arter under nmt41-promotoren i S. pombe kan variere, typisk fra 16 til 30 timer. Den optimale tid for proteinekspression af GFP-EcMreB og SaFtsZ-GFP i S. pombe er henholdsvis 20 - 24 timer og 16 - 20 timer ved 30 °C uden thiamin.
- Aseptisk stribe et plaster fra glycerolstammen på en frisk gærspecifik plade for at opnå tilstrækkelig kultur til yderligere eksperimenter.
2. Behandling af S. pombe-kulturer , der udtrykker GFP-mærkede bakterielle cytoskeletale proteiner
BEMÆRK: En række forskellige lægemiddelmolekyler testes på den overnattende gærkultur i en 96-brønds plade.
- Podes en frisk kultur ved at overføre 50 μL af natkulturen til hver brønd i en 96-brønds plade indeholdende 150 μL frisk gær EMM-medier ved hjælp af det halvautomatiske 96-brønds multikanalpipetteringsinstrument.
- Mens pipettering ind og ud for korrekt blanding ved hjælp af en halvautomatisk, 96-brønds multikanalpipette, introduceres langsomt forskellige stigende koncentrationer af lægemidler i den voksende kultur, hver udført i tre eksemplarer som vist i skemaet i figur 1.
- Som en positiv kontrol skal du bruge de allerede kendte lægemidler, PC190723 for (S. aureus FtsZ) og A22 (for E. coli MreB) i to eksemplarer.
BEMÆRK: Som tidligere rapporteret blev PC190723 og A22 anvendt i en koncentration på henholdsvis 56,2 μM17 og 72,6 μM 14,17. I mellemtiden fungerede A22-behandling af SaFtsZ og PC190723 behandling af EcMreB som henholdsvis negative kontroller. - Brug DMSO som opløsningsmiddelkontrol ved tre forskellige koncentrationer i henhold til de laveste og højeste koncentrationer af lægemidler.
BEMÆRK: Opløsningsmidlet, hvori lægemidler opløses, anvendes som opløsningsmiddelkontrol. - Inkuber kontrolkulturen og de behandlede kulturer ved 30 °C i 6-10 timer (indtil cellerne viser ekspression af bakterielle fluorescerende proteiner) og afbild derefter ved hjælp af epifluorescensmikroskopi.
3. Visualisering af polymererne
- Påfør en belægning på 20 μL 1 mg/ml concanavalin A på hvert hul i den optisk gennemsigtige nederste 96-brøndsplade (sortvægget til fluorescensbilleddannelse) og inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur. Opsug væske og lad det lufttørre i 10 min.
- Overfør 20 μL celler fra kulturpladen til hver respektive brønd og lad den sidde i 10 minutter. Vask cellen 3x-4x med det sterile EMM-medie.
- Når objektivobjektivet skal bruges på plads (se trin 3.6), skal du bruge navigatortilstanden i anskaffelsespanelet i billedoptagelsessoftwaren til pladejustering med 96 brønde og brønddækning. Juster brøndkanterne på navigatoren.
- Vælg derefter parametrene for brønddækning, som omfatter et valg af flere positioner i det område, der er af interesse i brønden, og brug adaptiv autofokuskontrol med on-demand-tilstand for at holde prøven i fokus under billeddannelse.
- Hent billeder ved hjælp af differentiel interferenskontrast (DIC) og fluorescens. Indstil excitations- og emissionsfiltre på henholdsvis 475/28 nm og 525/48 nm for at afbilde de GFP-mærkede bakterieproteiner udtrykt i gær. Få Z-stakke ved en trinstørrelse på 0,2 μm gennem gærcellernes tykkelse (5 μm).
- Tag billeder ved hjælp af et omvendt epifluorescensmikroskop udstyret med et 100x, 1,4-NA olienedsænkningsmål og et 2.000 x 2.000 sCMOS-kamera (6,5 μm x 6,5 μm pixelstørrelse). Brug et LED-belysningssystem til excitation af fluoroforen.
BEMÆRK: Ethvert epifluorescensmikroskopsystem, der har et motoriseret trin til en 96-brøndplade med præcis flerpunktspositionering, skal være egnet. Få alle cellebilleder af kontrol og lægemiddelbehandlet med en lignende eksponeringstid (normalt i området 0,3 - 0,5 s) ved en binning på 1 x 1 og belysning ved 15% - 20% for at minimere eksperimentvariablerne og opretholde konsistens.
4. Kvantificering af billederne ved hjælp af ImageJ
- Behandl cellebilleder, og mål antallet af pletter pr. celle og densitet for FtsZ17. I tilfælde af MreB måles densitet og anisotropi23 og sammenlignes mellem kontrolceller og behandlede celler ved hjælp af Fiji (v2.0.0-rc-69/1.52p)24.
- Brug billederne fra DIC-kanalen til først at skitsere de enkelte gærceller ved hjælp af frihåndstegneværktøjet og gem som et interesseområde (ROI) i ROI-manageren. Dette trin er endnu ikke automatiseret, men nyligt udviklede værktøjer ved hjælp af maskinlæring25,26 kunne forsøges og indarbejdes i den nærmeste fremtid.
- Masker det udvendige område af cellen, og fyld sort som beskrevet i27.
- Brug OPS-tærsklen IJ1-analysemakro, en indbygget funktion i Fiji, til at tælle antallet af pletter24.
- Brug otsu-metoden til automatisk tærskel og maskere de segmenterede partikler. Kør ekstramodulet Analysér partikler ved hjælp af en makro.
- Til måling af polymerdensitet (mængde cytoskelet pr. arealenhed i en celle), procesbilleder som beskrevet, herunder maskerings- og skeletoniseringstrin27,28. Brug Lpx 2Dfilter i lpx plug-in til at skeletonisere billederne.
- For detaljer, se denne seneste publikation17. Udfør EcMreB-polymerkvantificering som tidligere nævnt i23, brug anisotropi til at kvantificere rumlig organisering ved hjælp af FibrilTool29 som beskrevet tidligere23.
BEMÆRK: Disse analysemetoder kan bruges til at kvantificere eventuelle andre bakterielle cytoskeletproteiner, der behandles eller ikke behandles af lægemidlerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Opsætning af 96-brøndpladen til screening af lægemidler
Anvendelse af S. pombe til at udtrykke en C- terminalt GFP mærket S. aureus FtsZ fra en vektor (pREP42) indeholdende thiaminpressibel promotor med medium styrke nmt41er tidligere blevet fastslået17, og tilsvarende blev E. coli MreB mærket med N- terminal GFP også udtrykt i S. pombe14. Vi har også vist, at PC190723, en specifik hæmmer af SaFtsZ og A22, en MreB-hæmmer, kan udøve deres virkninger på de respektive bakterielle cytoskeletale proteiner på en bestemt måde, når de udtrykkes i gær 14,17.
Her foreslår vi at bruge gærekspressionssystemet til at udvikle en medium eller høj gennemstrømningsscreening af antibakterielle lægemidler rettet mod de bakterielle cytoskeletproteiner. Et epifluorescensmikroskop med et motoriseret trin kan automatiseres til at afbilde en 96-brøndplade, og kommercielle lægemiddelbiblioteker er også let tilgængelige i 96-brønds pladeformater. Vi foretrækker derfor at bruge en 96-brønds plade til den foreslåede screening af lægemidler. Pladerne indstilles som vist i figur 1. Den første række (figur 1A) består af SaFtsZ-GFP, der udtrykker gærkultur. Anden række (figur 1B) består af gærkulturer, der udtrykker GFP-EcMreB. De første to kolonner i de første to rækker (A1:B2) er angivet som tomme medier. De følgende seks kolonner i de to første rækker (A3:B12) er indstillet som DMSO-kontrol med tre forskellige koncentrationer i henhold til lægemiddelfortyndingerne i to eksemplarer. Derefter tilsættes PC190723 (56,2 μM) og A22 (72,6 μM) til gærceller, der udtrykker SaFtsZ-GFP eller GFP-EcMreB. PC190723 og A22 fungerer som positive kontroller for henholdsvis FtsZ og MreB. Alle andre brønde (C1: F12) bruges til at tilføje forskellige lægemidler (i tre forskellige koncentrationer og i to eksemplarer), der anvendes i skærmen til at identificere effektorer af de bakterielle cytoskeletproteiner, SaFtsZ eller EcMreB. Gærkulturer, der udtrykker GFP-mærkede SaFtsZ eller MreB, dispenseres i disse 96-brøndplader og dyrkes, indtil virkningerne af lægemidlerne på samlingen af polymerer visualiseres.
Vurdering af væksteffekter på gærceller
Efter inkubation af de 96-brønde, der indeholder subdyrkede celler ved 30 °C i 6 til 10 timer, måles gærkulturens optiske densitet (OD) ved hjælp af en mikropladelæser. Måling af OD hjælper med at vurdere enhver væksthæmmende virkning af lægemidlerne mod de eukaryote gærceller og muligvis skadelige virkninger på humane celler. Således kan dette assay bruges til at screene flere lægemidler baseret på deres toksicitet i gærsystemet. Imidlertid udviser hverken PC190723 eller A22 nogen vækstvirkninger eller toksicitet for gærceller, og OD600 af de kulturer, der udtrykker SaFtsZ-GFP behandlet med DMSO, PC190723 eller A22, var henholdsvis 0,38 ± 0,03, 0,44 ± 0,02 og 0,43 ± 0,06 (N ≥ 4). Ligeledes var OD600 af de kulturer, der udtrykte GFP-EcMreB og behandlet med DMSO, PC190723 eller A22, henholdsvis 0,38 ± 0,04, 0,44 ± 0,07 og 0,41 ± 0,08 (N ≥ 4).
Visualisering af lægemidlets virkning på de polymere strukturer samlet af SaFtsZ og EcMreB udtrykt i S. pombe
For at vurdere virkningen af lægemidlerne på polymerisering af SaFtsZ eller EcMreB overføres en alikvote af gærcellerne fra ovennævnte 96-brøndplade indeholdende lægemidler til en anden 96-brøndplade med optisk klar glasbund 96-brønd egnet til fluorescensbilleddannelse. Denne plade med 96 brønde er også belagt med concanavalin A for at tillade vedhæftning af gærcellerne, der udtrykker GFP-mærket SaFtsZ eller EcMreB. 96-brøndpladen er afbildet ved hjælp af et epifluorescensmikroskop, der dækker alle pladens 96-brønde på de forudbestemte positioner, som styres af billedoptagelsessoftwaren (figur 2). I kontrolhullerne (DMSO-behandlet) viste gærceller, der udtrykte SaFtsZ-GFP, polymere strukturer i form af pletter eller pletter fordelt over cellerne efter 16-18 timers vækst i fravær af thiamin. 10-12 timer efter vækst i mangel på thiamin udviste cellerne imidlertid kun diffus fluorescens eller få pletter, hvilket tyder på, at FtsZ-GFP-ekspression ikke havde nået den kritiske koncentration, der kræves til polymerisering (figur 3A). Tværtimod viste det FtsZ-stabiliserende lægemiddel PC190723 en betydelig stigning i de polymere strukturer (pletter eller pletter) af SaFtsZ-GFP sammenlignet med DMSO-kontrol efter 12 timers vækst (figur 3B), der tjener som den positive kontrol. I modsætning hertil viste celler behandlet med A22 ingen forskel i SaFtsZ-GFP-strukturerne samlet (figur 3C). I modsætning til kulturer behandlet med PC190723 samledes SaFtsZ-GFP imidlertid kun i pletter i ubehandlede kulturer, når de blev induceret i længere perioder, hvilket viser, at PC190723 virkede til at reducere den kritiske koncentration af polymerisering af SaFtsZ (figur 3D). Ligeledes dannede GFP-EcMreB udtrykt i S. pombe lineære arrays af lange filamenter langs fissionsgærens længdeakse (figur 4A). Mens PC190723 viste sig ikke at have nogen effekt på EcMreB-polymerisering (figur 4B), resulterede behandling af celler med A22 i diffust fluorescens gennem gærcellernes cytoplasma (figur 4C). Billederne fra resten af 96-brøndpladerne inspiceres visuelt for stabilisering eller hæmmende virkninger af lægemidlerne på SaFtsZ eller EcMreB, alt efter tilfældet.
Virkningen af lægemidlerne på samlingen af bakterielle cytoskeletale proteiner kan derefter kvantificeres ved hjælp af billedanalyseværktøjer og plug-ins i ImageJ eller Fiji, som tidligere rapporteret for SaFtsZ17 og EcMreB21. Den automatiserede billedoptagelse i 96-brønds pladeformat og implementering af brugerdefinerede makroer og scripts til billedbehandling kan fremskynde billedbehandlingstiden og kvantificeringen af virkningerne af lægemidlerne. Ved hjælp af den encellede eukaryote gær, S. pombe, som værtssystem foreslår vi således, at en medium eller høj gennemstrømningsskærm for små molekyler rettet mod de bakterielle cytoskeletale proteiner kan udføres med succes, hvilket i sidste ende fører til opdagelsen af nye antibiotika.
Figur 1: Skematisk viser brugen af fissionsgærceller til screening for lægemidler rettet mod samling af bakterielle cytoskeletale proteiner SaFtsZ eller EcMreB. FtsZ fra S. aureus og MreB fra E. coli blev klonet ind i gærekspressionsvektoren, pREP42 med GFP-tag ved henholdsvis C- og N-terminalen og omdannet til S. pombe til fænotypisk og lægemiddelundersøgelse. Kulturerne blev dyrket i 8 - 12 timer. Derefter blev kulturerne subdyrket i 96-brøndplader med passende kontroller, og de forskellige lægemidler blev screenet. Endvidere blev pladen inkuberet ved 30 °C i 6 - 8 timer, indtil OD600 når 0,5-0,6, og den optiske densitet måles ved hjælp af en mikropladelæser til vurdering af lægemidlernes toksicitet over for gærceller. En anden optisk klar glasbund 96-brønds plade blev forbelagt med concanavalin A til klæbende gærceller. Denne 96-brønds plade blev brugt til visualisering og billedoptagelse med et epifluorescensmikroskop. De opnåede billeder blev derefter analyseret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk oversigt over billedoptagelsessoftwaren til automatiseret billeddannelse af en plade med 96 brønde. Ved hjælp af navigatoren i billedoptagelsessoftware blev en 96-brøndplade justeret ved at markere kanterne. Brønddækningsparametre som antallet af billeder, der skal tages fra hver brønd og dens placering (tilfældig eller fra midten af brønden) blev valgt som ønsket. Endelig billedparametre såsom det filtersæt, der skal bruges (DIC og FITC-filter; Ex 475/28 nm og Em 525/48 nm), procentvis intensitet af belysningslys, autofokus og eksponeringstid for billedoptagelse blev indstillet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Visualisering af effekten af PC190723 og A22 lægemidler på SaFtsZ-GFP udtrykt i S. pombe . S. pombe-kultur , der udtrykker SaFtsZ-GFP, blev dyrket uden thiamin i 8 - 9 timer ved 30 °C før DMSO og lægemiddelbehandling. Kulturen blev yderligere dyrket i en 96-brønds plade i 7 - 9 timer ved 30 °C i nærværelse eller fravær af lægemidlerne. (A) I DMSO-kontrol, hvor en tilsvarende mængde DMSO blev tilsat, udviste cellerne nogle få polymere strukturer. (B) I nærværelse af PC190723 (56,2 μM) udtrykker SaFtsZ gærceller, der viser en betydelig stigning i de polymere strukturer end DMSO-kontrollen. (C) MreB-hæmmeren, A22 (72,6 μM), påvirkede ikke SaFtsZ-GFP-strukturer. (D) Længere timers proteinekspression var nødvendig for SaFtsZ-GFP-samling i fravær af PC190723, og kontrolkulturer dyrket ved 30 °C i 12-15 timer efter underdyrkning i 96-brøndsplade indeholdende DMSO udviser derfor også FtsZ-polymerer. Skalabjælken er 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Visualisering af effekten af PC190723- og A22-lægemidler på GFP-EcMreB udtrykt i S. pombe . S. pombe-kultur , der udtrykker GFP-EcMreB, blev dyrket uden thiamin i 9-11 timer ved 30 °C før tilsætning af DMSO eller lægemidlerne (A22 eller PC190723). Kulturen blev yderligere dyrket i en 96-brønds plade i 8 - 10 timer ved 30 °C med og uden lægemidler som kontrol. (A) I kulturer, hvor en tilsvarende mængde DMSO blev tilsat som kontrol, udviste celler lineære filamenter af EcMreB orienteret langs gærcellernes længdeakse. (B) Samlingen af GFP-EcMreB blev ikke påvirket i kulturer behandlet med PC190723 (56,2 μM). (C) Det lille molekyle A22 (72,6 μM), en kendt hæmmer af MreB-polymerisering, forhindrede samling af GFP-EcMreB i fissionsgærceller. Skalabjælken er 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Stammer og plasmider anvendt i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Sammensætning af medier og buffere anvendt i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Antimikrobiel resistens (AMR) er en alvorlig global sundhedstrussel, og der er et presserende behov for nye antibiotika med nye mål. Det bakterielle cytoskelet har vist sig at være et attraktivt mål for udvikling af nye antibiotika med små molekylehæmmere af celledelingsproteinet FtsZ, såsom TXA709, allerede i fase I kliniske forsøg30. Flere metoder er blevet udviklet til at identificere hæmmere af FtsZ-polymerisation 7,31. Vi har for nylig brugt den eukaryote fissionsgær i et cellebaseret assay for at vise, at FtsZ-stabiliserende lægemiddel, PC190723, kan målrette mod HpFtsZ17. Desuden viste vi også, at selvom lægemidler som berberin og sanguinarine påvirkede polymerisationen af FtsZ, påvirkede de også gærcellernes morfologi17. Foranlediget af disse undersøgelser og observationer satte vi os for at udvikle et enkelttrins cellebaseret assay til screening for små molekylemodulatorer af det bakterielle cytoskelet ved hjælp af fissionsgærekspressionsplatformen. Da skærmen er afhængig af hæmning af samlingen af GFP-mærkede cytoskeletale proteiner, kan små molekyler, der deler lignende fluoroforegenskaber, give anledning til falske positiver. Undgå langpasfiltre og valg af smalle båndpasfiltre kan hjælpe med at reducere disse falske positiver, der stammer fra fluorescerende små molekyler. Her viser vi de trin, der er involveret i opsætning af en medium gennemstrømningsskærm ved hjælp af et epifluorescensmikroskop udstyret med en 96-brønds pladestageholder, der kan bruges til at screene for lægemidler rettet mod SaFtsZ eller EcMreB. Arbejdsgangen involverer semi-automatiseret billedoptagelse og analyse, som let kan skaleres til skærme med høj kapacitet i fremtiden ved hjælp af robotvæskehåndteringssystemer og billedbehandlingsrørledninger.
Endvidere bør skærmen være nyttig til andre bakterielle cytoskeletale proteiner, såsom actinfolden indeholdende plasmidvedligeholdelsesprotein ParM32 og mod ethvert protein, der samles i polymere strukturer i fissionsgær. Imidlertid skal optimale ekspressionsniveauer for hvert protein af interesse standardiseres inden brug i lægemiddelskærme. Mens vi for FtsZ'er har fundet, at nmt41 er en optimal promotor, for andre proteiner af interesse, en stærkere eller svagere version af nmt1-promotoren (promotorstyrke (og utæthed): nmt1 > nmt41 > nmt81) eller andre konstitutive promotorer såsom gæren adh1 eller act118,33 kan forsøges at opnå optimale niveauer for ekspression og samling af polymere strukturer. Desuden udgør kopinummervariationer fra celle til celle også problemer for ensartet genekspression, mens der anvendes episomale plasmider. For at omgå disse problemer er der for nylig udviklet flere vektorer, der kan integreres i fissionsgærgenomet (SIV'er for stabile integrationsvektorer), der bærer promotorer af forskellige styrker34. Brugen af disse vektorer kan give mere ensartede og kvantitative resultater sammenlignet med de episomale vektorer, der anvendes i denne undersøgelse her. Brugen af SIV'er kunne undgå den store heterogenitet i ekspressionsniveauer, set som en variation i fluorescensintensiteterne på tværs af cellerne og burde være bedre egnet til skærme med høj kapacitet.
Desuden virker lægemidler som PC190723 for at stabilisere FtsZ-polymererne, hvilket resulterer i den tidlige samling af FtsZ-filamenter sammenlignet med ubehandlede celler. Mens skærmen er egnet til screening af lægemidler, der hæmmer polymerisering af bakterielle cytoskeletale proteiner, på grund af visuel vurdering af diffus fluorescens ved endepunktet, kræver screening af lægemidler, der stabiliserer FtsZ-polymerer, yderligere optimering af proteinekspressionsniveauer og den tid, der er nødvendig for at opnå maksimalt antal celler, der har polymerer. Det er derfor afgørende at have et rimeligt skøn over den tid, det tager for proteinekspression at opnå den kritiske koncentration, der kræves til samling, og bestemme endepunktet for analysen i overensstemmelse hermed. I tilfælde af lægemidler, der kan virke for at reducere den kritiske koncentration, der kræves til polymerisering af proteinet, vil valget af endepunkt typisk være et tidspunkt, hvor en betydelig population af ubehandlede celler udviser diffus fluorescens, men kulturer behandlet med lægemidler vil vise polymersamlinger.
En af begrænsningerne, som også er et tidskrævende trin i arbejdsgangen, er kravet om at identificere og segmentere individuelle celler til kvantitativ billedanalyse. I øjeblikket er dette i den foreslåede ordning et manuelt skridt til at identificere individuelle gærceller og tildele interesseområdet (ROI'er) til kvantificering af lægemidlets virkning. Vi forestiller os dog, at de nyligt udviklede maskinlæringsalgoritmer ved hjælp af træningssæt som dem, der kan implementeres i ilastik35 , skal minimere behovet for manuel indgriben.
Mens vores tilgang her ved hjælp af gærplatformen er nyttig til at identificere hits og potentielle små molekyler rettet mod bakteriecytoskelettet, skal man i sidste ende teste deres antibakterielle aktivitet ved hjælp af standard minimale hæmmende koncentrationstest og effektivitet i dyremodeller. Ikke desto mindre ligger den største udfordring for den globale stigning i antimikrobiel resistens (AMR) stadig i den ydre membranpermeabilitet af de gramnegative bakterier og de mange effluxpumper i mange patogene bakteriearter. Desuden kan effluxpumper i fissionsgær også udgøre lignende problemer, og højere lægemiddelkoncentrationer kan være nødvendige for screeningsprocessen. Alternativt kan fissionsgærstammer, der er overfølsomme over for lægemidler (S. pombe MDR-supML), som følge af sletning af de syv multiresistensgener, herunder fire transportørgener og en transkriptionsfaktor, anvendes som værter til screening32,33. Fremtidig udvikling inden for teknologier, der kombinerer den målrettede antibakterielle opdagelse og adresserer resistens som følge af generelle fænomener såsom membranpermeabilitet, vil være nødvendig for at tackle den voksende antimikrobielle resistens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
SMP, SR og AKS anerkender stipendierne modtaget fra National Institute of Science Education and Research, Institut for Atomenergi. RS anerkender intramural finansieringsstøtte fra Institut for Atomenergi, og dette arbejde understøttes gennem en forskningsbevilling til RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) fra Institut for Bioteknologi (DBT). Forfatterne anerkender også V Badireenath Konkimalla for hans kommentarer, forslag og diskussioner gennem hele udviklingen af protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black | Thermo Scientific™ | 160376 | |
| 96-well plate | Corning | CLS3370 | |
| A22 Hydrochloride | Sigma | SML0471 | Dissolved in DMSO |
| Adenine | FormediumTM | DOC0229 | 225 mg/L of media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | |
| DMSO | Sigma | 317275 | |
| Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth) | FormediumTM | PMD0210 | See below for composition |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| epMotion® 96 with 2-position slider | Eppendorf | 5069000101 | |
| Histidine | FormediumTM | DOC0144 | 225 mg/L of media |
| Leica DMi8 inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | German company | |
| Leucine | FormediumTM | DOC0157 | 225 mg/L of media |
| Lithium acetate | Sigma | 517992-100G | |
| PC190723 | Merck | 344580 | Dissolved in DMSO |
| Polyethylene glycol (PEG) | Sigma | 202398 | |
| Thiamine | Sigma | T4625 | Filter sterilised |
| Tris-Hydrochloride | MP | 194855 | |
| Uracil | FormediumTM | DOC0214 | 225 mg/L of media, Store solution at 36°C |
| YES (Yeast extract + supplements) Agar | FormediumTM | PCM0410 | See below for composition |
| YES (Yeast extract + supplements) Broth | FormediumTM | PCM0310 | See below for composition |
| Yeast (S. pombe) media | |||
| Yeast extract + supplements (YES) | |||
| Composition | g/L | ||
| Yeast extract | 5 | ||
| Dextrose | 30 | ||
| Agar | 17 | ||
| Adenine | 0.05 | ||
| L-Histidine | 0.05 | ||
| L-Leucine | 0.05 | ||
| L-Lysine HCl | 0.05 | ||
| Uracil | 0.05 | ||
| Edinburg minimal medium (EMM) | |||
| Composition | g/L | concentration | |
| potassium hydrogen phthallate | 3 | 14.7mM | |
| Na2HPO4 | 2.2 | 15.5 mM | |
| NH4Cl | 5 | 93.5 mM | |
| glucose | 2% (w/v) or 20 g/L | 111 mM | |
| Salts (stock x 50) | 20 mL/L (v/v) | ||
| Vitamins (stock x 1000) | 1 mL/L (v/v) | ||
| Minerals (Stock x 10,000) | 0.1 mL/L (v/v) | ||
| Salts x 50 | 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) | 52.5 | 0.26 M |
| 0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) | 0.000735 | 4.99 mM | |
| 50 g/l KCl (0.67 M) | 50 | 0.67 M | |
| 2 g/l Na2SO4 (14.l mM) | 2 | 14.1 mM | |
| Vitamins x 1000 | 1 g/l pantothenic acid | 1 | 4.20 mM |
| 10 g/l nicotinic acid | 10 | 81.2 mM | |
| 10 g/l inositol | 10 | 55.5 mM | |
| 10 mg/l biotin | 0.01 | 40.8 µM | |
| Minerals x 10,000 | boric acid | 5 | 80.9 mM |
| MnSO4 | 4 | 23.7 mM | |
| ZnSO4.7H2O | 4 | 13.9 mM | |
| FeCl2.6H2O | 2 | 7.40 mM | |
| molybdic acid | 0.4 | 2.47 mM | |
| KI | 1 | 6.02 mM | |
| CuSO4.5H2O | 0.4 | 1.60 mM | |
| citric acid | 10 | 47.6 mM | |
| Strains/ Plasmids | |||
| Strains | Description | Reference | |
| CCD190 | Escherichia coli DH10β | Invitrogen | |
| CCDY4 | MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| CCDY340 | CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 | |
| CCDY346 | MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-] | Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR) | |
| Plasmids | |||
| pCCD3 | pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| pCCD713 | pREP42-SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 |
References
- Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
- Haselbeck, R., et al. Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery. Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).
- Wang, J., et al. Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics. J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).
- Sanchez, S., Demain, A. L. Antibiotics: current innovations and future trends. , Caister Academic Press. (2015).
- Vollmer, W. The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics. Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).
- Vollmer, W.
- Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue. ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).
- Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria. Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).
- Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ. Antibiotics. 9 (2), 69 (2020).
- Piddock, L. J. V. Multidrug-resistance efflux pumps - not just for resistance. Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).
- Käufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence. Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).
- Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism. Curr Prot. 1 (6), e151 (2021).
- Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast. EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).
- Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast. Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).
- Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast. Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).
- TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling. J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).
- Sharma, A. K., et al. A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen. Mol Biol Cell. 34 (3), ar16 (2023).
- Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility. Gene. 123 (1), 131-136 (1993).
- Moreno, M. B., Durán, A., Carlos Ribas, J. A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast. Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).
- Green, M. R., Sambrook, J.
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
- Bähler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state. J Cell Biol. 221 (5), e202106092 (2022).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Zhang, L. Machine learning for enumeration of cell colony forming units. Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26 (2022).
- Moen, E., et al. Deep learning for cellular image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).
- Higaki, T. Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis. Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).
- Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).
- Boudaoud, A., et al. an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).
- Butler, M. S., Paterson, D. L. Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019. J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).
- Andreu, J. M., Huecas, S., Araújo-Bazán, L., Vázquez-Villa, H., Martín-Fontecha, M. The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites. Biomedicines. 10 (8), 1825 (2022).
- Vještica, A., et al. A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Cell Sci. 133 (1), jcs240754 (2020).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Shaevitz, J. W., Gitai, Z. The structure and function of bacterial actin homologs. Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364 (2010).
- Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
- Aoi, Y., et al. Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast. Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).
- Zhang, J., et al. Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model. Pathogens. 11 (7), 804 (2022).
