والفحص صفيحة ميكروسكوبية لتقييم تأثيرات المواد الكيماوية على RBL-2H3 الصاري تحبب الخلايا: آثار التريكلوسان بدون استخدام مذيب عضوي

Summary

تحبب الخلايا البدينة، والإفراج عن وسطاء حساسية، والمهم في الحساسية، والربو، والدفاع الطفيلي. نحن هنا لشرح تقنيات ¹ لتقييم آثار المخدرات والمواد السامة على تحبب، المنهجية المستخدمة مؤخرا لإظهار تأثير مثبط قوي من وكيل مضاد للجراثيم التريكلوسان ^2.

Abstract

الخلايا البدينة تلعب دورا هاما في أمراض الحساسية والمناعة ضد الطفيليات الدفاع. تنشيط مرة واحدة (مثلا عن طريق مثيرة للحساسية)، فإنها degranulate، وهي العملية التي ينتج إيماس من الوسطاء حساسية. التشكيل من تحبب الخلايا البدينة من المخدرات والمواد السامة قد يكون لها آثار إيجابية أو سلبية على صحة الإنسان. وقد تم تشريح وظيفة الخلايا البدينة بالتفصيل مع استخدام مستقعد الخلايا البدينة سرطان الدم الفئران (RBL-2H3)، وهو النموذج المقبول على نطاق واسع من الإنسان الخلايا البدينة المخاطية ^3-5. يمكن بسهولة وبشكل موثوق أن تقاس الصاري مكون الخلية الحبيبية والوسيط حساسية β-هيكسوزامينيداز، التي يتم تحريرها خطيا جنبا إلى جنب مع الهيستامين من الخلايا البدينة ^6، من خلال رد الفعل مع ركيزة الفلورة، مما أسفر عن كثافة مضان قابلة للقياس في فحص صفيحة ميكروسكوبية التي هي قابلة لل دراسات عالية الإنتاجية ^1. نشرت أصلا من قبل نعال وآخرون. ^1، ونحن قد تكيفت هذه مقايسة تحبب لفحص سالأدوية و المواد السامة والتظاهر واستخدامه هنا.

التريكلوسان هي وكيل واسع الطيف مضاد للجراثيم التي هي موجودة في كثير من المنتجات الاستهلاكية وعثر عليها لتكون المساعدات العلاجية في الإنسان مرض حساسية الجلد ^7-11، على الرغم من أن آلية هذا التأثير غير معروف. هنا علينا أن نظهر مقايسة للتأثير على التريكلوسان تحبب الخلايا البدينة. أظهرنا مؤخرا أن التريكلوسان يؤثر بقوة ظيفة الخلايا البدينة ^2. في محاولة لتجنب استخدام مذيب عضوي، يذوب التريكلوسان مباشرة إلى المخزن المؤقت مائي مع الحرارة والتحريك، وتأكيد تركيز الناتجة باستخدام القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس (باستخدام ε ₂₈₀ = 4،200 L / M / سم) ^12. هذا البروتوكول لديه القدرة على أن تستخدم مع مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية لتحديد آثارها على تحبب الخلايا البدينة، وعلى نطاق أوسع، إمكاناتهم حساسية.

Introduction

الخلايا البدينة وحبيبات غاية الخلايا المناعية المستجيب أن تكون بمثابة الوسطاء الرئيسيين في الربو، والحساسية، والطفيليات الدفاع والتسرطن ^13-16. يقيمون في ما يقرب من كل الأنسجة أوعية دموية ^15، حيث تخزن بشكل آمن وسطاء حساسية والتهابات في حبيبات هيولية حتى المنشط لdegranulate. تحبب هو إيماس من حبيبات غشاء محدد، مما يؤدي إلى إطلاق وسطاء الصيدلانية الفعالة مثل الهستامين، تريبتاز، و leukotrienes ^15. هذه النتائج العملية في الشروع في النوع الأول من تفاعلات فرط الحساسية التي تعتبر بالغة الأهمية في تصاعد الدفاع ضد الطفيليات وكذلك الشروع في استجابات حساسية، الربو، ومسببة للسرطان ^15.

الخلايا البدينة والخلايا القاعدية مستقبلات FcεRI، المستقبلات عالية تقارب لالغلوبولين المناعي E (إيج) ^17. التعرض لمسببات الحساسية أو مستضد يسبب تجميع عدة مستقبلات FcεRI فريق الخبراء الحكومي الدولي متجهة الى ^17، وهذا هو قس يسمى ب "يشابك" من مستقبلات القطعة Fc فريق الخبراء الحكومي الدولي متجهة الذي يبدأ عملية تحبب: سلسلة من الأحداث التيروزين الفسفرة، وتفعيل فسفوليباز C، هروب رأس المال من الكالسيوم من مخازن الداخلية، وتدفق الكالسيوم إلى داخل الخلية ^18. هذا التدفق الكالسيوم ضروري للتحبب، و، علاوة على ذلك، يشير الانصهار الحبيبية مع الغشاء قبل أن يتسببوا إيماس الحبيبية ^15. تجريبيا، وهو حامل الأيون الكالسيوم يمكن أن تستخدم لنقل الكالسيوم مباشرة عبر غشاء الخلية ^19، والذي يتجاوز أساسا عن نقل الإشارة الخطوات من قبل لتدفق الكالسيوم الخطوة ^20، والسماح لتحديد مسار هدفا بواسطة مادة سامة على أنها المنبع أو المصب الكالسيوم مما يشير ^20.

تحبب يمكن قياسها بسرعة وفعالية من خلال رصد إطلاق سراح β-هيكسوزامينيداز إلى طاف الخلية، والتي يتم تحريرها خطيا من حبيبات جنبا إلى جنب مع الهستامين ^6، ولكن أناأسهل بكثير للكشف عن رد فعل بسيط باستخدام انزيم الركيزة وقارئ صفيحة ميكروسكوبية لفحص المنتج الفلورسنت. ويستند هذا الاختبار صفيحة ميكروسكوبية، على النحو المفصل في قسم البروتوكول، بناء على وسيلة قوية ضعت أصلا من قبل نعال وآخرون. ^1، التي تقيس انشقاق الركيزة الفلورة 4-ميثيل مبيليفيريل-N-أسيتيل β-D-β-glucosaminide من قبل هيكسوزامينيداز. قمنا بتعديل مقايسة لاختبار آثار المخدرات والمواد السامة، مع تسليط الضوء التريكلوسان هنا. هذا الأسلوب الكمي موثوق تحبب، هو بديل رخيص الثمن، على سبيل المثال، تدفق طرق الكشف على أساس cytometric ^21، ولديه القدرة على تقديم نفسه بشكل جيد لفحص عالية الإنتاجية من مجموعة واسعة من الأدوية المضادة للحساسية، وكذلك جهاز المناعة أو المواد الكيميائية المسببة للحساسية. هذه النقطة الأخيرة لها أهميتها ولا سيما في ضوء لعام 2007 تقرير المجلس القومي للبحوث "اختبار السمية في القرن ^{الحادي و21:} رؤية وSTRATايجى "( http://www.nap.edu/openbook.php؟record_id=11970 )، الذي يدعو لتطوير اختبارات السموم عالية الإنتاجية التي تستخدم خلية ثقافة للحد من استخدام مكلفة من حيوانات المختبر التقليدية مثل الفئران. بروتوكول تحبب التي وضعتها نعال وآخرون. ¹ وتعديلها من قبلنا ^2، يستخدم خط الخلية RBL-2H3، الذي هو نموذج مقبولة تماما مثلي إلى الإنسان الخلايا البدينة المخاطية أو قعدات ^3-5. (ترد تفاصيل طرق لزراعة الخلايا RBL-2H3 في هاتشينسون وآخرون ^22). يمكن أن المرجح أن تتكيف هذا الاختبار إلى أي المرفقة نوع الخلايا البدينة.

التريكلوسان (TCS) هو المضادة للميكروبات واسعة الطيف التي تم استخدامها لأكثر من 30 عاما في المستشفيات، ومنتجات العناية الشخصية، والسلع الاستهلاكية ^23،24. طريقة عمل لخاصية مضادة للميكروبات TCS هو تثبيط الحيوي الدهنية حمض، من المحتمل عن طريق تثبيط enoyl-أسيلالناقل البروتين اختزال ^25،26. انها وجدت في جميع أنحاء العالم في مجموعة واسعة من المنتجات الاستهلاكية مثل هلام الاستحمام، وغسول اليد ومعجون الأسنان وغسول الفم، وفي صابون اليد بتركيزات تصل إلى 0.3٪ أو 10 ملم ^24. وقد أدى الاستخدام الواسع النطاق للTCS في المستويات التي يمكن اكتشافها في البشر ^و27-29 في الأنهار والجداول ^30. وهناك دراسة أجريت من قبل Allmyr وآخرون. أثبتت أن ²⁷ TCS وعناصره موجودة في كل من البلازما واللبن من أمهات المرضعات. الأهم من ذلك، يتم امتصاصه بسهولة TCS في الجلد ^31-37. Queckenberg وآخرون. وجد ³⁷ ~ 10٪ من امتصاص ~ 70 ملم TCS كريم في الجلد البشري في غضون 12 ساعة، مما أدى إلى تركيز كبير في الجلد، حيث تتواجد الخلايا البدينة.

وقد تبين TCS سريريا لإدارة الإنسان مرض حساسية الجلد ^7-11، ولكن كانت الآلية التي TCS يخفف من أمراض حساسية الجلد غير معروف ^38. باستخدام صفيحة ميكروسكوبية الفلورسنت وdetaile مقايسةد في هذا الفيديو، ونحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن TCS، بتركيزات منخفضة تصل إلى 2 ميكرون، يخفف من حدة بشكل ملحوظ وظيفة الخلايا البدينة وتحبب، وتوفير تفسير محتمل لهذه البيانات السريرية ^2. وبالإضافة إلى تقديم تفسيرا لهذه المعطيات السريرية، النتائج التي توصلنا إليها في بالمر وآخرون. ² تشير إلى أن TCS تستهدف الجزيئات مما يشير المصب من تدفق الكالسيوم. ونظرا لأهمية الكالسيوم في العديد من إشارات المناعية والعمليات البيولوجية الأخرى، يمكن أن يكون TCS يحتمل أن تكون الآثار السلبية على تشكيلة واسعة من العمليات البيولوجية اللازمة. في الواقع، أظهرت Udoji وآخرون. TCS ³⁹ أن يقمع الخلايا القاتلة النشاط التحللي الإنسان الطبيعي، وظيفة المناعة الفطرية هامة أخرى.

خارج إمكاناته كأداة مساعدة العلاجية لمرض حساسية الجلد (أو، على العكس، باعتبارها immunotoxicant)، قد يكون TCS أيضا اضطرابات الغدد الصماء ^40-49. وهكذا، فإن إجراءات واضحة بشأن كيفية إعداد هذه المادة الكيميائية في حل طS من الفائدة لعلماء السموم. لأن TCS هو جزيء صغير مسعور، وغالبا ما تستخدم المركبات العضوية لجعله أكثر قابلية للذوبان في الماء. في معظم الدراسات السمية حيث تم اختبار TCS، وإعداد تشارك انحلال في الماء مع المعونة من المذيبات العضوية مثل الإيثانول، الأسيتون، أو زيت ^2،50،51. ومع ذلك، في كثير من الأحيان هذه المذيبات نشطة بيولوجيا أنفسهم، وبالتالي تعقيد تفسير المادة الكيميائية اختبار البيانات ^51. في الواقع، وفقا لRufli وآخرون. ⁵² و ⁵³ آخرين، فمن المستحسن أن حلول اختبار للتجارب السمية المائية يتم إعدادها باستخدام الطرق الفيزيائية على الطرق الكيميائية، ونظرا لإمكانات المذيبات الكيماوية لخلق التحف سمية. لقد أظهرنا سابقا أن TCS يذوب في الإيثانول بنسبة 0.24٪ / الماء (المجلد / المجلد) وsonicated لمدة 30 دقيقة يخفف من حدة RBL الصاري تحبب الخلية ^2. وقد تبين الإيثانول بتركيزات أعلى من 0.24٪ إلى تثبيط الخلايا البدينة إدناءnulation ^{54،55-أمثلة} على الآثار المحتملة التباس من المذيبات العضوية على دراسات سمية.

ليس فقط هو أنه من المهم أن تنظر في تأثير المذيبات على الكائن الحي أو الخلايا المستخدمة للدراسة، ولكن أيضا من المهم لرصد تأثير المذيبات الكيميائية على اختبار نفسه. على سبيل المثال، سكاري وآخرون. وجدت أن ⁵¹ في تذويب TCS البولي ايثيلين جلايكول (التي توجد عادة في معاجين الأسنان وغسول الفم) ضعفت تأثيرات مضادة للبكتيريا ومضادة للالترسبات في النساء أنثى صحي في حين حل في الزيوت تسبب في خسارة كاملة من وظيفة. ولذلك، فإن قدرة المذيبات المختلفة لتعدل السموم والمخدرات، بما في ذلك TCS، وينبغي النظر في الآثار في تصميم مقايسة. استخدام الزيوت أو المواد المضافة نكهة قد تتداخل مع آثار TCS في مختلف المنتجات ^50،51.

في محاولة للقضاء على الحاجة إلى استخدام المذيبات العضوية، ونحن تحسينها لدينا وسيلة لتذويب TCS ² من خلال القضاء على استخدام وسيلة سول العضويةتنفيس. في هذا البروتوكول، ونحن تذوب حبيبات TCS مباشرة إلى المخزن المؤقت مائي مع الحرارة (≤ 50 ° C)، ومن ثم تحقق من تركيز هذا المخزون TCS بواسطة القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس. هذه التحسينات ممكنة لأن TCS قابل للذوبان في الماء تصل إلى 40 ميكرومتر ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) ولقد ثبت على مقاومة التحلل عند تسخينها إلى 50 درجة مئوية ( http:// على / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) ^56،57. لدينا أيضا فائدة إضافية تتمثل في القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس، كما TCS وكما هو معروف لاستيعاب بقوة 280 نيوتن متر في ⁵⁸ مع معامل الانقراض المولي من 4،200 L / مول / سم ^12.

هذا البروتوكول يوفر وسيلة بسيطة، لكنها فعالة لإذابة حبيبات TCS في منطقة عازلة من دون المعونة من المذيبات العضوية، بما في ذلك تكاليف منخفضة والتحقق السريعمن التركيز، ويصف قوية الفلورسنت فحص صفيحة ميكروسكوبية لرصد الآثار الكيميائية على تحبب الخلايا البدينة.

Protocol

لاحظ أن جميع صفات العازلة مدرجة في جدول في نهاية النص البروتوكول. DAY 1: 1. إعداد الخلايا خطة من 96 جيدا مخطط الإعداد لوحة، وتتمحور عينات اخ…

Representative Results

عند تسخينها إلى 50 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، وطيف الامتصاص للأشعة فوق البنفسجية فيس TCS لتنتج، منحنى قوي السلس بين ~ 260 و 300 نانومتر، مع ذروة عند 280 نانومتر، كما هو مبين في الشكل 1. القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس هو، بالتالي، أداة هامة التي يمكن استخدامها لحساب تركيز، …

Discussion

في عام 2004، نعال وآخرون. ¹ وضع جهاز الاستشعار البيولوجي الخلايا البدينة للاختبار عالية الإنتاجية من تحبب. وهو فحص القوية التي تكيفنا للدراسات TCS لدينا ومفصلة في هذا الفيديو. قبل نعال وآخرون. ¹ الفحص، تحبب الخلايا البدينة قد تم تقييمها بشكل روتيني عبر β-هيكسوز?…

Materials

RBL-2H3 Cells	ATCC	CRL-2256	The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC
Triclosan/Irgasan	Sigma	72779 CAS# 3380-34-5	Should be stored in a low humidity environment
Trypsin	Gibco	25300-054 CAS# 3380-34-5
EMEM	Lonza	12-611F
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Gentamycin Sulfate	Lonza Biological Sciences	17-518
Albumin, Bovine Serum	Calbiochem	12659 CAS# 9048-46-8
Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)	Pierce	28314 CAS# 9002-93-1
HEPES	J.T Baker	4153-01 CAS# 75277-39-3
Magnesium Chloride	VWR	BDH0244-500G CAS# 7791-18-6
D-(+)-Glucose	Biomedicals	152527 CAS# 50-99-7
Potassium Chloride Crystal	J.T Baker	3046-01 CAS# 7447-40-7
Calcium chloride dihyrdate	Acros Organics	207780010 CAS# 10035-04-8
Glycine	Sigma	G8898 CAS# 56-40-6
4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)	EMD Biosciences	474502-250MG CAS # 37067-30-4	Wrap in foil – is light-sensitive
Anti-DNP Mouse IgE	Sigma	D8406	Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.
DNP-BSA	Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University		Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018
Calcium Ionophore A23187	Sigma	C75-22-1mg	Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully
DMSO	Sigma	D2650 CAS# 67-68-5
Acetic Acid	VWR	BDH3094-2 CAS# 64-19-7
Anhydrous Sodium Carbonate	Sigma	222321 CAS# 497-19-8
Sodium Chloride	Sigma	71376 CAS# 7647-14-5
Hydrochloric Acid	VWR	BDH3026 CAS# 7647-01-0
Reference Buffer, pH 7	VWR	BDH5046
Reference Buffer, pH 10	VWR	BDH5072
Reference Buffer, pH 4	VWR	BDH5018
pH electrode storage solution	VWR	14002-828
			Equipment:
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
DU 7500 Spectrophotometer	Beckmann	No longer sold
Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software	BioTek	Module S
Hematocytometer	Hausser Scientific	3110
7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate	VWR	97042-634
Centrifuge	Eppendorf	5430
Tissue culture water bath	VWR	Model# 89032-206
Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood)	The Baker Company	Model# SG403A-HE
Tissue culture incubator	ThermoScientific	Model# 3598
Pipetman	VWR		Range: P2-P1000
Balance	Mettler Toledo	Model# AG204
pH meter	Symphony/VWR	Model# SB70P
Pipet-Aid	Drummond Scientific	4-000-100
Combitip dispenser	Eppendorf	4981 000.019
			Recipes:
Name	Recipe	Notes
Acetate Buffer, pH 4.4	Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml	Sterile Filter into autoclaved glass bottle
Substrate (4-MU)	Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again	For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer
Glycine Carbonate Buffer, pH 10	26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10	Sterile filter into autoclaved glass bottle
Tyrodes (2 L), pH 7.4	135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4	Sterile filter into autoclaved glass bottle
RBL Cell Media	Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.	Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle
			Plastic material used:
Material Name	Company	Catalogue Number	Type of Plastic
200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack	VWR	53509-009	polypropylene
1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery	VWR	89003-420	polyethylene
10 µl micro tip low binding sterile	VWR	14217-704	polypropylene
Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force	VWR	20170-038	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-178	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-103	polypropylene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	690175	polystyrene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	658175	polystyrene
CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	607180	polystyrene
CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	710180	polystyrene
CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	606180	polystyrene
CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	760180	polystyrene
1 cm cuvettes	N/A	N/A	polystyrene
CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate	Greiner Bio One	655086	polystyrene
Combitips	Eppendorf	022266501	Polypropylene/ polyethylene