Assay Microplate כדי להעריך את ההשפעות כימיות על degranulation תא התורן RBL-2H3: השפעות של Triclosan ללא שימוש בממס אורגני

Summary

degranulation תא פיטום, השחרור של מתווכים אלרגיים, הוא חשוב באלרגיה, אסתמה, והגנה טפילה. כאן אנו מדגימים טכניקות ¹ להערכת השפעות של תרופות וtoxicants על degranulation, מתודולוגיה מנוצל לאחרונה להפגין השפעה המעכבת החזקה של סוכן אנטיבקטריאלי triclosan ^2.

Abstract

תאי פיטום ממלאים תפקידים חשובים במחל אלרגיות והגנה חיסונית נגד טפילים. לאחר הפעלה (למשל, על ידי אלרגן), הם degranulate, תהליך שתוצאת exocytosis של מתווכים אלרגיים. אפנון של degranulation תא תורן על ידי תרופות וtoxicants עשוי להיות השפעה חיובית או שלילית על בריאות אדם. תפקוד תא תורן כבר גזור בפירוט עם השימוש בתאי פיטום לוקמיה basophilic עכברוש (RBL-2H3), מודל מקובל של תא פיטום אדם רירי ^3-5. מרכיב תורן תא גרגר והמתווך אלרגי β-hexosaminidase, אשר שוחרר לינארית בד בבד עם היסטמין מתאי פיטום ^6, ניתן למדוד בקלות ובאופן אמין באמצעות תגובה עם מצע fluorogenic, מניב למדידה עוצמת הקרינה בassay microplate שניתן ל מחקרי תפוקה גבוהה ^1. פורסם במקור על ידי Naal et al. ^1, יש לנו להתאים assay degranulation זה להקרנה Oתרופות F ו toxicants ומדגים את השימוש בו כאן.

Triclosan הוא סוכן ספקטרום רחב נגד חיידקים שנמצא במוצרים צריכה רבים וכבר מצא להיות סיוע טיפולי במחלת עור אלרגית אנושית ^7-11, למרות שהמנגנון להשפעה זו אינה ידוע. כאן אנו מדגימים assay להשפעת על triclosan degranulation תא תורן. לאחרונה הראו כי triclosan מאוד משפיע על תפקוד תא תורן ^2. במאמץ להימנע משימוש בממס אורגני, triclosan מתמוסס ישירות לתוך המאגר מימית עם חום וערבוב, וריכוז כתוצאה הוא אישר שימוש בספקטרופוטומטריה UV-Vis (באמצעות ε ₂₈₀ = 4200 L / M / ס"מ) ^12. פרוטוקול זה יש פוטנציאל לשמש במגוון רחב של חומרים כימיים כדי לקבוע את ההשפעות שלהם על degranulation תא תורן, ובאופן רחב יותר, פוטנציאל אלרגי שלהם.

Introduction

תאי פיטום הם מאוד מגורענים מפעיל תאים חיסוניים המשמשים כמתווכים עיקריים באסטמה, אלרגיות, טפילים והגנת ^13-16 היווצרות הסרטן. הם מתגוררים כמעט בכל רקמת vascularized ^15, שבו הם בבטחה לאחסן מתווכים אלרגיים ודלקתיים בגרגרי cytoplasmic עד הופעלו לdegranulate. Degranulation הוא exocytosis של גרגרי קרום נכנסים, מה שגורם לשחרור של מתווכים פעילים פרמקולוגית כגון היסטמין, tryptase, ולאוקוטריאנים ^15. תוצאות תהליך זה בתחילתו של הסוג אני תגובות רגישות יתר שהם קריטיים בהגנה מפני טפילי הרכבה, כמו גם ייזום תגובות אלרגיות, אסתמה, ומסרטנות ^15.

תאי מאסט ובזופילים לבטא קולטנים FcεRI, הקולטנים גבוהה הזיקה לאימונוגלובולין E (IgE) ^17. חשיפה לאלרגן או אנטיגן גורמת לצבירה של קולטנים FcεRI IgE בכריכות מרובים ^17, וזה של זהO-נקרא "crosslinking" של קולטני Fc IgE בכריכות שיוזמת את תהליך degranulation: מפל של אירועי טירוזין זרחון, ההפעלה של פוספוליפאז C, זרימת הסידן מהחנויות פנימיות, וזרם של סידן לתוך התא ^18. זרימת סידן זה היא הכרחי עבור degranulation, ועוד יותר, מאותתת היתוך גרגיר עם הקרום לפני גרימת exocytosis גרגר ^15. בניסוי, ionophore סידן יכול לשמש לסיד מעבורת ישירות על פני קרום תא ^19, שלמעשה עוקף את כל התמרה אות שלבים לפני שלב זרימת סידן ^20, המאפשר את זיהוי של יעד על ידי מסלול toxicant כמו להיות במעלה הזרם או במורד הזרם של סידן איתות ^20.

Degranulation ניתן למדוד במהירות וביעילות על ידי ניטור שחרורו של β-hexosaminidase לsupernatant התא, אשר שוחרר לינארית מהגרגרים לצד היסטמין ^6, אבל אניזה הרבה יותר קל לזהות באמצעות תגובת אנזים-מצע וקורא microplate פשוט assay מוצר הניאון. assay microplate זה, כמפורט בסעיף הפרוטוקול, מבוסס על שיטה שפותחה במקור על ידי חזקה Naal et al. ^1, אשר מכמתת את המחשוף של מצע fluorogenic 4-methylumbelliferyl-N-אצטיל-β-D-β-glucosaminide ידי hexosaminidase. יש לנו שונה assay להשפעות של תרופות ובדיקת toxicants, עם triclosan מודגש כאן. שיטה זו אמינה מכמתת degranulation, הוא אלטרנטיבה זולה, למשל, שיטות זיהוי ²¹ המבוססים על תזרים cytometric, ויש לו הפוטנציאל להשאיל את עצמה יפה להקרנת תפוקה גבוהה של מגוון רחב של תרופות לטיפול באלרגיה, כמו גם immunotoxic או כימיקלים אלרגניים. הנקודה אחרונה זו חשובה במיוחד לאור בדיקת רעילות "2007 דו"ח המועצה הלאומי למחקר במאה ה ^-21: חזון וstrategy "(http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970), הפועל למען הפיתוח של בדיקות רעלים תפוקה גבוהה המנצלות תרבית תאים כדי להקטין את השימוש יקר של חיות מעבדה מסורתיות כגון עכברים. פרוטוקול degranulation שפותח על ידי Naal et al. ¹ והותאם על ידינו ^2, מנצל את שורת תאי RBL-2H3, שהוא מודל מקובל היטב הומולוגית לתאי פיטום ריריים אדם או בזופילים ^3-5. (שיטות לתאי RBL-2H3 culturing מפורטות באצ'ינסון ואח'. ^22). assay זה סביר יכול להיות מותאם לכל סוג תא תורן מצורף.

Triclosan (TCS) הוא מיקרוביאלית ספקטרום הרחב שהיה בשימוש כבר יותר מ -30 שנים בבתי חולים, מוצרי טיפוח, ומוצרים צריכה ^23,24. אופן פעולה אופייני למיקרוביאלית של TCS הוא העיכוב של סינתזת חומצות שומן, ככל הנראה על ידי עיכוב enoyl-acylרדוקטאז מנשא חלבון ^25,26. הוא נמצא בעולם במגוון רחב של מוצרים צריכה, כגון ג'ל רחצה, קרם ידי, משחת שיניים, מי פה, וסבונים ביד בריכוזים של עד 0.3% או 10 מ"מ ^24. שימוש נרחב של TCS הביא רמות לגילוי בבני אדם ^וב27-29 נהרות ונחלים ^30. מחקר שנעשה על ידי Allmyr et al. הוכיח כי ²⁷ TCS ומטבוליטים שלה נמצאים גם הפלזמה וחלב מאמהות מיניקות. חשוב לציין, TCS נספג בקלות אל תוך העור ^31-37. Queckenberg et al. ~ ³⁷ מצאו קליטת 10% מ~ 70 מ"מ TCS קרם לעור אנושי בתוך 12 שעות, וכתוצאה מכך הריכוז משמעותי בעור, שבו תאי פיטום מתגוררים.

TCS הוכח קליני כדי לנהל את מחלת עור אלרגית אנושית ^7-11, אבל המנגנון שבאמצעותו TCS מקל על מחלות עור אלרגיות כבר ידוע ^38. שימוש detaile assay microplate הניאוןד בסרטון הזה, אנחנו לאחרונה הוכיחו כי TCS, בריכוזים נמוכים כמו 2 מיקרומטר, פוגם באופן משמעותי את תפקוד תא תורן וdegranulation, מתן הסבר פוטנציאל לנתונים קליניים אלה ^2. בנוסף למתן הסבר לנתונים קליניים אלה, הממצאים שלנו בפאלמר et al. ² מציעים לי TCS מטרות מולקולות איתות במורד הזרם של זרימת סידן. , TCS עלול להיות בשל חשיבותו של הסידן באיתות חיסונית רבים ותהליכים ביולוגיים אחרים השפעות שליליות על מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים הדרושים. למעשה, Udoji et al. הראו כי ³⁹ TCS מדכא פעילות תאי רוצח טבעית אנושית ממס, תפקוד מערכת החיסון מולדים חשוב נוסף.

מעבר לפוטנציאל שלה ככלי עזר טיפולי במחלת עור אלרגית (או, לחלופין, כimmunotoxicant), TCS יכול להיות גם האנדוקרינית משבש ^40-49. לפיכך, נוהל ברור על איך להכין כימיקל זה בפתרון אנישל עניין לtoxicologists. בגלל TCS הוא מולקולה הידרופובי קטנה, כלי רכב אורגניים משמשים לעתים קרובות כדי להפוך אותו ליותר מסיס במים. ברוב המחקרים רעילות שבו TCS כבר נבדקו, הכנה כרוכה בפירוק במים בעזרת ממס אורגני כגון אתנול, אצטון, או שמן ^2,50,51. עם זאת, לעתים קרובות פעמים ממסים אלה הן פעילים מבחינה ביולוגית את עצמם, ובכך סבכו את הפרשנות של הבדיקה כימי נתונים ^51. למעשה, על פי Rufli et al. ⁵² ואחרים ^53, מומלץ שפתרונות בדיקה לניסויים רעילות מים מוכנים באמצעות שיטות פיסיות על פני שיטות כימיות, בשל הפוטנציאל של ממסים כימיים כדי ליצור חפצים רעילות. יש לנו הראינו בעבר כי TCS מומס באתנול / מים (כרך / כרך) 0.24% וsonicated למשך 30 דקות dampens degranulation תא תורן RBL ^2. אתנול בריכוזים גבוהים יותר מאשר 0.24% הוכח לצנן degra תא תורןnulation ^{54,55-דוגמאות} להשפעות שעלולים להיות המבלבלות של ממסים אורגניים על מחקרים רעילות.

לא רק שזה חשוב להביא בחשבון את ההשפעה של ממסים על האורגניזם או תאים המשמשים למחקר, אבל גם זה חשוב לעקוב אחר ההשפעה של ממס בכימי המבחן עצמו. לדוגמה, Skaare et al. מצאו כי ⁵¹ המסת TCS בפוליאתילן גליקול (נפוץ במשחות שיניים ושטיפת פה) נחלשו השפעות אנטי בקטריאלי ואנטי פלאק בנשים נשיות בריאים בזמן פירוק בשמנים נגרם אובדן תפקוד מלא. לכן, היכולת של ממסים שונים כדי לווסת toxicant וסמים, כולל TCS, אפקטים יש לשקול בעיצוב assay. שימוש בשמנים או תוספי טעם עלול להפריע את ההשפעות של TCS במוצרים שונים ^50,51.

במאמץ למנוע את הצורך בשימוש בממסים אורגניים, שיפרנו על השיטה שלנו להמסת TCS ² על ידי ביטול השימוש בסול אורגנילפרוק. בפרוטוקול הנוכחי, אנו לפזר גרגרי TCS ישירות לתוך המאגר מימית עם חום (≤ 50 מעלות צלזיוס), ולאחר מכן לוודא את הריכוז של מניית TCS זה על ידי ספקטרופוטומטריה UV-Vis. שיפורים אלו אפשריים כי TCS הוא מסיס במים עד 40 מיקרומטר (http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf) והוכח להתנגד השפלה כאשר מחומם ל -50 מעלות צלזיוס (http:/ / Oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf) ^56,57. יש לנו גם יתרון נוסף של ספקטרופוטומטריה UV-Vis, כמו TCS ידוע גם לקלוט חום ב280 ננומטר ⁵⁸ עם מקדם הכחדה טוחנת של 4,200 ליטר / מול / ¹² ס"מ.

פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה, אך יעילה לפזר גרגרי TCS למאגר ללא סיוע של ממס אורגני, ובכלל זה בעלות נמוכה ואימות מהירהריכוז, ומתאר assay microplate ניאון רב עוצמה למעקב אחר השפעות כימיות על degranulation תא תורן.

Protocol

שים לב שכל מתכוני החיץ כלולים בטבלה בסוף טקסט הפרוטוקול. יום 1: 1. הכנת התאים לתכנן את 96 גם התקנת צלחת תכנית, שבמרכזה דגימות בדיקה בפריסה …

Representative Results

כאשר מחומם ל -50 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות, את ספקטרום ספיגת UV-Vis לTCS מייצר עקומה חזקה, חלק בין ~ 260 ו 300 ננומטר, עם שיא ב 280 ננומטר, כפי שמוצגת באיור 1. ספקטרופוטומטריה UV-Vis היא, אפוא, כלי חשוב שיכול להיות מנוצל לחישוב ריכוז, שכן מקדם הקליטה הטוחנת שפורסם ב 280 ננומטר הוא 4,200 ליטר / מ?…

Discussion

בשנת 2004, Naal et al. ¹ פיתחה biosensor תא תורן לבדיקת תפוקה גבוהה של degranulation. זה assay חזק שיש לנו להתאים ללימודי TCS ומפורט בסרטון זה. לפני Naal et al. Assay ^1, degranulation תא תורן היה להעריך באופן שגרתי באמצעות ^59-61 β-hexosaminidase, אבל השיטות המוקדמות אלה מנוצלים fluorometers שבדגימה אחת היי…

Materials

RBL-2H3 Cells	ATCC	CRL-2256	The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC
Triclosan/Irgasan	Sigma	72779 CAS# 3380-34-5	Should be stored in a low humidity environment
Trypsin	Gibco	25300-054 CAS# 3380-34-5
EMEM	Lonza	12-611F
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Gentamycin Sulfate	Lonza Biological Sciences	17-518
Albumin, Bovine Serum	Calbiochem	12659 CAS# 9048-46-8
Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)	Pierce	28314 CAS# 9002-93-1
HEPES	J.T Baker	4153-01 CAS# 75277-39-3
Magnesium Chloride	VWR	BDH0244-500G CAS# 7791-18-6
D-(+)-Glucose	Biomedicals	152527 CAS# 50-99-7
Potassium Chloride Crystal	J.T Baker	3046-01 CAS# 7447-40-7
Calcium chloride dihyrdate	Acros Organics	207780010 CAS# 10035-04-8
Glycine	Sigma	G8898 CAS# 56-40-6
4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)	EMD Biosciences	474502-250MG CAS # 37067-30-4	Wrap in foil – is light-sensitive
Anti-DNP Mouse IgE	Sigma	D8406	Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.
DNP-BSA	Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University		Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018
Calcium Ionophore A23187	Sigma	C75-22-1mg	Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully
DMSO	Sigma	D2650 CAS# 67-68-5
Acetic Acid	VWR	BDH3094-2 CAS# 64-19-7
Anhydrous Sodium Carbonate	Sigma	222321 CAS# 497-19-8
Sodium Chloride	Sigma	71376 CAS# 7647-14-5
Hydrochloric Acid	VWR	BDH3026 CAS# 7647-01-0
Reference Buffer, pH 7	VWR	BDH5046
Reference Buffer, pH 10	VWR	BDH5072
Reference Buffer, pH 4	VWR	BDH5018
pH electrode storage solution	VWR	14002-828
			Equipment:
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
DU 7500 Spectrophotometer	Beckmann	No longer sold
Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software	BioTek	Module S
Hematocytometer	Hausser Scientific	3110
7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate	VWR	97042-634
Centrifuge	Eppendorf	5430
Tissue culture water bath	VWR	Model# 89032-206
Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood)	The Baker Company	Model# SG403A-HE
Tissue culture incubator	ThermoScientific	Model# 3598
Pipetman	VWR		Range: P2-P1000
Balance	Mettler Toledo	Model# AG204
pH meter	Symphony/VWR	Model# SB70P
Pipet-Aid	Drummond Scientific	4-000-100
Combitip dispenser	Eppendorf	4981 000.019
			Recipes:
Name	Recipe	Notes
Acetate Buffer, pH 4.4	Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml	Sterile Filter into autoclaved glass bottle
Substrate (4-MU)	Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again	For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer
Glycine Carbonate Buffer, pH 10	26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10	Sterile filter into autoclaved glass bottle
Tyrodes (2 L), pH 7.4	135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4	Sterile filter into autoclaved glass bottle
RBL Cell Media	Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.	Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle
			Plastic material used:
Material Name	Company	Catalogue Number	Type of Plastic
200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack	VWR	53509-009	polypropylene
1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery	VWR	89003-420	polyethylene
10 µl micro tip low binding sterile	VWR	14217-704	polypropylene
Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force	VWR	20170-038	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-178	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-103	polypropylene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	690175	polystyrene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	658175	polystyrene
CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	607180	polystyrene
CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	710180	polystyrene
CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	606180	polystyrene
CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	760180	polystyrene
1 cm cuvettes	N/A	N/A	polystyrene
CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate	Greiner Bio One	655086	polystyrene
Combitips	Eppendorf	022266501	Polypropylene/ polyethylene