유기 용매를 사용하지 않고 트리클로산의 효과 : RBL-2H3 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 평가하는 마이크로 분석 실험

Summary

비만 세포의 탈과립, 알레르기 중재자의 릴리스는, 알레르기, 천식, 및 기생충 방어에 중요합니다. 여기에 우리가 탈과립에 대한 약물 및 독성 물질의 영향을 평가하기위한 방법 ^1을 보여, 방법론은 최근 항균제 트리클로산 ^2의 강력한 억제 효과를 나타낸다 활용.

Abstract

비만 세포는 알레르기 질환과 기생충에 대한 면역 방어에 중요한 역할을한다. 일단 (알레르겐에 의해 예) 활성화, 그들은 degranulate, 프로세스가 알레르기 중재자의 exocytosis에 결과. 약물 및 독성 물질에 의한 비만 세포의 탈과립의 변조는 인간의 건강에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. 비만 세포 기능은 쥐 염기성 백혈병 비만 세포의 사용 (RBL-2H3), ^3-5 인간의 점막 비만 세포의 널리 사용되는 모델을 자세히 해부하고있다. ⁶ 마스트 세포에서 히스타민과 협력하여 선형 출시 비만 세포 과립 구성 요소와 알레르기 중재자 β-헥 소사 미나는, 쉽게 신뢰성에 대한 의무가 마이크로 분석에서 측정 형광 강도를 산출, 형광 기질과의 반응을 통해 측정 할 수있다 높은 처리량 연구 ^1. 원래이 NaAl 등 ^1.에 의해 게시, 우리는 검사 O이 탈과립 분석을 적응F 약물 및 독성 물질과 여기에서의 사용을 보여줍니다.

트리클로산은 많은 소비자 제품에 존재하며이 효과에 대한 메커니즘은 알 수 있지만, 인간의 알레르기 성 피부 질환 ^7-11 치료 도움이 될 발견되었습니다 광범위한 스펙트럼 항균 에이전트입니다. 여기에서 우리는 비만 세포 탈과립에 트리클로산의 효과에 대한 분석을 보여줍니다. 우리는 최근 트리클로산 강하게 비만 세포의 ^{기능이 영향을} 미치는 것으로 나타났다. 유기 용매의 사용을 방지하기위한 노력의 일환으로, 트리클로산은 열 교반 수성 버퍼에 직접 용해되고, 결과 농도는 ¹² (ε ₂₈₀ = 4,200 L / M / ㎠ 사용) UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 확인됩니다. 이 프로토콜은, 더 넓게 자신의 알레르기 가능성을 비만 세포 탈과립에 미치는 영향을 결정하기 위해 다양한 화학 물질과 함께 사용할 수있는 잠재력을 가지고 있으며,.

Introduction

비만 세포는 높은 천식의 주요 매개체 역할을 면역 효과기 세포, 알레르기, 기생충 방어 및 발암 ^13-16 알갱이 있습니다. degranulate을 활성화 때까지 안전하게 세포질 과립에 알레르기와 염증 매개을 저장할 위치를 그들은 거의 모든 혈관 조직 ^15에 있습니다. 탈과립은 히스타민, tryptase 및 류코트리엔 ^15와 같은 약리학 적 활성 중재자의 릴리스에서 결과 막 바인딩 된 과립의 exocytosis에 있습니다. 유형의 시작이 처리 결과 I 기생충에 대한 방어를 장착뿐만 아니라 알레르기 천식 및 발암 응답하기 ¹⁵ 시작의 중요한 과민 반응.

비만 세포와 호염기구는 FcεRI 수용체 면역 글로불린 E (IgE에) ^17의 높은 친화력 수용체를 표현한다. 알레르겐 또는 항원에 노출 여러 IgE에 결합 FcεRI 수용체 ^17의 집계를 발생하고,이 s의티로신 인산화 이벤트, 내부 상점에서 포스 C, 칼슘 유출의 활성화 및 세포 ^18에 칼슘의 유입의 폭포 : 탈과립 프로세스를 시작 IgE에 결합 구단 수용체의 "가교"오 -라고. 이 칼슘 유입 탈과립을 위해 필요하며, 더욱, 과립 exocytosis에 ^15을 초래하기 전에 막으로 과립 융합을 알립니다. 실험적으로, 칼슘 이온 운반체 상류되거나 하류로 독성 물질에 의해 경로 대상의 식별을 허용, 직접 기본적으로 모든 신호 전달은 칼슘 유입 ²⁰ 단계 이전 단계를 거치지 세포막을 ^{19 일에} 걸쳐 셔틀 버스 칼슘을 사용할 수 있습니다 칼슘은 ²⁰ 신호.

탈과립은 히스타민 ⁶ 함께 과립에서 선형 적으로 해제 세포의 상층 액을,에 β-헥 소사 미나의 방출을 모니터링하여 신속하고 효율적으로 측정 할 수 있지만 난의 훨씬 쉽게 분석 형광 제품에 대한 간단한 효소 기질 반응 및 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 감지합니다. 같은 프로토콜 절에 자세히 설명이 마이크로 분석은에 의해 β-형광 기판의 절단 4 methylumbelliferyl-N-아세틸-β-D-glucosaminide을 정량화 원래이 NaAl 등에 의해 개발. 강력한 방법 ^1을 기반으로합니다 헥 소사 미나. 트리클로산은 여기에서 강조와 함께 우리는 약물과 독성 물질의 테스트 효과 분석을 수정했습니다. 이 방법은 신뢰성 탈과립을 정량화 예를 들어, 유세포 기반의 탐지 방법 ^21에 저렴한 대안입니다, 안티 – 알레르기 약물의 다양한 높은 처리량 검사에 잘 자신을 빌려 잠재력을 가지고뿐만 아니라, immunotoxic 또는 극성 물질. 이 마지막 점은 ^{21 세기} 2007 년 국립 연구위원회 보고서 "독성 시험에 비추어 특히 중요하다 : 비전과 스트랫EGY "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 는 마우스와 같은 전통적인 실험 동물의 비용 사용을 줄이기 위해 세포 배양을 활용 높은 처리량 독성 시험의 개발을지지한다). 이 NaAl 등 ^1.가 개발하고 우리 ^2로 수정 탈과립 프로토콜은, 상동 인간의 점막 비만 세포 나 호염기구에 ^3-5 잘 받아 들여진 모델 RBL-2H3 세포 라인을 사용합니다. (배양 RBL-2H3 세포에 대한 방법은 허친슨 등에 자세히 설명되어 있습니다. ^22). 이 분석 가능성이 장착 된 비만 세포 유형에 적용 할 수 있습니다.

트리클로산 (TCS)는 병원, 개인 배려 제품, 소비자 제품 ^23,24에서 30 년 이상 사용되어왔다 광범위한 스펙트럼 항균이다. TCS의 항균 특성에 대한 행동의 모드는 억제 enoyl-아실 의한 것으로, 지방산 생합성의 억제입니다운반 단백질 환원 ^25,26. 이 같은 샤워 젤, 핸드 로션, 치약, 양치질, 0.3 % 또는 10 mM의 최대 ²⁴ 농도에서 손을 비누와 같이 가전 제품의 넓은 범위에서 세계적으로 발견된다. TCS의 대폭적인 사용은 인간 ^27-29의 강과 하천 ^(30)에 검출 수준 귀착되었다. Allmyr 등에 의해 수행 연구. ²⁷ TCS와 그 대사 산물이 혈장과 모유로 기르는 어머니의 우유 모두에 존재하는 것을 보여 주었다. 중요한 것은, TCS는 쉽게 피부에 ^31-37로 흡수된다. Queckenberg 등. ³⁷ 비만 세포가있는 피부에 상당한 농도의 결과, 12 시간 이내에 인간의 피부에 ~ 70 밀리미터 TCS 크림 ~ 10 %의 흡수를 발견했다.

TCS는 인간의 알레르기 성 피부 질환 ^7-11을 관리하기 위해 임상 적으로 표시되었지만, TCS는 알레르기 성 피부 질환을 완화하는 메커니즘은 ³⁸ 알 수있다. 형광 마이크로 플레이트 분석 detaile를 사용하여D는이 비디오에서 우리는 최근에 2 μM의 낮은 농도 TCS는 크게 이러한 임상 데이터 ^2에 대한 잠재적 인 설명을 제공하는 비만 세포 기능과 탈과립을 꺾는 것을 보여 주었다. 이러한 임상 데이터에 대한 설명을 제공 할뿐만 아니라, 파머 등 우리의 연구 결과는. ² TCS 칼슘 유입의 하류 신호 분자 표적으로하는 것이 좋습니다. 많은 면역 및 기타 생물 학적 과정에 신호 칼슘의 중요성으로 인해, TCS는 잠재적으로 필요한 생물 학적 과정의 다양한에 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. 사실, Udoji 등. ³⁹ TCS는 또 다른 중요한 타고난 면역 기능, 인간의 자연 살해 세포의 세포 용해 활성을 억제 것으로 나타났다.

알레르기 성 피부 질환 (또는, 반대로, immunotoxicant 등)의 치료 원조로의 잠재력을 넘어, TCS는 장애 물질 ^40-49 내분비 할 수 있습니다. 따라서, 용액이 화학 물질을 준비하는 방법에 대한 명확한 절차 I독성 학자의 관심의. TCS는 작은 소수성 분자이기 때문에, 유기 차량은 종종 물에 용해성하기 위해 사용됩니다. TCS가 테스트되었습니다 가장 독성 연구에서, 준비는 에탄올, 아세톤 또는 석유 ^2,50,51 등의 유기 용매의 도움으로 물에 용해를 포함하고있다. 그러나 종종 이러한 용매 번하여 테스트 화학 물질 데이터를 ^51의 해석을 복잡하게, 자신 생물학적으로 활성 상태입니다. 사실, Rufli 등에 따라. ⁵² 등 ^53, 그것은 수생 독성 실험을위한 테스트 솔루션은 독성 아티팩트를 생성하는 화학 용제의 가능성으로 인해, 화학적 방법을 통해 물리적 인 방법을 사용하여 준비하는 것이 좋습니다. 우리는 이전 TCS는 0.24 % 에탄올 / 물 (권 / 권)에 녹여 30 분 꺾 RBL 비만 세포의 탈과립 ² 초음파 것으로 나타났습니다. 0.24 %보다 높은 농도의 에탄올 비만 세포 degra을 저해하는 표시되었습니다nulation ^54,55 – 예 독성 연구에서 유기 용제의 잠재적 인 혼란 함을 주죠 효과.

뿐만 아니라 그것은 생물체 또는 연구에 사용되는 세포에 대한 용매의 영향을 고려하는 것이 중요하지만, 또한이 시험 화학 물질 자체에 용매의 효과를 모니터링하는 것이 중요합니다. 예를 들어, Skaare 등. ⁵¹ 기름에 용해 함수의 완전한 손실이 발생하면서 폴리에틸렌 글리콜의 TCS를 (일반적으로 치약 및 구강에서 발견) 용해하는 건강한 여성 여성 안티 박테리아 및 안티 플라크 효과를 약화 것으로 나타났습니다. 따라서, 다른 용매의 능력 TCS 등 독성 물질 및 약물을 조절하는 효과를 분석 설계에 고려되어야한다. 오일이나 맛 첨가제의 사용은 다양한 제품 ^50,51에서 TCS의 효과를 방해 할 수 있습니다.

유기 용제를 사용하는 필요성을 제거하기위한 노력의 일환으로, 우리는 유기 졸의 사용을 제거하여 TCS ² 용해 우리의 방법에 따라 개선배출. 본 프로토콜에서는, 우리는 열 (≤ 50 ° C)과 수성 버퍼에 직접 TCS 과립을 분해 한 후 UV-VIS 분광 광도법으로이 TCS 주식의 농도를 확인합니다. TCS는 40 μM (최대 물에 용해하기 때문에 이러한 개선이 가능 http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) 50 ° C (가열시 분해에 저항하기 위해 표시되었습니다 http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) ^56,57. TCS도 강하게 4,200 L / 몰 / CM ^12의 몰 흡광 계수와 280 nm의 ^58에서 흡수하는 것으로 알려져 있습니다대로 우리는 또한 UV-VIS 분광 광도계의 장점이 있습니다.

이 프로토콜은 저렴한 비용과 신속한 확인 등 유기 용제의 도움없이 버퍼에 TCS 과립을 분해 할 수있는 간단하면서도 효과적인 방법을 제공합니다농도, 그리고 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 모니터링하기위한 강력한 형광 마이크로 플레이트 분석을 설명합니다.

Protocol

모든 버퍼 조리법이 프로토콜 텍스트의 끝에서 테이블에 포함되어 있습니다. DAY 1 : 1. 세포의 준비 가장자리 효과를 방지하기 위해 레이아웃을 테스트 샘플을 중심으로 96 – 웰 플레이트 설치 계획을 계획합니다. 할당 세 각 TCS 농도 시험 (항원 또는 이온 운반체의 ± 탈과립 자극제)뿐만 아니라, triplicates 자연 릴리스 (아무 탈과립 자극제…

Representative Results

50 가열하면 ° C 90 분, TCS에 대한 UV-VIS 흡수 스펙트럼은 그림 1에서 보는 바와 같이 280 nm의 피크 ~ 260, 300 nm의 사이에 강한, 부드러운 곡선을 생산하고 있습니다. 280 nm에서 발표 몰 흡광 계수는 4,200 L / 몰 / ㎠ 12 년부터 UV-VIS 분광 광도계는, 따라서 농도를 계산하는 데 이용 될 수있는 중요한 도구입니다. 우리는 TCS는 50 ° C 가열 (데이터가 표시되지 않음)에 따라, 전체 탈과립 실험의 기간 동안 ?…

Discussion

2004 년,이 NaAl 등. ¹ 탈과립의 높은 처리량 테스트를 위해 비만 세포 바이오 센서를 개발했다. 그것은 우리가 우리의 TCS 연구에 대한 적응이 비디오에 설명 한 강력한 분석이다. 이전이 NaAl 등에 ^1. 분석은 비만 세포의 탈과립은 정기적으로 β-헥 소사 미나 ^59-61 통해 평가하지만, 이러한 초기의 방법은 하나의 샘플을 한 번 읽은하는 형광 분석기를 이용하고 있었다. 중요한 것은…

Materials

RBL-2H3 Cells	ATCC	CRL-2256	The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC
Triclosan/Irgasan	Sigma	72779 CAS# 3380-34-5	Should be stored in a low humidity environment
Trypsin	Gibco	25300-054 CAS# 3380-34-5
EMEM	Lonza	12-611F
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Gentamycin Sulfate	Lonza Biological Sciences	17-518
Albumin, Bovine Serum	Calbiochem	12659 CAS# 9048-46-8
Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)	Pierce	28314 CAS# 9002-93-1
HEPES	J.T Baker	4153-01 CAS# 75277-39-3
Magnesium Chloride	VWR	BDH0244-500G CAS# 7791-18-6
D-(+)-Glucose	Biomedicals	152527 CAS# 50-99-7
Potassium Chloride Crystal	J.T Baker	3046-01 CAS# 7447-40-7
Calcium chloride dihyrdate	Acros Organics	207780010 CAS# 10035-04-8
Glycine	Sigma	G8898 CAS# 56-40-6
4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)	EMD Biosciences	474502-250MG CAS # 37067-30-4	Wrap in foil – is light-sensitive
Anti-DNP Mouse IgE	Sigma	D8406	Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.
DNP-BSA	Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University		Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018
Calcium Ionophore A23187	Sigma	C75-22-1mg	Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully
DMSO	Sigma	D2650 CAS# 67-68-5
Acetic Acid	VWR	BDH3094-2 CAS# 64-19-7
Anhydrous Sodium Carbonate	Sigma	222321 CAS# 497-19-8
Sodium Chloride	Sigma	71376 CAS# 7647-14-5
Hydrochloric Acid	VWR	BDH3026 CAS# 7647-01-0
Reference Buffer, pH 7	VWR	BDH5046
Reference Buffer, pH 10	VWR	BDH5072
Reference Buffer, pH 4	VWR	BDH5018
pH electrode storage solution	VWR	14002-828
			Equipment:
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
DU 7500 Spectrophotometer	Beckmann	No longer sold
Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software	BioTek	Module S
Hematocytometer	Hausser Scientific	3110
7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate	VWR	97042-634
Centrifuge	Eppendorf	5430
Tissue culture water bath	VWR	Model# 89032-206
Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood)	The Baker Company	Model# SG403A-HE
Tissue culture incubator	ThermoScientific	Model# 3598
Pipetman	VWR		Range: P2-P1000
Balance	Mettler Toledo	Model# AG204
pH meter	Symphony/VWR	Model# SB70P
Pipet-Aid	Drummond Scientific	4-000-100
Combitip dispenser	Eppendorf	4981 000.019
			Recipes:
Name	Recipe	Notes
Acetate Buffer, pH 4.4	Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml	Sterile Filter into autoclaved glass bottle
Substrate (4-MU)	Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again	For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer
Glycine Carbonate Buffer, pH 10	26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10	Sterile filter into autoclaved glass bottle
Tyrodes (2 L), pH 7.4	135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4	Sterile filter into autoclaved glass bottle
RBL Cell Media	Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.	Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle
			Plastic material used:
Material Name	Company	Catalogue Number	Type of Plastic
200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack	VWR	53509-009	polypropylene
1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery	VWR	89003-420	polyethylene
10 µl micro tip low binding sterile	VWR	14217-704	polypropylene
Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force	VWR	20170-038	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-178	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-103	polypropylene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	690175	polystyrene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	658175	polystyrene
CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	607180	polystyrene
CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	710180	polystyrene
CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	606180	polystyrene
CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	760180	polystyrene
1 cm cuvettes	N/A	N/A	polystyrene
CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate	Greiner Bio One	655086	polystyrene
Combitips	Eppendorf	022266501	Polypropylene/ polyethylene