Микропланшет анализа для оценки химического воздействия на RBL-2H3 дегрануляцию тучных клеток: Влияние триклозан без использования органического растворителя

Summary

Дегрануляцию тучных клеток, высвобождение медиаторов аллергии, играет важную роль в аллергии, астмы и паразитов защиты. Здесь мы показываем, методы ¹ для оценки воздействия наркотиков и токсикантов на дегрануляцию, методология недавно использовали проявляют мощное тормозящее действие антибактериальный агент триклозан ^2.

Abstract

Тучные клетки играют важную роль в аллергических заболеваний и иммунной защиты от паразитов. После активации (например, путем аллергеном), их дегрануляции, процесс, который приводит к экзоцитоз медиаторов аллергии. Модуляция дегрануляцию тучных клеток на наркотики и токсические вещества могут иметь положительные или неблагоприятное воздействие на здоровье человека. Мачта функции клеток была расчлененный подробно с использованием крыс базофильные клетки лейкоз тучных (RBL-2H3), широко распространенной моделью человеческой клетки слизистой оболочки мачта ^3-5. Мачта компонент гранул клеток и аллергический посредник β-гексозаминидазы, которая распространяется линейно в тандеме с гистамина из тучных клеток ^6, можно легко и надежно измерять посредством реакции с флуорогенного субстрата с образованием измеримые интенсивности флуоресценции в микропланшет-анализа, который поддается высокой пропускной исследования ^1. Первоначально опубликовано Naal соавт. ^1, мы адаптировали эту дегрануляции тест для скрининга OF наркотиков и токсикантов и продемонстрировать его использование здесь.

Триклозан широким спектром антибактериального агента, который присутствует во многих потребительских товарах и было обнаружено, что терапевтический помощь в человеческих аллергических заболеваний кожи ^7-11, хотя механизм этого эффекта неизвестна. Здесь мы показываем, анализа на эффект триклозана на дегрануляцию тучных клеток. Недавно мы показали, что триклозан сильно влияет на функции клеток мачты ^2. В попытке избежать использование органических растворителей, триклозан растворяли непосредственно в водном буфере с высокой температурой и перемешивании, и полученную концентрации подтверждена с помощью УФ-и видимой области спектра (с использованием ε ₂₈₀ = 4200 л / M / см) ^12. Этот протокол имеет потенциал для использования с различными химическими веществами, чтобы определить их воздействие на дегрануляцию тучных клеток, и более широко, их аллергический потенциал.

Introduction

Тучные клетки высоко гранулированный иммунные эффекторные клетки, которые служат ключевыми медиаторами при астме, аллергии, паразиты обороны и канцерогенез ^13-16. Они живут почти в каждой ткани васкуляризированной ^15, где они безопасно хранить аллергических и воспалительных медиаторов в цитоплазматических гранул до момента активации к дегрануляции. Дегрануляция является экзоцитоз мембраносвязанных гранул, что приводит к выделению фармакологически активных медиаторов, таких как гистамин, триптазы и лейкотриены ^15. Этот процесс приводит к инициированию типа я реакции гиперчувствительности, которые являются критическими в монтажной защиту против паразитов, а также инициирование аллергический, астматический, и канцерогенных ответов ^15.

Тучные клетки и базофилы выразить FcεRI рецепторов с высоким сродством рецепторы для иммуноглобулина Е (IgE) ^17. Воздействие аллергеном или антигеном вызывает агрегации множественного IgE-связанных рецепторов FcεRI ^17, и именно с этойо-называемый "сшивание" от IgE-связанного Fc рецепторов, который инициирует процесс дегрануляции: каскад событий фосфорилирования тирозина, активацию фосфолипазы С, отток кальция из внутренних запасов и приток кальция в клетку ^18. Этот приток кальция необходимо для дегрануляции, и, кроме того, сигналы гранул сплав с мембраной до возникновения экзоцитоз гранул ^15. Экспериментально кальциевого ионофора может быть использован для трансфера кальций непосредственно через клеточную мембрану ^19, которая по существу обходит все передачи сигнала шаги перед стадией приток кальция ^20, что позволяет для идентификации пути мишени токсикантов как до, либо после кальциевой сигнализации ^20.

Дегрануляция могут быть измерены быстро и эффективно, контролируя высвобождение из β-гексозаминидазы в клеточном супернатанте, которая распространяется линейно из гранул вместе с гистамином ^6, но ягораздо проще обнаружить с помощью простой фермент-субстрат реакции и микропланшет-ридера для анализа флуоресцентного продукта. Этот планшет анализа, как указано в протоколе раздел основан на надежный метод, первоначально разработанный Naal соавт. ^1, который количественно расщепление флуорогенный субстрат 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид на β- гексозаминидазы. Мы модифицировали анализа для проверки воздействия наркотиков и токсикантов, с триклозан отраженных здесь. Этот метод надежно количественно дегрануляции, является недорогой альтернативой, например, проточной цитометрии методах выявления на основе ^21, и имеет потенциал, чтобы оказать себе приятно, чтобы высокопроизводительного скрининга из широкого спектра антиаллергенные препараты, а также иммунотоксические или аллергенных химикатов. Этот последний пункт особенно важен в свете в 2007 году Национальный научно-исследовательский совет доклад "испытания на токсичность в ^21-м веке: видение и Stratгии »( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), которая выступает за развитие высокой пропускной токсикологии испытания, которые используют культуру клеток сократить использование дорогостоящих традиционных лабораторных животных, таких как мыши. Дегрануляции протокол, разработанный Naal соавт. ¹ и модифицирована нами ^2, использует RBL-2H3 клеточная линия, которая является широко признанным модель гомологичных человеческих клеток слизистой оболочки мачты или базофилы ^3-5. (Методы культивирования RBL-2H3 клетки описаны в Hutchinson и соавт. ^22). Этот анализ, вероятно, может быть адаптирована к любой тип мачты прилагается клетки.

Триклозан (TCS) является широким спектром антимикробного, который был использован для более чем 30 лет в больницах, средства личной гигиены, товары народного потребления ^23,24. Механизм действия антимикробных характерные для TCS является ингибирование жирных кислот биосинтез, вероятно, путем ингибирования еноил-ацилбелком-носителем редуктазы ^25,26. Он находится во всем мире в широком диапазоне потребительских продуктов, таких как гель, лосьон для рук, зубную пасту, жидкость для полоскания рта, а в руке мыло в концентрации до 0,3% или 10 мМ ^24. Широкое применение TCS привело к обнаружению уровней у человека ^27-29 и в реках и ручьях ^30. Исследование, проведенное Allmyr соавт. Показали, что ²⁷ TCS и его метаболиты присутствуют как в плазме, и молоко от кормящих матерей. Важно отметить, что TCS легко впитывается в кожу, ^31-37. Queckenberg соавт. ³⁷ найдены ~ 10% поглощение ~ 70 мМ крем TCS в человеческую кожу в течение 12 ч, в результате чего в значительной концентрации в коже, где тучные клетки находятся.

TCS было показано в клинических условиях для управления человеческой аллергических заболеваний кожи ^7-11, но механизм, посредством которого TCS уменьшает аллергические заболевания кожи была неизвестна ^38. Использование флуоресцентных detaile анализа микропланшетD В этом видео, мы недавно показали, что TCS, при таких низких концентрациях, как 2 мкм, что значительно ослабляет мачту функции клеток и дегрануляцию, обеспечивая потенциальное объяснение этих клинических данных ^2. В дополнение к предоставлению объяснение этих клинических данных, наши данные в Палмер и др.. ² показывают, что TCS цели сигнальных молекул вниз по течению притока кальция. Из-за важности кальциевой сигнализации во многих иммунологических и других биологических процессов, TCS потенциально может оказать неблагоприятное воздействие на широкий спектр необходимых биологических процессов. В самом деле, Udoji соавт. Показали, что ³⁹ TCS подавляет человека природных клеток-киллеров литической активности, еще одной важной врожденной иммунной функции.

За свой ​​потенциал в качестве терапевтической помощи при аллергических заболеваний кожи (или, наоборот, как иммунотоксикантом), TCS также может быть эндокринные нарушающими ^40-49. Таким образом, четкой процедуры по подготовке этого химического вещества в растворе яы, представляющие интерес для токсикологов. Поскольку TCS представляет собой небольшую молекулу гидрофобные органические транспортные средства часто используются, чтобы сделать его более растворимы в воде. В большинстве исследований токсичности где TCS была протестирована, препарат участвует растворения в воде с помощью органического растворителя, такого как этанол, ацетон или масло ^2,50,51. Однако зачастую этих растворителей являются биологически активными сами, что усложняет интерпретацию химический анализ данных ^51. На самом деле, в соответствии с Rufli соавт. ⁵² и др. ^53, рекомендуется, чтобы тестируемые растворы для водных экспериментов токсичности готовятся с использованием физических методов над химическими методами, в связи с возможным химических растворителей для создания токсичности артефактов. Ранее нами было показано, что TCS растворенные в 0,24% этанол / вода (об / об) и обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин гасит RBL дегрануляцию тучных клеток ^2. Этанол при более высоких концентрациях, чем 0,24%, как было показано ослабить мачта деградацией клеткиnulation ^{54,55-примеры} потенциально смешанного воздействия органических растворителей на исследования токсичности.

Это не только важно учитывать влияние растворителей на организм или клетки, используемые для исследования, но и важно для мониторинга влияния растворителя на химический тест сам. Например, скоро и соавт. ⁵¹ обнаружили, что растворение TCS в полиэтиленгликоле (обычно находится в зубные пасты и жидкости для полоскания рта) ослаблены антибактериальными и против зубного налета эффектов у здоровых женщин женщины в то время как растворение в маслах вызванный полной потере функции. Таким образом, способность различных растворителей модулировать токсических веществ и наркотиков, включая TCS, эффекты должны быть рассмотрены в тесте конструкции. Использование масла или вкусовые добавки могут мешать эффекты TCS в различных продуктах ^50,51.

В попытке устранить необходимость в использовании органических растворителей, мы улучшили наш способ растворения TCS ^2, устраняя использование органического зольвыразить. В настоящем Протоколе, мы растворяем TCS гранулы непосредственно в водный буферный раствор с выделением тепла (≤ 50 ° C), а затем проверить концентрацию этого запаса TCS УФ-и видимой области спектра. Эти усовершенствования возможно потому, TCS растворим в воде до 40 мкМ ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ), и было показано, что устойчивость к разложению при нагревании до 50 ° C ( HTTP: / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) ^56,57. У нас также есть дополнительное преимущество УФ-и видимой области спектра, а также TCS, как известно, сильно поглощают при 280 нм с ⁵⁸ коэффициент молярной экстинкции 4200 л / моль / см ^12.

Этот протокол обеспечивает простой, но эффективный способ растворить TCS гранул в буфер без помощи органического растворителя, в том числе низкой стоимости и быстрой проверкиконцентрации, и описывает мощную флуоресцентного исследования микропланшет для мониторинга химического воздействия на дегрануляцию тучных клеток.

Protocol

Отметим, что все буфера рецептов включены в таблицу в конце текста протокола. День 1: 1. Подготовка клетки План из 96-луночных схема установки пластины, центрирование образцов на макете, чтобы избежать краевых эффектов. Выделить трех повторност?…

Representative Results

При нагревании до 50 ° С в течение 90 мин, УФ-и видимой области спектра поглощения для TCS дает сильный, гладкую кривую между ~ 260 и 300 нм, с пиком при 280 нм, как показано на рисунке 1. УФ-и видимой области спектра, таким образом, важным инструментом, который может быть использован для вычисления кон…

Discussion

В 2004 году Naal соавт. ¹ разработали мачты биосенсоров ячейки для высокой пропускной тестирование дегрануляции. Это надежный анализ, который мы адаптировали для нашего исследования TCS и подробно описанная в этом видео. До Naal соавт. ¹ анализе дегрануляцию тучных клеток были обычно…

Materials

RBL-2H3 Cells	ATCC	CRL-2256	The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC
Triclosan/Irgasan	Sigma	72779 CAS# 3380-34-5	Should be stored in a low humidity environment
Trypsin	Gibco	25300-054 CAS# 3380-34-5
EMEM	Lonza	12-611F
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Gentamycin Sulfate	Lonza Biological Sciences	17-518
Albumin, Bovine Serum	Calbiochem	12659 CAS# 9048-46-8
Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)	Pierce	28314 CAS# 9002-93-1
HEPES	J.T Baker	4153-01 CAS# 75277-39-3
Magnesium Chloride	VWR	BDH0244-500G CAS# 7791-18-6
D-(+)-Glucose	Biomedicals	152527 CAS# 50-99-7
Potassium Chloride Crystal	J.T Baker	3046-01 CAS# 7447-40-7
Calcium chloride dihyrdate	Acros Organics	207780010 CAS# 10035-04-8
Glycine	Sigma	G8898 CAS# 56-40-6
4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)	EMD Biosciences	474502-250MG CAS # 37067-30-4	Wrap in foil – is light-sensitive
Anti-DNP Mouse IgE	Sigma	D8406	Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.
DNP-BSA	Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University		Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018
Calcium Ionophore A23187	Sigma	C75-22-1mg	Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully
DMSO	Sigma	D2650 CAS# 67-68-5
Acetic Acid	VWR	BDH3094-2 CAS# 64-19-7
Anhydrous Sodium Carbonate	Sigma	222321 CAS# 497-19-8
Sodium Chloride	Sigma	71376 CAS# 7647-14-5
Hydrochloric Acid	VWR	BDH3026 CAS# 7647-01-0
Reference Buffer, pH 7	VWR	BDH5046
Reference Buffer, pH 10	VWR	BDH5072
Reference Buffer, pH 4	VWR	BDH5018
pH electrode storage solution	VWR	14002-828
			Equipment:
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
DU 7500 Spectrophotometer	Beckmann	No longer sold
Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software	BioTek	Module S
Hematocytometer	Hausser Scientific	3110
7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate	VWR	97042-634
Centrifuge	Eppendorf	5430
Tissue culture water bath	VWR	Model# 89032-206
Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood)	The Baker Company	Model# SG403A-HE
Tissue culture incubator	ThermoScientific	Model# 3598
Pipetman	VWR		Range: P2-P1000
Balance	Mettler Toledo	Model# AG204
pH meter	Symphony/VWR	Model# SB70P
Pipet-Aid	Drummond Scientific	4-000-100
Combitip dispenser	Eppendorf	4981 000.019
			Recipes:
Name	Recipe	Notes
Acetate Buffer, pH 4.4	Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml	Sterile Filter into autoclaved glass bottle
Substrate (4-MU)	Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again	For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer
Glycine Carbonate Buffer, pH 10	26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10	Sterile filter into autoclaved glass bottle
Tyrodes (2 L), pH 7.4	135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4	Sterile filter into autoclaved glass bottle
RBL Cell Media	Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.	Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle
			Plastic material used:
Material Name	Company	Catalogue Number	Type of Plastic
200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack	VWR	53509-009	polypropylene
1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery	VWR	89003-420	polyethylene
10 µl micro tip low binding sterile	VWR	14217-704	polypropylene
Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force	VWR	20170-038	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-178	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-103	polypropylene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	690175	polystyrene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	658175	polystyrene
CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	607180	polystyrene
CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	710180	polystyrene
CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	606180	polystyrene
CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	760180	polystyrene
1 cm cuvettes	N/A	N/A	polystyrene
CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate	Greiner Bio One	655086	polystyrene
Combitips	Eppendorf	022266501	Polypropylene/ polyethylene