Un saggio di micropiastre per valutare gli effetti chimici su RBL-2H3 Mast cellule Degranulazione: Effetti del Triclosan senza l'uso di un solvente organico

Summary

Degranulazione dei mastociti, il rilascio di mediatori allergici, è importante per l'allergia, l'asma, e la difesa parassita. Qui mostriamo tecniche ¹ per la valutazione degli effetti di farmaci e sostanze tossiche sulla degranulazione, metodologia recentemente utilizzato per esporre il potente effetto inibitorio di agente antibatterico triclosan ^2.

Abstract

I mastociti svolgono un ruolo importante nella malattia allergica e la difesa immunitaria contro i parassiti. Una volta attivato (ad esempio da un allergene), essi degranulano, un processo che comporta la esocitosi di mediatori allergici. Modulazione di degranulazione dei mastociti da farmaci e sostanze tossiche può avere effetti positivi o negativi sulla salute umana. Funzione mastociti è stato sezionato in dettaglio con l'uso di ratto basofile mastociti leucemiche (RBL-2H3), un modello largamente accettato di mastociti mucosali umane ^3-5. Mast componente cellulare dei granuli e il mediatore allergica β-hexosaminidase, che viene rilasciato linearmente in tandem con istamina dai mastociti ^6, possono essere facilmente ed attendibilmente misurati tramite reazione con un substrato fluorogenico, cedendo misurabile intensità di fluorescenza in un saggio di micropiastra che è suscettibile di studi di high-throughput ^1. Originariamente pubblicato da Naal et al. ^1, abbiamo adattato questo dosaggio degranulazione per lo screening of farmaci e sostanze tossiche e dimostrare il suo uso qui.

Triclosan è un agente ad ampio spettro antibatterico che è presente in molti prodotti di consumo ed è stato trovato per essere un aiuto terapeutico in malattie allergiche della pelle umana ^7-11, anche se il meccanismo di questo effetto è sconosciuta. Qui mostriamo un saggio per l'effetto del triclosan sulla degranulazione mastocitaria. Abbiamo recentemente dimostrato che il triclosan influenza fortemente la funzione delle cellule mast ^2. Nel tentativo di evitare l'impiego di un solvente organico, triclosan è disciolto direttamente in tampone acquoso con il calore e agitazione, e la concentrazione risultante viene confermata mediante spettrofotometria UV-Vis (usando ₂₈₀ ε = 4,200 L / M / cm) ^12. Questo protocollo ha il potenziale per essere usato con una varietà di prodotti chimici per determinare i loro effetti sulla degranulazione dei mastociti, e più in generale, il loro potenziale allergico.

Introduction

I mastociti sono altamente granulato cellule immunitarie effettrici che fungono da mediatori chiave in asma, allergie, parassiti della difesa e della carcinogenesi ^13-16. Essi risiedono in quasi ogni tessuto vascolarizzato ^15, dove archiviare in modo sicuro i mediatori infiammatori e allergici in granuli citoplasmatici fino attivato per degranulano. Degranulazione è l'esocitosi di granuli legati alla membrana, che provoca il rilascio di mediatori farmacologicamente attivi come istamina, triptasi e leucotrieni ^15. Questo processo determina l'avvio di tipo I reazioni di ipersensibilità che sono fondamentali per la difesa contro i parassiti di montaggio, nonché avviare le risposte allergiche, asma, e cancerogeni ^15.

Mastociti e basofili esprimono recettori FcεRI, i recettori ad alta affinità per le immunoglobuline E (IgE) ^17. Esposizione ad un allergene o antigene provoca aggregazione di più IgE-bound recettori FcεRI ^17, ed è questa so-chiamato "reticolazione" di IgE-bound recettori Fc che avvia il processo di degranulazione: una cascata di eventi tirosin-fosforilazione, l'attivazione della fosfolipasi C, passaggio di calcio dai depositi interni e afflusso di calcio nelle cellule ^18. Questo flusso di calcio è necessario per la degranulazione, e, inoltre, segnala granulo fusione con la membrana prima di causare granuli esocitosi ^15. Sperimentalmente, un calcio ionoforo può essere usato per il calcio navetta direttamente attraverso la membrana cellulare ^19, che bypassa essenzialmente tutto trasduzione del segnale passi prima della fase di afflusso di calcio ^20, consentendo l'identificazione di un bersaglio percorso da una sostanza tossica come a monte oa valle dei segnalazione di calcio ^20.

Degranulazione può essere misurata rapido ed efficace monitorando il rilascio di β-hexosaminidase nel supernatante cellulare, che viene rilasciata linearmente dai granuli accanto istamina ^6, ma is molto più facile da rilevare con una semplice reazione enzima-substrato e di un lettore di micropiastre per saggiare il prodotto fluorescente. Questo saggio micropiastre, come dettagliato nella sezione del protocollo, si basa su un metodo robusto originariamente sviluppato da Naal et al. ^1, che quantifica il clivaggio del substrato fluorogenico 4-metilumbelliferil-N-acetil-β-D-glucosaminide da β- hexosaminidase. Abbiamo modificato il dosaggio per gli effetti di test di farmaci e sostanze tossiche, con triclosan evidenziato qui. Questo metodo quantifica affidabile degranulazione, è un'alternativa economica a, per esempio, il flusso di metodi di rilevamento mediante citometria a base ^21, e ha il potenziale per prestarsi bene a high-throughput screening di una vasta gamma di farmaci anti-allergia, così come immunotossico o prodotti chimici allergizzanti. Quest'ultimo punto è particolarmente importante alla luce del 2007 National Research relazione del Consiglio "Test di tossicità nel ²¹ ° secolo: una visione e di una Strattegia "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), che sostiene per lo sviluppo di test tossicologici high-throughput che utilizzano colture cellulari di ridurre l'uso di animali da laboratorio costoso tradizionali come topi. Il protocollo sviluppato da degranulazione Naal et al. ¹ e modificato da noi ^2, utilizza la linea cellulare RBL-2H3, che è un modello ben accettato omologa ai mastociti mucosali umani o basofili ^3-5. (Metodi per la coltura di cellule RBL-2H3 sono dettagliate nel Hutchinson et al. ^22). Questo dosaggio può probabilmente essere adattata a qualsiasi tipo mastociti allegata.

Triclosan (TCS) è un antimicrobico ad ampio spettro che è stato usato per più di 30 anni negli ospedali, per la cura personale e beni di consumo ^23,24. La modalità di azione antimicrobica per la caratteristica di TCS è l'inibizione della biosintesi di acidi grassi, probabilmente inibendo enoil-acilproteina carrier reduttasi ^25,26. Si trova in tutto il mondo in una vasta gamma di prodotti di consumo come gel doccia, lozione per le mani, dentifricio, collutorio, e in saponi a concentrazioni fino allo 0,3% o 10 mm ^24. L'impiego diffuso di TCS ha portato a livelli rilevabili nell'uomo ^27-29 e nei corsi d'acqua ^30. Uno studio fatto da Allmyr et al. Ha dimostrato che ²⁷ TCS e dei suoi metaboliti sono presenti sia nel plasma e latte di madri che allattano. È importante sottolineare che, TCS è facilmente assorbito nella pelle ^31-37. Queckenberg et al. Trovato ³⁷ ~ 10% l'assorbimento di un ~ 70 mm TCS crema nella pelle umana entro 12 ore, con conseguente significativa concentrazione nella pelle, dove i mastociti risiedono.

TCS è stato dimostrato clinicamente per la gestione della malattia allergica della pelle umana ^7-11, ma il meccanismo con cui TCS allevia le malattie allergiche della pelle è rimasta sconosciuta ^38. Usando la fluorescenza per micropiastre saggio detailed in questo video, abbiamo recentemente dimostrato che TCS, a concentrazioni a partire da 2 micron, attenua significativamente la funzione dei mastociti e degranulazione, fornendo una potenziale spiegazione per questi dati clinici ^2. Oltre a fornire una spiegazione per questi dati clinici, i nostri risultati in Palmer et al. ² suggeriscono che TCS rivolge molecole di segnalazione a valle del flusso di calcio. A causa dell'importanza del calcio segnalazione in molti immunologico e altri processi biologici, TCS potrebbe potenzialmente avere effetti negativi su un'ampia varietà di processi biologici necessari. Infatti, Udoji et al. Ha dimostrato che ³⁹ TCS sopprime cellula attività umana natural killer litico, un altro importante funzione immunitaria innata.

Oltre al suo potenziale come un aiuto terapeutico nella malattia allergica della pelle (o, al contrario, come un immunotossico), TCS può anche essere un distruttore endocrino ^40-49. Così, una procedura chiara su come preparare questa sostanza chimica in soluzione is di interesse per i tossicologi. Poiché TCS è una piccola molecola idrofobica, veicoli organici vengono spesso utilizzati per renderla più solubile in acqua. Nella maggior parte degli studi di tossicità in cui TCS è stato testato, preparato è coinvolto dissoluzione in acqua con l'ausilio di un solvente organico quale etanolo, acetone, o olio ^2,50,51. Tuttavia, spesso questi solventi sono biologicamente attivi stessi, complicando in tal modo l'interpretazione della sostanza chimica di prova dei dati ^51. In effetti, secondo Rufli et al. ⁵² e altri ^53, si raccomanda che le soluzioni di prova per esperimenti di tossicità acquatica sono preparati utilizzando metodi fisici sopra metodi chimici, a causa del potenziale di solventi chimici per creare artefatti tossicità. Abbiamo precedentemente dimostrato che gli STC dissolto in 0,24% di etanolo / acqua (vol / vol) e sottoposto a sonicazione per 30 min smorza RBL degranulazione mastocitaria ^2. Etanolo a concentrazioni superiori a 0,24% è stato indicato per smorzare degrado mastocitinulation ^54,55-esempi degli effetti potenzialmente confondenti di solventi organici in studi di tossicità.

Non solo è importante considerare l'azione di solventi sull'organismo o cellule utilizzate per lo studio, ma anche che è importante monitorare l'effetto di un solvente la parte chimica prova stessa. Ad esempio, Skaare et al. ⁵¹ hanno trovato che la dissoluzione TCS in polietilene glicole (che si trovano comunemente nei dentifrici e colluttori) indebolito gli effetti anti-batteriche e anti-placca in donne sane durante dissoluzione in oli causato una perdita completa della funzione. Pertanto, la capacità di diversi solventi per modulare tossico e di droga, tra cui TCS, gli effetti devono essere considerati nella progettazione di test. Uso di oli o additivi aromatici può interferire con gli effetti di STC in vari prodotti ^50,51.

Nel tentativo di eliminare la necessità di utilizzare solventi organici, abbiamo migliorato il nostro metodo di dissoluzione TCS ² eliminando l'uso di un sol organicasfogare. Nel presente protocollo, ci sciogliamo TCS granuli direttamente in tampone acquoso con il calore (≤ 50 ° C), e quindi verificare la concentrazione di questo stock TCS con spettrofotometria UV-Vis. Questi miglioramenti sono possibili perché TCS è solubile in acqua fino a 40 pM ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) e ha dimostrato di resistere alla degradazione quando viene riscaldata a 50 ° C ( http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) ^56,57. Abbiamo anche il vantaggio di spettrofotometria UV-Vis, come TCS inoltre è conosciuto per assorbire fortemente a 280 nm ⁵⁸ con un coefficiente di estinzione molare di 4.200 L / mol / cm ^12.

Questo protocollo fornisce un modo semplice, ma efficace per dissolvere TCS granuli in un buffer senza l'ausilio di un solvente organico, tra cui basso costo e rapida verificadi concentrazione, e descrive un potente saggio di micropiastre a fluorescenza per monitorare gli effetti chimici sulla degranulazione dei mastociti.

Protocol

Notare che tutte le ricette di buffer sono incluse in una tabella alla fine del testo protocollo. 1 ° GIORNO: 1. Preparazione di cellule Pianificare 96 pozzetti schema di configurazione di piastra, centratura campioni di prova sul layout in modo da evitare effetti di bordo. Allocare tre repliche per ogni concentrazione TCS testata (± degranulazione stimolante di antigene o ionoforo), nonché per triplica rilascio spontaneo (senza stimolan…

Representative Results

Quando riscaldato a 50 ° C per 90 min, lo spettro di assorbanza UV-Vis per TCS produce un forte curva regolare tra ~ 260 e 300 nm, con un picco a 280 nm, come mostrato in Figura 1. Spettrofotometria UV-Vis è, quindi, un importante strumento che può essere utilizzata per calcolare la concentrazione, poiché il coefficiente di assorbimento molare pubblicato a 280 nm è 4,200 L / mol / cm 12. Abbiamo scoperto che TCS non cada dalla soluzione durante l'arco di tempo l'intero esperimento degranulazione, seg…

Discussion

Nel 2004, Naal et al. ¹ ha sviluppato un biosensore mastociti per la prova high-throughput di degranulazione. Si tratta di un test affidabile che abbiamo adattato per i nostri studi TCS e dettagliato in questo video. Prima della Naal et al. ¹ assay, degranulazione mastocitaria era stata regolarmente valutata mediante β-hexosaminidase ^59-61, ma questi primi metodi utilizzati fluorimetri in cui un campione è stata letta a volta. È importante sottolineare che, Naal et al. stabilito…

Materials

RBL-2H3 Cells	ATCC	CRL-2256	The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC
Triclosan/Irgasan	Sigma	72779 CAS# 3380-34-5	Should be stored in a low humidity environment
Trypsin	Gibco	25300-054 CAS# 3380-34-5
EMEM	Lonza	12-611F
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Gentamycin Sulfate	Lonza Biological Sciences	17-518
Albumin, Bovine Serum	Calbiochem	12659 CAS# 9048-46-8
Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)	Pierce	28314 CAS# 9002-93-1
HEPES	J.T Baker	4153-01 CAS# 75277-39-3
Magnesium Chloride	VWR	BDH0244-500G CAS# 7791-18-6
D-(+)-Glucose	Biomedicals	152527 CAS# 50-99-7
Potassium Chloride Crystal	J.T Baker	3046-01 CAS# 7447-40-7
Calcium chloride dihyrdate	Acros Organics	207780010 CAS# 10035-04-8
Glycine	Sigma	G8898 CAS# 56-40-6
4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)	EMD Biosciences	474502-250MG CAS # 37067-30-4	Wrap in foil – is light-sensitive
Anti-DNP Mouse IgE	Sigma	D8406	Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.
DNP-BSA	Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University		Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018
Calcium Ionophore A23187	Sigma	C75-22-1mg	Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully
DMSO	Sigma	D2650 CAS# 67-68-5
Acetic Acid	VWR	BDH3094-2 CAS# 64-19-7
Anhydrous Sodium Carbonate	Sigma	222321 CAS# 497-19-8
Sodium Chloride	Sigma	71376 CAS# 7647-14-5
Hydrochloric Acid	VWR	BDH3026 CAS# 7647-01-0
Reference Buffer, pH 7	VWR	BDH5046
Reference Buffer, pH 10	VWR	BDH5072
Reference Buffer, pH 4	VWR	BDH5018
pH electrode storage solution	VWR	14002-828
			Equipment:
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
DU 7500 Spectrophotometer	Beckmann	No longer sold
Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software	BioTek	Module S
Hematocytometer	Hausser Scientific	3110
7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate	VWR	97042-634
Centrifuge	Eppendorf	5430
Tissue culture water bath	VWR	Model# 89032-206
Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood)	The Baker Company	Model# SG403A-HE
Tissue culture incubator	ThermoScientific	Model# 3598
Pipetman	VWR		Range: P2-P1000
Balance	Mettler Toledo	Model# AG204
pH meter	Symphony/VWR	Model# SB70P
Pipet-Aid	Drummond Scientific	4-000-100
Combitip dispenser	Eppendorf	4981 000.019
			Recipes:
Name	Recipe	Notes
Acetate Buffer, pH 4.4	Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml	Sterile Filter into autoclaved glass bottle
Substrate (4-MU)	Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again	For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer
Glycine Carbonate Buffer, pH 10	26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10	Sterile filter into autoclaved glass bottle
Tyrodes (2 L), pH 7.4	135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4	Sterile filter into autoclaved glass bottle
RBL Cell Media	Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.	Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle
			Plastic material used:
Material Name	Company	Catalogue Number	Type of Plastic
200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack	VWR	53509-009	polypropylene
1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery	VWR	89003-420	polyethylene
10 µl micro tip low binding sterile	VWR	14217-704	polypropylene
Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force	VWR	20170-038	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-178	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-103	polypropylene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	690175	polystyrene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	658175	polystyrene
CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	607180	polystyrene
CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	710180	polystyrene
CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	606180	polystyrene
CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	760180	polystyrene
1 cm cuvettes	N/A	N/A	polystyrene
CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate	Greiner Bio One	655086	polystyrene
Combitips	Eppendorf	022266501	Polypropylene/ polyethylene