Een Microplate Assay aan chemische Effecten op RBL-2H3 mestceldegranulatie Assess: Effecten van Triclosan, zonder gebruik van een organisch oplosmiddel

Summary

Mastceldegranulering, de vrijlating van allergische mediatoren, is belangrijk bij allergie, astma, en parasiet defensie. Technieken ¹ voor de beoordeling van effecten van geneesmiddelen en toxische stoffen op degranulatie Hier laten we zien, methodologie onlangs gebruikt om de krachtige remmende effect van antibacterieel middel triclosan ² vertonen.

Abstract

Mestcellen spelen een belangrijke rol bij allergische ziekten en immunologische afweer tegen parasieten. Eenmaal geactiveerd (bijvoorbeeld door een allergeen), zij degranuleren, een proces dat resulteert in de exocytose van allergische mediatoren. Modulatie van mestceldegranulatie door geneesmiddelen en toxische stoffen kunnen positieve of negatieve effecten op de menselijke gezondheid hebben. Mestcel functie ontleed in detail het gebruik van rat basofiele leukemie mestcellen (RBL-2H3), een algemeen aanvaard model van menselijke mucosale mestcellen ^3-5. Mestcel granule component en allergische mediator β-hexosaminidase, dat lineair wordt vrijgegeven samen met histamine uit mestcellen ^6, eenvoudig en betrouwbaar kunnen worden bepaald door reactie met een fluorogeen substraat, waardoor meetbare fluorescentie-intensiteit in een microplaat test die vatbaar is voor high-throughput studies ^1. Oorspronkelijk gepubliceerd door Naal et al.. ^1, hebben we deze degranulatie assay aangepast voor de screening of geneesmiddelen en toxische stoffen en demonstreren het gebruik ervan hier.

Triclosan is een breed-spectrum antibacterieel middel dat aanwezig is in vele consumentenproducten en is gevonden om een therapeutisch hulpmiddel bij humane allergische huidziekte ^7-11, hoewel het mechanisme voor dit effect is niet bekend. Hier laten we een test voor het effect van triclosan op mestcel degranulatie. We toonden onlangs aan dat triclosan sterk beïnvloedt mestcel functie ^2. In een poging om het gebruik van een organisch oplosmiddel te voorkomen, triclosan direct opgelost in een waterige buffer met warmte en roeren, en de resulterende concentratie wordt bevestigd met UV-Vis-spectrofotometrie (met ε ₂₈₀ = 4.200 L / M / cm) ^12. Dit protocol heeft het potentieel om te worden gebruikt met een verscheidenheid van chemicaliën om hun effecten op mestcel degranulatie bepalen, en meer algemeen, de allergene eigenschappen.

Introduction

Mestcellen zeer kristalsuiker immuuneffectorcellen die dienen als belangrijke bemiddelaars bij astma, allergieën, parasieten defensie en carcinogenese ^13-16. Zij verblijven in bijna elk gevasculariseerd weefsel ^15, waar ze veilig allergische en inflammatoire mediatoren slaan in cytoplasmatische korrels totdat geactiveerd om degranuleren. Degranulatie is de exocytose van membraan-gebonden korrels, waardoor de afgifte van farmacologisch werkzame mediatoren zoals histamine, tryptase en leukotriënen ^15. Dit proces resulteert in de opening van type I overgevoeligheidsreacties die kritisch montage verdediging tegen parasieten als inleiding allergische, astmatische en carcinogeen reacties ^15.

Mestcellen en basofielen expressie FcsRI receptoren, de hoge affiniteit receptoren voor immunoglobuline E (IgE) ^17. Blootstelling aan een allergeen of antigen veroorzaakt aggregatie van meerdere IgE-receptoren gebonden FcsRI ^17, en het is deze so zogenaamde "crosslinking" of IgE gebonden Fc receptoren die de degranulatie initieert: een cascade van tyrosine fosforylatie gebeurtenissen, de activering van fosfolipase C, efflux van calcium uit interne opslag en instroom van calcium in de cel ^18. Dit calcium influx is noodzakelijk voor degranulatie en voorts signalen granule fusie met het membraan voor het veroorzaken granule exocytose ^15. Experimenteel kan een calciumionofoor worden gebruikt shuttle calcium direct over het celmembraan ^19, dat in wezen alle omzeilt signaaltransductie stappen vóór de calcium influx stap ^20, voor de identificatie van een route doel door een giftige stof als stroomopwaarts of stroomafwaarts van calcium signalering ^20.

Degranulatie kan snel en effectief worden gemeten door het volgen van het vrijkomen van β-hexosaminidase in cel supernatant, die lineair vrijkomt uit de granules samen met histamine ^6, maar iis veel gemakkelijker te detecteren met behulp van een eenvoudige enzym-substraat reactie en een microplaat lezer assay het fluorescerende product. Dit microplaat test, zoals beschreven in de paragraaf protocol is gebaseerd op een robuuste methode oorspronkelijk ontwikkeld door Naal et al.. ^1, waarbij de splitsing van het fluorogene substraat 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide kwantificeert door β- hexosaminidase. We hebben de test aangepast om te testen effecten van geneesmiddelen en toxische stoffen, met triclosan gemarkeerd hier. Deze methode betrouwbaar kwantificeert degranulatie, is een goedkoop alternatief voor bijvoorbeeld flowcytometrische gebaseerde detectiemethoden ^21, en ​​heeft de potentie om zich goed lenen voor high-throughput screening van een groot aantal anti-allergische geneesmiddelen, alsmede immuno of allergene stoffen. Dit laatste punt is bijzonder belangrijk in het licht van de 2007 National Research Council rapport "Onderzoek naar de toxiciteit in de ^21e eeuw: Een visie en een Stratgie "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), die pleit voor de ontwikkeling van high-throughput toxicologische tests die celcultuur gebruiken om het kostbare gebruik van traditionele proefdieren zoals muizen te verminderen. De degranulatie protocol ontwikkeld door Naal et al.. ¹ en gewijzigd door ons ^2, maakt gebruik van de RBL-2H3 cellijn, die een goed geaccepteerd model homoloog aan menselijke mucosale mestcellen of basofielen ^3-5. (Werkwijzen voor het kweken van RBL-2H3 cellen zijn beschreven in Hutchinson et al.. ^22). Deze test kan waarschijnlijk worden aangepast aan elke aangesloten mast celtype.

Triclosan (TCS) is een breed-spectrum antimicrobiële die is gebruikt voor meer dan 30 jaar in ziekenhuizen, producten voor persoonlijke verzorging, en consumptiegoederen ^23,24. De werkingswijze van antimicrobiële eigenschap TCS is de remming van vetzuur-biosynthese, waarschijnlijk door remming enoyl-acyldragereiwit reductase ^25,26. Het is wereldwijd te vinden in een breed scala van consumentenproducten, zoals douchegel, handcrème, tandpasta, mondwater, en in de hand zepen bij concentraties tot 0,3% of 10 mM ^24. Wijdverbreide gebruik van TCS heeft geresulteerd in detecteerbare niveaus in mensen ^27-29 en in rivieren en beken ^30. Een studie uitgevoerd door Allmyr et al.. ²⁷ aangetoond dat TCS en zijn metabolieten aanwezig in zowel het plasma en melk van zogende moeders zijn. Belangrijker is TCS gemakkelijk geabsorbeerd in de huid ^31-37. Queckenberg et al.. Gevonden ³⁷ ~ 10% opname van een ~ 70 mM TCS room in menselijke huid binnen 12 uur, met een aanzienlijke concentratie in de huid, waar de mast cellen verblijven.

TCS is klinisch aangetoond dat de mens allergische huidziekte ^7-11 beheren, maar het mechanisme waardoor TCS verlicht allergische huidziekten is onbekend ³⁸ geweest. Met behulp van de fluorescerende microplate assay detailed in deze video, we onlangs aangetoond dat TCS, bij concentraties zo laag als 2 pM aanzienlijk gedempt mestcel functie en degranulatie, die een mogelijke verklaring voor deze klinische gegevens ^2. Naast het leveren van een verklaring voor deze klinische data, onze bevindingen in Palmer et al.. ² suggereren dat TCS richt signaalmoleculen stroomafwaarts van calcium influx. Vanwege het belang van calcium signaling in vele immunologische en andere biologische processen zouden TCS mogelijke nadelige effecten op een grote verscheidenheid van biologische processen noodzakelijk. In feite, Udoji et al.. ³⁹ toonde aan dat TCS onderdrukt menselijke natuurlijke killer cel lytische activiteit, een andere belangrijke aangeboren immuunsysteem.

Naast zijn potentieel als een therapeutisch hulpmiddel bij allergische huidziekte (of, omgekeerd, als immunotoxicant) kan TCS ook endocriene verstoorder is ^40-49. Zo, een duidelijke procedure over hoe dit chemisch bereiden in oplossing is van belang zijn voor toxicologen. Omdat TCS is een klein hydrofoob molecuul, zijn organische voertuigen vaak gebruikt om het meer in water oplosbaar te maken. In de meeste toxiciteit wanneer TCS is getest, is betrokken preparaat oplossing in water met behulp van een organisch oplosmiddel zoals ethanol, aceton of olie ^2,50,51. Echter, vaak tijden deze oplosmiddelen zijn biologisch actieve zelf, daardoor bemoeilijkt de interpretatie van de test chemische gegevens ^51. In feite, volgens Rufli et al.. ⁵² en ⁵³ anderen, wordt aanbevolen dat testoplossingen voor aquatische toxiciteit experimenten worden bereid met fysische werkwijzen via chemische werkwijzen vanwege de mogelijke chemische oplosmiddelen toxiciteit voorwerpen creëert. We hebben eerder aangetoond dat TCS opgelost in 0,24% ethanol / water (vol / vol) en gesoniceerd gedurende 30 min dempt RBL mestcel degranulatie ^2. Ethanol bij hogere concentraties dan 0,24% is aangetoond mast cell afbraak dempennulation ^{54,55-voorbeelden} van de potentieel verstorende effecten van organische oplosmiddelen op toxiciteit.

Niet alleen is het belangrijk om het effect van oplosmiddelen op het organisme of cellen voor onderzoek beschouwen, maar het is ook belangrijk om het effect van een oplosmiddel toezicht op de teststof zelf. Bijvoorbeeld, Skaare et al.. ⁵¹ vonden dat oplossen TCS in polyethyleenglycol (vaak gevonden in tandpasta en mondwater) verzwakt anti-bacterieel en anti-plaque effecten bij gezonde vrouwelijke vrouwen, terwijl oplossen in olie als gevolg van een volledig verlies van functie. Daarom is het vermogen van verschillende oplosmiddelen te moduleren ingedeeld en geneesmiddelen met inbegrip TCS, het effect worden overwogen in deze ontwerpen. Gebruik van oliën of smaakstoffen kunnen interfereren met de effecten van TCS in diverse producten ^50,51.

In een poging om de noodzaak om organische oplosmiddelen te elimineren, verbeterde we op onze werkwijze voor het oplossen TCS ² door het elimineren van het gebruik van een organisch solventileren. In het huidige protocol, ontbinden we TCS korrels direct in waterige buffer met warmte (≤ 50 ° C), en controleer de concentratie van deze TCS voorraad door UV-Vis spectrofotometrie. Deze verbeteringen zijn mogelijk omdat TCS is oplosbaar in water tot 40 uM ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) en is aangetoond dat afbraak weerstaan ​​bij verhitting tot 50 ° C ( http:// / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) ^56,57. We hebben ook het extra voordeel van UV-Vis spectrofotometrie als bedrijf ook bekend dat sterk absorbeert bij 280 nm ⁵⁸ met een molaire extinctiecoëfficiënt van 4200 L / mol / cm ^12.

Dit protocol voorziet in een eenvoudige, maar effectieve manier om TCS korrels oplossen in een buffer zonder de hulp van een organisch oplosmiddel, zoals lage kosten en snelle verificatievan de concentratie, en beschrijft een krachtige fluorescerende microplate assay voor de monitoring chemische effecten op mestceldegranulatie.

Protocol

Merk op dat alle buffer recepten in een tabel aan het eind van het protocol tekst. DAG 1: 1. Bereiding van Cellen Plan uit 96-well plaat setup regeling, centreren proefmonsters op de lay-out, om randeffecten te vermijden. Allocate triplo voor elke geteste concentratie TCS (± degranulatie stimulerende antigeen of ionofoor), alsmede drievoud voor spontane afgifte (geen degranulatie stimulerend), maximale afgifte (0,2% Triton X-100 [TX] deter…

Representative Results

Bij verwarmen tot 50 ° C gedurende 90 min, UV-Vis absorptie spectrum voor TCS produceert een sterke, gladde kromme tussen ~ 260 en 300 nm, met een piek bij 280 nm, zoals getoond in figuur 1. UV-Vis spectrofotometrie is daarom een belangrijk instrument dat kan worden gebruikt om de concentratie te berekenen, omdat de gepubliceerde molaire absorptiecoëfficiënt bij 280 nm 4.200 L / mol / cm 12. Wij hebben gevonden dat TCS niet vallen uit oplossing gedurende het tijdsbestek van de degranulatie gehele experiment, n…

Discussion

In 2004, Naal et al.. ¹ ontwikkelde een mestcel biosensor voor high-throughput testen van degranulatie. Het is een robuuste test die we hebben aangepast voor onze TCS studies en beschreven in deze video. Voorafgaand aan de Naal et al.. ¹ assay mastceldegranulering waren routinematig beoordeeld via β-hexosaminidase ^59-61, maar deze vroege methoden gebruikt fluorometers waarbij een monster tegelijk lezen. Belangrijk Naal et al.. gevestigde directe concordantie tussen hun meer high-t…

Materials

RBL-2H3 Cells	ATCC	CRL-2256	The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC
Triclosan/Irgasan	Sigma	72779 CAS# 3380-34-5	Should be stored in a low humidity environment
Trypsin	Gibco	25300-054 CAS# 3380-34-5
EMEM	Lonza	12-611F
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Gentamycin Sulfate	Lonza Biological Sciences	17-518
Albumin, Bovine Serum	Calbiochem	12659 CAS# 9048-46-8
Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)	Pierce	28314 CAS# 9002-93-1
HEPES	J.T Baker	4153-01 CAS# 75277-39-3
Magnesium Chloride	VWR	BDH0244-500G CAS# 7791-18-6
D-(+)-Glucose	Biomedicals	152527 CAS# 50-99-7
Potassium Chloride Crystal	J.T Baker	3046-01 CAS# 7447-40-7
Calcium chloride dihyrdate	Acros Organics	207780010 CAS# 10035-04-8
Glycine	Sigma	G8898 CAS# 56-40-6
4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)	EMD Biosciences	474502-250MG CAS # 37067-30-4	Wrap in foil – is light-sensitive
Anti-DNP Mouse IgE	Sigma	D8406	Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.
DNP-BSA	Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University		Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018
Calcium Ionophore A23187	Sigma	C75-22-1mg	Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully
DMSO	Sigma	D2650 CAS# 67-68-5
Acetic Acid	VWR	BDH3094-2 CAS# 64-19-7
Anhydrous Sodium Carbonate	Sigma	222321 CAS# 497-19-8
Sodium Chloride	Sigma	71376 CAS# 7647-14-5
Hydrochloric Acid	VWR	BDH3026 CAS# 7647-01-0
Reference Buffer, pH 7	VWR	BDH5046
Reference Buffer, pH 10	VWR	BDH5072
Reference Buffer, pH 4	VWR	BDH5018
pH electrode storage solution	VWR	14002-828
			Equipment:
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
DU 7500 Spectrophotometer	Beckmann	No longer sold
Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software	BioTek	Module S
Hematocytometer	Hausser Scientific	3110
7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate	VWR	97042-634
Centrifuge	Eppendorf	5430
Tissue culture water bath	VWR	Model# 89032-206
Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood)	The Baker Company	Model# SG403A-HE
Tissue culture incubator	ThermoScientific	Model# 3598
Pipetman	VWR		Range: P2-P1000
Balance	Mettler Toledo	Model# AG204
pH meter	Symphony/VWR	Model# SB70P
Pipet-Aid	Drummond Scientific	4-000-100
Combitip dispenser	Eppendorf	4981 000.019
			Recipes:
Name	Recipe	Notes
Acetate Buffer, pH 4.4	Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml	Sterile Filter into autoclaved glass bottle
Substrate (4-MU)	Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again	For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer
Glycine Carbonate Buffer, pH 10	26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10	Sterile filter into autoclaved glass bottle
Tyrodes (2 L), pH 7.4	135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4	Sterile filter into autoclaved glass bottle
RBL Cell Media	Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.	Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle
			Plastic material used:
Material Name	Company	Catalogue Number	Type of Plastic
200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack	VWR	53509-009	polypropylene
1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery	VWR	89003-420	polyethylene
10 µl micro tip low binding sterile	VWR	14217-704	polypropylene
Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force	VWR	20170-038	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-178	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-103	polypropylene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	690175	polystyrene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	658175	polystyrene
CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	607180	polystyrene
CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	710180	polystyrene
CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	606180	polystyrene
CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	760180	polystyrene
1 cm cuvettes	N/A	N/A	polystyrene
CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate	Greiner Bio One	655086	polystyrene
Combitips	Eppendorf	022266501	Polypropylene/ polyethylene