RBL-2H3マスト細胞脱顆粒に対する化学的影響を評価するために、マイクロプレートアッセイ：有機溶剤を使用せずに、トリクロサンの影響

Summary

マスト細胞の脱顆粒、アレルギー性​​メディエーターの放出は、アレルギー、喘息、および寄生虫防御に重要です。ここでは、脱顆粒で薬や毒物の影響を評価するための技術^1を実証、方法論は、最近抗菌剤トリクロサン²の強力な阻害効果を発揮するために利用。

Abstract

マスト細胞はアレルギー疾患や寄生虫に対する免疫防御において重要な役割を果たしている。かつて（アレルゲンによって）アクティブに、彼らは、アレルギー性メディエーターのエキソサイトーシスで結果そのプロセスを脱顆粒。薬物および毒物による肥満細胞の脱顆粒の変調は、人の健康に正または悪影響を与える可能性があります。肥満細胞機能は、ラット好塩基球性白血病マスト細胞の使用（RBL-2H3）、ヒト粘膜肥満細胞の広く受け入れられているモデル^{までの時間}を詳細に切開されている。 ⁶肥満細胞からのヒスタミンと連携して直線的に放出される肥満細胞顆粒成分およびアレルギーメディエーターβ-ヘキソサミニダーゼを、容易かつ確実に適しているマイクロプレートアッセイで測定可能な蛍光強度を得、蛍光原基質との反応により測定することができる高スループット研究^1。もともとNaal らによって出版した^。1、我々は、スクリーニングOは、この脱顆粒アッセイを適応しているfは薬物や毒物、ここでその使用方法を示しています。

トリクロサンは、多くの消費者製品中に存在し、このエフェクトのメカニズムは不明であるが、人間のアレルギー性皮膚疾患における治療^7-11援助であることが見出されている広域スペクトル抗菌剤である。ここでは、マスト細胞の脱顆粒に対するトリクロサンの効果についてのアッセイを実証する。我々は、最近、トリクロサンを強くマスト細胞機能^2に影響^を与えること^を示した。有機溶媒の使用を回避する目的で、トリクロサン熱と攪拌しながら水性緩衝液中に直接溶解させ、得られた濃度は_{^{、12（ε280}} = 4,200 L / M / cmで使用）UV-可視分光光度計を用いて確認された。このプロトコルは、より広く、そのアレルギー電位をマスト細胞の脱顆粒に対する効果を決定するために様々な化学物質と一緒に使用される可能性があり、。

Introduction

マスト細胞は喘息、アレルギー、寄生虫防衛および発癌^13-16で重要なメディエーターとして機能性の高い造粒免疫エフェクター細胞である。彼らは、脱顆粒するために活性化されるまで、彼らは無事に質顆粒にアレルギー性および炎症性メディエーターを保管ほぼすべての血管組織¹⁵に存在します。脱顆粒は、そのようなヒスタミン、トリプターゼ、およびロイコトリエン¹⁵と薬理学的に活性なメディエーターの放出をもたらす膜結合顆粒のエキソサイトーシスである。寄生虫に対する防御だけでなく、アレルギー性喘息、および発がん応答^15を開始することをマウントする上で重要であるI型過敏性反応の開始でこのプロセスは結果。

肥満細胞および好塩基球は、FcεRIを受容体、免疫グロブリンE（IgE抗体^）17のための高親和性受容体を発現する。アレルゲンまたは抗原への曝露は、複数のIgE結合したFcεRIを受容体¹⁷の凝集を引き起こし、それがこのsであるチロシンリン酸化事象のカスケード、ホスホリパーゼC、内部貯蔵からのカルシウムの流出、およびセル¹⁸へのカルシウムの流入の活性化：脱顆粒プロセスを開始したIgEに結合したFcレセプターの"架橋" O-と呼ばれる。このカルシウム流入は、脱顆粒のために必要であり、さらに、顆粒のエキソサイトーシス^15を起こす前に、膜と顆粒の融合を通知します。実験的に、カルシウムイオノフォアを直接本質的にすべてのシグナル伝達は、上流または下流のものとして毒物による経路標的の同定を可能にする、カルシウム流入工程²⁰の前にステップ迂回細胞膜¹⁹を横切って往復カルシウムを使用することができカルシウム^20に信号^を送る 。

脱顆粒は、ヒスタミン⁶一緒に顆粒から直線的に放出される細胞上清の中にβ-ヘキソサミニダーゼの放出を監視することにより、迅速かつ効果的に測定された、しかし、私ができるシンプルな酵素 – 基質反応およびアッセイ蛍光生成物をするマイクロプレートリーダーを用いて検出するのははるかに簡単。このマイクロプレートアッセイ、プロトコル·セクションに詳述したように、最初にNaal らによって開発された堅牢な方法に基づいている^。1で4 -メチル-N-アセチル-β-D-グルコ蛍光基質の切断を定量化β-ヘキソサミニダーゼ。私たちは、トリクロサンはここに強調​​して、薬や毒物の影響をテストするためのアッセイ法を変更しました。この方法は確実に脱顆粒を定量化する、例えば、フローサイトメトリーベースの検出方法²¹に安価な代替品であり、抗アレルギー薬の多種多様なハイスループットスクリーニングにうまく自分自身を貸すする可能性があるだけでなく、免疫毒性またはアレルギー物質。この最後の点は、21 ^世紀 、2007年の国立研究協議会報告書"毒性試験の観点から特に重要である：ビジョンとストラトEGY "（ http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970マウスのような伝統的な実験動物の高価な使用を減らすために、細胞培養を利用した高スループット毒性試験の開発のための提唱）。 Naal らによって開発された^1、私達²によって変更された脱顆粒プロトコルは、相同なヒト粘膜肥満細胞または好塩基球^3-5に広く受け入れられているモデルであるRBL-2H3細胞株を利用する。 （培養RBL-2H3細胞のための方法は、ハッチンソンらに詳述されている^。22）。このアッセイは、おそらく接続されているすべての肥満細胞のタイプに適合させることができる。

トリクロサン（TCS）は、病院、パーソナルケア製品、および消費財^23,24において30年以上に使用されている広域スペクトル抗菌薬である。 TCSの抗菌特性の作用機序は、エノイル-アシルを阻害することによって可能性が高い、脂肪酸生合成の阻害であるキャリアタンパク質レダクターゼ^25,26。このようなシャワージェル、ハンドローション、歯磨き粉、うがい薬、および0.3％または10 mMの²⁴までの濃度におけるハンドソープのような消費者製品の広い範囲で世界的に見られる。 TCSの普及は人間^27-29や河川³⁰で検出可能なレベルをもたらしました。 Allmyr らによって行われた研究^27は、TCSとその代謝物は、授乳中の母親からプラズマとミルクの両方に存在していることを実証した。重要なのは、TCSは容易に皮膚^31-37に吸収される。 Queckenberg ら ^37は、肥満細胞が存在する皮膚にかなりの濃度で、その結果、12時間以内に人間の皮膚に〜70mMのTCSクリームの約10％の吸収を発見した。

TCSは、ヒトのアレルギー性皮膚疾患^7-11を管理するために臨床的に示されているが、TCSが、アレルギー性皮膚疾患を緩和する機構は³⁸知られていなかった。蛍光マイクロプレートアッセイを使用してdetailedがこのビデオでは、我々は最近、2μMという低濃度でTCSは、かなりこれらの臨床データ²のための潜在的な説明を提供して、マスト細胞機能と脱顆粒を減衰することを実証した。これらの臨床データの説明を提供することに加えて、パーマーら、我々の知見は、 図 ^{2には、TCS}がカルシウム流入の下流シグナル伝達分子標的とすることを示唆している。多くの免疫学的および他の生物学的プロセスにおけるカルシウムシグナル伝達の重要性のために、TCSは、潜在的に必要な生物学的プロセスの様々に悪影響を及ぼす可能性がある。実際には、Udoji ら ^39は、TCSが別の重要な先天性免疫機能、ヒトナチュラルキラー細胞溶解活性を抑制することが示された。

アレルギー性皮膚疾患（または、逆に、免疫毒性など）で治療補助としての可能性を超えて、TCSもかく乱^40-49内分泌かもしれません。このように、溶液中のこの化学物質を準備する方法についての明確な手順I毒物への興味のあるの。 TCSが小さい疎水性分子であるため、有機ビヒクルは、しばしば、水に溶けやすくするために使用される。 TCSがテストされているほとんどの毒性試験では、製剤は、エタノール、アセトン、または油^2,50,51などの有機溶媒を用いて水に溶解関与している。しかし、しばしばこれらの溶剤は、それによって被験物質データ⁵¹の解釈を複雑にし、自分自身を生物学的に活性である。実際には、Rufli らによる^。52等⁵³は、水生毒性実験のための試験溶液は、毒性成果物を作成するための化学溶媒の電位により、化学的方法を介して物理的方法を用いて調製されることが推奨される。我々は以前TCSが0.24％のエタノール/水（体積/体積）中に溶解し、30分を減衰RBLマスト細胞の脱顆粒²超音波処理することを示した。 0.24％より高い濃度でエタノールが肥満細胞degraを抑制することが示されているnulation ^{54,55-examples}の毒性試験で有機溶剤の潜在的交絡効果の。

それだけではなく生物又は研究のために使用される細胞に対する溶媒の影響を考慮することが重要であるだけでなく、それは被験物質自体に溶媒の影響を監視することが重要である。たとえば、Skaare ら ^51は、油中の解散は、関数の完全な損失を引き起こしながら、（一般的に歯磨きやうがい薬で見つかった）ポリエチレングリコールでTCSを溶解が健康な女性の女性の抗細菌および抗プラーク効果を弱めていることがわかった。したがって、異なる溶媒の能力はTCSを含む、毒物および薬物を調節するために、効果をアッセイ設計において考慮されるべきである。油または風味添加物の使用は様々な製品^50,51におけるTCSの効果を妨げる可能性があります。

有機溶剤を使用する必要性を排除する目的で、我々は、有機ゾルの使用を排除することによってTCS ^2を溶解させるための手法に改良ベント。現在のプロトコルでは、我々は熱（≤50°C）で水性緩衝液に直接TCS顆粒を溶解した後、紫外可視分光光度法によってこのTCSの株式の濃度を確認してください。 TCSは、40μM（最大水溶性であるため、これらの改良が可能であるhttp://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ）および50℃（加熱されたときに分解に抵抗することが示されているhttp:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ^）56,57。 TCSも強く4,200 L /モル/ cmで¹²モル吸光係数が280nmの⁵⁸で吸収することが知られているように、我々はまた、UV-可視分光測定の付加的な利点を有する。

このプロトコルは、低コストかつ迅速な検証を含む、有機溶剤を使用せずにバッファにTCS顆粒を溶解するために、シンプルでありながら効果的な方法を提供濃度、およびマスト細胞の脱顆粒に対する化学的影響を監視するための強力な蛍光マイクロプレートアッセイを説明しています。

Protocol

すべてのバッファレシピがプロトコルテキストの末尾の表に含まれていることに注意してください。 1日目 ： 1。細胞の調製エッジ効果を避けるために、レイアウト上の試験サンプルを中心に、96ウェルプレートセットアップ方式を計画。割り当て3は、各TCS濃度は（抗原またはイオノフォアの±脱顆粒刺激）テストだけでなく、自然…

Representative Results

90分間50℃に加熱すると、TCSのためのUV-可視吸収スペクトルは図1に示すように、280nmの付近のピークで、260〜300nmの間の強力な、滑らかな曲線を生成する。 UV-可視分光光度計は、従って、280nmで公開されてモル吸光係数が4,200 L /モル/ cmで12であるので、濃度を計算するために利用することができる重要なツールである。我々は、TCSが50°Cに加熱した（データは示さず）後に、全体の脱顆粒…

Discussion

2004年に、Naal ら ^は、脱顆粒¹の高スループット試験のため、肥満細胞バイオセンサーを開発した。それは私達が私達のTCS研究のために適応され、このビデオで詳述していることを堅牢アッセイである。前にNaal ら ¹アッセイ、マスト細胞の脱顆粒が日常β-ヘキソサミニダーゼ^59-61によって評価が、これらの初期の方法は、一つのサンプルを一度に読み込みされた?…

Materials

RBL-2H3 Cells	ATCC	CRL-2256	The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC
Triclosan/Irgasan	Sigma	72779 CAS# 3380-34-5	Should be stored in a low humidity environment
Trypsin	Gibco	25300-054 CAS# 3380-34-5
EMEM	Lonza	12-611F
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Gentamycin Sulfate	Lonza Biological Sciences	17-518
Albumin, Bovine Serum	Calbiochem	12659 CAS# 9048-46-8
Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)	Pierce	28314 CAS# 9002-93-1
HEPES	J.T Baker	4153-01 CAS# 75277-39-3
Magnesium Chloride	VWR	BDH0244-500G CAS# 7791-18-6
D-(+)-Glucose	Biomedicals	152527 CAS# 50-99-7
Potassium Chloride Crystal	J.T Baker	3046-01 CAS# 7447-40-7
Calcium chloride dihyrdate	Acros Organics	207780010 CAS# 10035-04-8
Glycine	Sigma	G8898 CAS# 56-40-6
4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)	EMD Biosciences	474502-250MG CAS # 37067-30-4	Wrap in foil – is light-sensitive
Anti-DNP Mouse IgE	Sigma	D8406	Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.
DNP-BSA	Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University		Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018
Calcium Ionophore A23187	Sigma	C75-22-1mg	Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully
DMSO	Sigma	D2650 CAS# 67-68-5
Acetic Acid	VWR	BDH3094-2 CAS# 64-19-7
Anhydrous Sodium Carbonate	Sigma	222321 CAS# 497-19-8
Sodium Chloride	Sigma	71376 CAS# 7647-14-5
Hydrochloric Acid	VWR	BDH3026 CAS# 7647-01-0
Reference Buffer, pH 7	VWR	BDH5046
Reference Buffer, pH 10	VWR	BDH5072
Reference Buffer, pH 4	VWR	BDH5018
pH electrode storage solution	VWR	14002-828
			Equipment:
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
DU 7500 Spectrophotometer	Beckmann	No longer sold
Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software	BioTek	Module S
Hematocytometer	Hausser Scientific	3110
7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate	VWR	97042-634
Centrifuge	Eppendorf	5430
Tissue culture water bath	VWR	Model# 89032-206
Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood)	The Baker Company	Model# SG403A-HE
Tissue culture incubator	ThermoScientific	Model# 3598
Pipetman	VWR		Range: P2-P1000
Balance	Mettler Toledo	Model# AG204
pH meter	Symphony/VWR	Model# SB70P
Pipet-Aid	Drummond Scientific	4-000-100
Combitip dispenser	Eppendorf	4981 000.019
			Recipes:
Name	Recipe	Notes
Acetate Buffer, pH 4.4	Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml	Sterile Filter into autoclaved glass bottle
Substrate (4-MU)	Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again	For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer
Glycine Carbonate Buffer, pH 10	26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10	Sterile filter into autoclaved glass bottle
Tyrodes (2 L), pH 7.4	135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4	Sterile filter into autoclaved glass bottle
RBL Cell Media	Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.	Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle
			Plastic material used:
Material Name	Company	Catalogue Number	Type of Plastic
200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack	VWR	53509-009	polypropylene
1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery	VWR	89003-420	polyethylene
10 µl micro tip low binding sterile	VWR	14217-704	polypropylene
Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force	VWR	20170-038	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-178	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-103	polypropylene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	690175	polystyrene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	658175	polystyrene
CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	607180	polystyrene
CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	710180	polystyrene
CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	606180	polystyrene
CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	760180	polystyrene
1 cm cuvettes	N/A	N/A	polystyrene
CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate	Greiner Bio One	655086	polystyrene
Combitips	Eppendorf	022266501	Polypropylene/ polyethylene