Um Ensaio de microplacas para avaliar os efeitos químicos de RBL-2H3 degranulação dos mastócitos: Efeitos do Triclosan, sem utilização de solventes orgânicos

Summary

Degranulação dos mastócitos, a liberação de mediadores alérgicos, é importante para alergia, asma e defesa do parasita. Aqui demonstramos ^uma técnicas para a avaliação dos efeitos de drogas e de substâncias tóxicas em desgranulação, a metodologia utilizada recentemente para expor o efeito inibidor potente do agente antibacteriano triclosano ^2.

Abstract

Os mastócitos desempenham um papel importante na doença alérgica e de defesa imunológica contra parasitas. Uma vez activado (por exemplo, por um alérgeno), eles desgranulam, um processo que resulta na exocitose de mediadores alérgicos. Modulação da desgranulação dos mastócitos por drogas e substâncias tóxicas podem ter efeitos positivos ou negativos sobre a saúde humana. Função de mastócitos foi dissecada em pormenor com a utilização de mastócitos de leucemia basófilas de rato (RBL-2H3), um modelo amplamente aceito de mastócitos das mucosas humanas ^3-5. Componente de mastro de células granulares e o mediador alérgica β-hexosaminidase, que é libertado de forma linear em conjunto com a histamina dos mastócitos ^6, pode ser facilmente e confiantemente ser medido por meio de reacção com um substrato f luorogénico, obtendo-se a intensidade de fluorescência mensurável num ensaio de microplacas que é passível de estudos de alto rendimento ^1. Originalmente publicado por Naal et al. ^1, que se adaptaram este ensaio degranulação para a triagem of drogas e substâncias tóxicas e demonstrar seu uso aqui.

Triclosan é um agente antibacteriano de largo espectro, que está presente em muitos produtos de consumo e foi encontrado ser uma ajuda terapêutica na doença alérgica da pele humana ^7-11, embora o mecanismo deste efeito é desconhecido. Aqui demonstramos um ensaio para o efeito do triclosan sobre a desgranulação de mastócitos. Mostramos recentemente que triclosan afeta fortemente a função dos mastócitos ^2. Em um esforço para evitar a utilização de um solvente orgânico, o triclosan é dissolvida directamente em tampão aquoso com calor e agitação, e a concentração resultante é confirmado por espectrofotometria de UV-Vis (usando ε ₂₈₀ = 4,200 L / M / cm) ^12. Este protocolo tem o potencial para ser usado com uma variedade de produtos químicos para determinar os seus efeitos sobre a desgranulação de mastócitos e, mais genericamente, o seu potencial alérgico.

Introduction

Os mastócitos são altamente granulado células imunes efetoras que servem como mediadores importantes na asma, alergias, parasitas defesa e carcinogênese ^13-16. Eles residem em quase todos os tecidos vascularizados ^15, onde armazenar com segurança os mediadores inflamatórios e alérgicos em grânulos citoplasmáticos até ser ativado para desgranulam. Degranulação é a exocitose de grânulos à membrana, o que resulta na liberação de mediadores farmacologicamente ativos, tais como a histamina, triptase, leucotrienos e ^15. Este processo resulta na iniciação de reacções de hipersensibilidade do tipo I, que são críticas para a montagem de defesa contra parasitas bem como o início de reacções alérgicas, asma, e ¹⁵ cancerígenas.

Os mastócitos e basófilos, FceRI expressam receptores, os receptores de alta afinidade para a imunoglobulina E (IgE) ^17. A exposição a um alergénio ou antigénio provoca a agregação de múltiplos receptores de IgE FceRI ligados ^17, e é este so-chamada "reticulação" de receptores Fc de IgE ligadas, que inicia o processo de desgranulação: uma cascata de acontecimentos de fosforilação de tirosina, a activação de fosfolipase C, o efluxo de cálcio das reservas internas, e influxo de cálcio para dentro da célula ^18. Este influxo de cálcio é necessária para a desgranulação e, ainda, sinaliza a fusão com a membrana dos grânulos antes de causar a exocitose de grânulos ^15. Experimentalmente, um ionóforo de cálcio pode ser utilizada para transporte de cálcio directamente através da membrana da célula ^19, o que evita essencialmente todas as etapas de transdução de sinal, antes da etapa ²⁰ do influxo de cálcio, permitindo a identificação de um alvo por via de um tóxico como estando a montante ou a jusante de cálcio de sinalização ^20.

Degranulação pode ser medido de forma rápida e eficaz, o controlo da libertação de β-hexosaminidase no sobrenadante de células, que é libertada a partir dos grânulos de forma linear juntamente com a histamina ^6, mas ié muito mais fácil de detectar utilizando uma reacção enzima-substrato simples e um leitor de microplacas para análise do produto fluorescente. Este ensaio de microplacas, como descrito na secção do protocolo, baseia-se num método robusto originalmente desenvolvida por Naal et ai. ^1, que quantifica a clivagem do substrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-N-acetil–D-β glucosaminide por β- hexosaminidase. Nós modificamos o ensaio para efeitos de teste de drogas e substâncias tóxicas, com triclosan destaque aqui. Este método quantifica fiável desgranulação, é uma alternativa de baixo custo para, por exemplo, o fluxo de métodos de detecção baseados em citometria de ^21, e tem o potencial de se prestar bem para rastreio de alto rendimento de uma grande variedade de fármacos anti-alérgicos, assim como imunotóxicas ou substâncias químicas alergênicas. Este último ponto é particularmente importante, tendo em conta o relatório do Conselho Nacional de Pesquisa 2007 "Ensaios de Toxicidade no ^Século 21: Uma visão e uma StratEGY "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), que preconiza para o desenvolvimento de testes de toxicologia de alto rendimento que utilizam a cultura de células para reduzir a utilização dispendiosa de animais tradicionais, tais como ratinhos de laboratório. O protocolo desenvolvido pela desgranulação Naal et ai. ^1, e modificada por nós ^2, utiliza a linha de células RBL-2H3, que é um modelo bem aceite homóloga aos mastócitos das mucosas humanas ou basófilos ^3-5. (Métodos para a cultura de células RBL-2H3 estão detalhados em Hutchinson et al. ^22). Este ensaio poderia provavelmente ser adaptado a qualquer tipo de célula mastro em anexo.

Triclosan (TCS) é um antimicrobiano de amplo espectro que tem sido utilizado por mais de 30 anos em hospitais, produtos de cuidados pessoais e de bens de consumo ^23,24. O modo de ação para a característica antimicrobiana da TCS é a inibição da biossíntese de ácidos graxos, provavelmente inibindo enoil-acilproteína transportadora reductase ^25,26. É encontrado em todo o mundo em uma ampla gama de produtos de consumo, tais como gel de banho, loção para as mãos, creme dental, enxaguatório bucal, e na mão sabonetes em concentrações de até 0,3% ou 10 mM ^24. O uso generalizado de TCS resultou em níveis detectáveis ​​em humanos ^27-29 e em rios e córregos ^30. Um estudo feito pela Allmyr et al. ²⁷ demonstraram que a TCS e seus metabólitos estão presentes tanto no plasma e no leite de mães que amamentam. Importante, a TCS é facilmente absorvido pela pele ^31-37. Queckenberg et ai. Encontrado ³⁷ ~ 10% a absorção de um ~ 70 mM TCS creme na pele humana, dentro de 12 horas, resultando em uma concentração significativa na pele, onde residem os mastócitos.

SCT foi demonstrado clinicamente para controlar a doença alérgica da pele humana ^7-11, mas o mecanismo pelo qual a TCS alivia as doenças alérgicas de pele tem sido desconhecido ^38. Usando o ensaio de fluorescência de microplacas detailed neste vídeo, demonstramos recentemente que a TCS, a concentrações tão baixas quanto 2 uM, atenua significativamente a função de mastócitos e desgranulação, proporcionando uma potencial explicação para estes dados clínicos ^2. Além de proporcionar uma explicação para estes dados clínicos, os nossos resultados em Palmer et al. ² sugerem que a TCS de sinalização tem como alvo a jusante das moléculas do influxo de cálcio. Devido à importância da sinalização de cálcio em muitos outros processos imunológicos e biológicos, a TCS poderia ter efeitos adversos sobre uma ampla variedade de processos biológicos necessários. Na verdade, Udoji et al. ³⁹ mostrou que TCS suprime a atividade das células natural killer humano lítico, outra função imune inato importante.

Para além do seu potencial como uma ajuda terapêutica na doença alérgica da pele (ou, inversamente, como um immunotoxicant), TCS também pode ser um disruptor endócrino ^40-49. Assim, um procedimento claro de como preparar este produto químico em solução is de interesse para os toxicologistas. Porque SCT é uma pequena molécula hidrófoba, os veículos orgânicos são muitas vezes utilizados para torná-lo mais solúvel em água. Na maioria dos estudos de toxicidade em que a TCS foi testado, a preparação envolveu a dissolução em água com o auxílio de um solvente orgânico tal como etanol, acetona, ou óleo ^2,50,51. No entanto, muitas vezes esses solventes são biologicamente ativa-se, complicando assim a interpretação da substância em estudo de dados ^51. Na verdade, de acordo com Rufli et al. ⁵² e outros ^53, recomenda-se que as soluções de ensaio para ensaios de toxicidade aquática são preparadas utilizando métodos físicos sobre os métodos químicos, devido ao potencial de solventes químicos para criar artefactos de toxicidade. Nós mostramos anteriormente que a TCS dissolvido em 0,24% de etanol / água (v / v) e sonicado por 30 min amortece RBL degranulação dos mastócitos ^2. O etanol em concentrações mais elevadas do que 0,24% foi mostrado para amortecer degradação mastócitoscanulação ^54,55, exemplos dos efeitos potencialmente de confusão de solventes orgânicos em estudos de toxicidade.

Não só é importante ter em conta o efeito de solventes no organismo ou células utilizadas para o estudo, mas também é importante para monitorizar o efeito de um solvente sobre o próprio produto químico de teste. Por exemplo, Skaare et ai. Dissolvendo ⁵¹ descobriram que a TCS em polietileno-glicol (normalmente encontrados nos dentífricos e bochechos) atenuou os efeitos anti-bacterianos e anti-placa em mulheres saudáveis ​​do sexo feminino durante a dissolução em óleos provocou uma perda completa de função. Portanto, a capacidade de diferentes solventes para modular tóxico e de drogas, incluindo TCS, efeitos devem ser considerados no desenho do ensaio. A utilização de óleos ou aditivos de sabor pode interferir com os efeitos de TCS em vários produtos ^50,51.

Num esforço para eliminar a necessidade de utilizar solventes orgânicos, que melhorado para o nosso método de dissolução TCS ^2, eliminando o uso de um sol orgânicadesabafar. No presente protocolo, dissolver TCS grânulos diretamente em tampão aquoso com o calor (≤ 50 ° C) e, em seguida, verificar a concentração desse estoque TCS por espectrofotometria de UV-Vis. Estas melhorias são possíveis porque SCT é solúvel em água até 40 uM ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) e tem sido demonstrado que resistem à degradação quando aquecido a 50 ° C ( http:// / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) ^56,57. Também tem a vantagem de espectrofotometria de UV-Vis, como TCS também é conhecido por absorvem fortemente a 280 nm, com um ⁵⁸ coeficiente de extinção molar de 4,200 L / mol / cm ^12.

Este protocolo oferece uma maneira simples, mas eficaz para dissolver TCS grânulos para um tampão, sem o auxílio de um solvente orgânico, incluindo o baixo custo e rápida verificaçãode concentração e descreve um ensaio de microplaca fluorescente poderoso para monitorar os efeitos químicos sobre a degranulação dos mastócitos.

Protocol

Note-se que todas as receitas tampão são incluídas numa tabela no final do texto do protocolo. DIA 1: 1. Preparação de Células Planeje 96 poços esquema de configuração da placa, centrando-se amostras no layout, a fim de evitar efeitos de borda. Atribuir três repetições para cada concentração testada TCS (± desgranulação estimulante de antigénio ou ionóforo), bem como triplicados para a libertação espontânea (sem estimu…

Representative Results

Quando aquecida a 50 ° C durante 90 min, o espectro de absorção de UV-Vis de SCT produz uma curva forte, suave entre ~ 260 e 300 nm, com pico a 280 nm, como mostrado na Figura 1. Espectrofotometria de UV-Vis, portanto, é uma importante ferramenta que pode ser utilizada para calcular a concentração, uma vez que o coeficiente de absorção molar publicada a 280 nm é de 4.200 L / mol / cm 12. Nós descobrimos que a TCS não cai para fora da solução durante o período de tempo de todo o experimento desgranul…

Discussion

Em 2004, Naal et ai. ^Uma desenvolveu um biossensor de mastócitos para o ensaio de elevado rendimento de degranulação. É um ensaio robusto que nós adaptamos para os nossos estudos TCS e detalhado neste vídeo. Antes da Naal et ai. Ensaio ^1, a desgranulação dos mastócitos foi avaliada rotineiramente através β-hexosaminidase ^59-61, mas estes métodos iniciais utilizados fluorímetros no qual uma amostra foi lido ao mesmo tempo. Importante, Naal et al. concordância directa e…

Materials

RBL-2H3 Cells	ATCC	CRL-2256	The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC
Triclosan/Irgasan	Sigma	72779 CAS# 3380-34-5	Should be stored in a low humidity environment
Trypsin	Gibco	25300-054 CAS# 3380-34-5
EMEM	Lonza	12-611F
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Gentamycin Sulfate	Lonza Biological Sciences	17-518
Albumin, Bovine Serum	Calbiochem	12659 CAS# 9048-46-8
Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)	Pierce	28314 CAS# 9002-93-1
HEPES	J.T Baker	4153-01 CAS# 75277-39-3
Magnesium Chloride	VWR	BDH0244-500G CAS# 7791-18-6
D-(+)-Glucose	Biomedicals	152527 CAS# 50-99-7
Potassium Chloride Crystal	J.T Baker	3046-01 CAS# 7447-40-7
Calcium chloride dihyrdate	Acros Organics	207780010 CAS# 10035-04-8
Glycine	Sigma	G8898 CAS# 56-40-6
4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)	EMD Biosciences	474502-250MG CAS # 37067-30-4	Wrap in foil – is light-sensitive
Anti-DNP Mouse IgE	Sigma	D8406	Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.
DNP-BSA	Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University		Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018
Calcium Ionophore A23187	Sigma	C75-22-1mg	Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully
DMSO	Sigma	D2650 CAS# 67-68-5
Acetic Acid	VWR	BDH3094-2 CAS# 64-19-7
Anhydrous Sodium Carbonate	Sigma	222321 CAS# 497-19-8
Sodium Chloride	Sigma	71376 CAS# 7647-14-5
Hydrochloric Acid	VWR	BDH3026 CAS# 7647-01-0
Reference Buffer, pH 7	VWR	BDH5046
Reference Buffer, pH 10	VWR	BDH5072
Reference Buffer, pH 4	VWR	BDH5018
pH electrode storage solution	VWR	14002-828
			Equipment:
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
DU 7500 Spectrophotometer	Beckmann	No longer sold
Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software	BioTek	Module S
Hematocytometer	Hausser Scientific	3110
7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate	VWR	97042-634
Centrifuge	Eppendorf	5430
Tissue culture water bath	VWR	Model# 89032-206
Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood)	The Baker Company	Model# SG403A-HE
Tissue culture incubator	ThermoScientific	Model# 3598
Pipetman	VWR		Range: P2-P1000
Balance	Mettler Toledo	Model# AG204
pH meter	Symphony/VWR	Model# SB70P
Pipet-Aid	Drummond Scientific	4-000-100
Combitip dispenser	Eppendorf	4981 000.019
			Recipes:
Name	Recipe	Notes
Acetate Buffer, pH 4.4	Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml	Sterile Filter into autoclaved glass bottle
Substrate (4-MU)	Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again	For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer
Glycine Carbonate Buffer, pH 10	26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10	Sterile filter into autoclaved glass bottle
Tyrodes (2 L), pH 7.4	135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4	Sterile filter into autoclaved glass bottle
RBL Cell Media	Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.	Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle
			Plastic material used:
Material Name	Company	Catalogue Number	Type of Plastic
200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack	VWR	53509-009	polypropylene
1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery	VWR	89003-420	polyethylene
10 µl micro tip low binding sterile	VWR	14217-704	polypropylene
Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force	VWR	20170-038	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-178	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-103	polypropylene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	690175	polystyrene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	658175	polystyrene
CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	607180	polystyrene
CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	710180	polystyrene
CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	606180	polystyrene
CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	760180	polystyrene
1 cm cuvettes	N/A	N/A	polystyrene
CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate	Greiner Bio One	655086	polystyrene
Combitips	Eppendorf	022266501	Polypropylene/ polyethylene