Organik Solvent kullanımı olmadan Triklosan Etkileri: RBL-2H3 Mast Hücre Degranülasyon üzerinde kimyasal etkileri değerlendirmek için bir Mikroplaka Testi

Summary

Mast hücre degranülasyonu, alerjik aracıların salınması, alerji, astım ve parazit savunmada önemlidir. Burada degranülasyonunun uyuşturucu ve toksik etkileri değerlendirmek için teknikleri ¹ göstermek, yöntem son zamanlarda antibakteriyel madde triklosan ² güçlü inhibitör etkisi sergilemeye kullandı.

Abstract

Mast hücreleri alerjik hastalık ve parazitlere karşı bağışıklık önemli rol oynamaktadır. Bir kez (bir alerjen tarafından gibi) aktif, onlar degranüle, bir süreç bu alerjik aracıların ekzositoz ile sonuçlanır. Ilaç ve toksik maddeler ile mast hücre degranülasyonu modülasyonu insan sağlığı üzerinde olumlu veya olumsuz etkileri olabilir. Mast hücre fonksiyonu fare bazofilik lösemi mast hücrelerinin kullanımı (RBL-2H3), ^3-5 insan mukozal mast hücrelerinin yaygın olarak kabul modeli ile ayrıntılı olarak disseke edildi. ⁶ mast hücrelerinden histamin ile birlikte doğrusal olarak serbest bırakılır, mast hücre granül bileşen ve alerjik aracı β-heksosaminidaz, kolay ve güvenilir için uygun olan bir mikroplaka deneyinde ölçülebilir floresans yoğunluğunu verecek şekilde bir florojenik substrat ile reaksiyon yoluyla ölçülebilir yüksek verimli çalışmaları ^1. Başlangıçta Naal ve ark. ¹ tarafından yayınlanan, böylece tarama o için bu tahlil degranülasyonu uyarlanmışf ilaç ve toksik maddeler ve burada kullanımı göstermektedir.

Triklosan birçok üründe mevcut olan ve bu etkinin mekanizması bilinmemektedir, ancak, insan ^7-11 alerjik deri hastalığı tedavi edici bir yardımcı olduğu bulunmuştur geniş spektrumlu bir antibakteriyel maddedir. Burada, mast hücre degranülasyonu üzerinde triklosan etkisi için bir analiz gösterilmektedir. Biz son zamanlarda triklosan güçlü mast hücre fonksiyonu ² etkilediğini gösterdi. Bir organik çözücü kullanımını önlemek için bir çaba olarak, triklosan ısı ve karıştırma ile bir sulu tampon halinde doğrudan eritildi ve elde edilen konsantrasyon ¹² (ε ₂₈₀ = 4.200 L / M / cm kullanılarak), UV-VIS spektrofotometresi kullanılarak teyit edilir. Bu protokol, daha genel olarak da bir alerjik potansiyel mast hücre degranülasyonunu üzerindeki etkilerini belirlemek için çeşitli kimyasalları ile kullanılmak üzere bir potansiyele sahiptir ve.

Introduction

Mast hücreleri son derece astım anahtar arabulucu olarak hizmet immün efektör hücreleri, alerji, parazit savunma ve kanser ^13-16 granül vardır. Degranüle için aktif kadar güvenli bir şekilde sitoplazmik granül alerjik ve inflamatuvar mediatörlerin depoladığınız Onlar, hemen her vaskülarize doku ¹⁵ bulunur. Degranülasyonunun gibi histamin, triptaz ve lökotrienler ¹⁵ olarak farmakolojik olarak aktif mediatörlerin salınımı ile sonuçlanır membrana bağlı granül, en ekzositoz olduğunu. Türü başlatılmasında Bu işlem sonucu ben parazitlere karşı savunma montaj yanı sıra, alerjik astım ve kanserojen yanıtları ¹⁵ başlatmada kritik aşırı duyarlılık reaksiyonları.

Mast hücreleri ve bazofiller FcεRI reseptörleri, imünoglobulin E (IgE) ve ¹⁷ için yüksek afiniteli reseptör çıkarırlar. Bir alerjen ya da antijene maruz kalma çok Ig-bağlı reseptör FcεRI ¹⁷ toplama neden olur ve bu stirosin fosforilasyon olaylarını, iç mağazalarından fosfolipaz C kalsiyum akış aktivasyonu ve hücre ¹⁸ içine kalsiyum akışı bir çağlayan: degranülasyon işlemi başlatır Ig-bağlı Fc reseptörleri "çapraz bağlama" O-adlandırılır. Bu, kalsiyum girişini degranülasyonu için gerekli olan ve bundan başka, granül ekzositozu ¹⁵ neden önce membran ile granül füzyon işaret eder. Deneysel olarak, bir kalsiyum iyonofor yukarı olmak ya da alt akışında bir toksik madde tarafından bir yol hedefin tanımlanması için izin doğrudan aslında tüm sinyal transdüksiyon kalsiyum girişini adımı ^20'ye önce adımlar atlar hücre zarı ¹⁹ üzerinden servis aracı kalsiyum için kullanılabilir kalsiyum ²⁰ sinyal.

Degranülasyon histamin ⁶ yanında granüller doğrusal bir serbest hücre yüzer içine, β-heksosaminidaz salınımını izleyerek hızlı ve etkili bir şekilde ölçülebilir, ancak, Iin daha kolay tahlil floresan ürünü için basit bir enzim-substrat reaksiyonu ve bir mikroplaka okuyucu kullanılarak tespit etmek. Gibi protokol bölümünde ayrıntılı olarak bu mikro-tahlil ile, β-florojenik substrat bölünme 4-metilumbelliferil-N-asetil-β-D-glucosaminide rakamlarla başlangıçta Naal ve ark. Sağlam bir yöntem, ¹ dayanmaktadır heksozaminidaz. Triklosan burada vurgulanır ile Biz, ilaç ve toksik maddelerin test etkileri tahlil değiştirdiniz. Bu yöntem, güvenilir bir degranülasyonu miktarını belirler, örneğin, akış sitometrik-tabanlı algılama yöntemleri ^21, pahalı olmayan bir alternatif olan ve anti-alerjik ilaçlar geniş bir yelpazede yüksek verimli tarama için güzel bir şekilde bir aday potansiyeline sahip, yanı sıra immunotoksik veya alerjik kimyasallar. Bu son nokta ^21. Yüzyılda 2007 Ulusal Araştırma Konseyi raporu "Toksisite Test ışığında özellikle önemlidir: Bir Vizyon ve bir Stratmadır "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 bu da fareler gibi geleneksel laboratuar hayvanlarının pahalı kullanımını azaltmak için hücre kültürü kullanan yüksek verimli toksikoloji testleri geliştirilmesi için savunmaktadır). Naal ve arkadaşları. ¹ tarafından geliştirilen ve bize ² tarafından değiştirilen degranülasyonunun protokolü, homolog insan mukozal mast hücreleri veya bazofil ^3-5 için iyi kabul modeli RBL-2H3 hücre hattı, kullanır. (Kültürlenmesi RBL-2H3 hücreleri için Yöntemler Hutchinson ve ark ayrıntılı olarak açıklanmıştır. ^22). Bu deney, büyük olasılıkla, bağlı mast hücre tipine adapte edilebilir.

Triklosan (TCS) hastaneler, kişisel bakım ürünleri ve tüketim malları ^23,24 fazla 30 yıldır kullanılan bir geniş spektrumlu antimikrobiyal olduğunu. TCS'nin antimikrobiyal özellik için Tesir inhibe enoil-asil ile muhtemelen, yağ asidi biyosentezi inhibisyonutaşıyıcı protein redüktaz ^25,26. Bu tür duş jeli, el kremi, diş macunu, diş macunu, ve% 0.3 ya da 10 mM ²⁴ kadar konsantrasyonlarda sabunda gibi tüketici ürünleri için çok geniş bir yelpazede dünya çapında bulunur. TCS yaygın kullanımı insanlarda ^27-29 ve nehir ve akarsu ³⁰ saptanabilir düzeyde sonuçlandı. Allmyr ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışma. ²⁷ TCS ve metabolitleri plazma ve emziren anneler süt hem de mevcut olduğunu göstermiştir. Önemli olarak, TCS kolayca deri ^31-37 emilir. Queckenberg ve ark. ³⁷ mast hücrelerin bulunduğu cilt, önemli konsantrasyonu ile sonuçlanan, 12 saat içinde insan deri içine bir ~ 70 mM TCS krem ~% 10 emilme bulduk.

TCS insan alerjik deri hastalığı ^7-11 yönetmek için klinik olarak gösterilmiştir, ama TCS alerjik deri hastalıkları hafifletir hangi mekanizma ³⁸ bilinmeyen olmuştur. Floresan mikro testi ayrıntılı açıklamalar yapmak Kullanımıd bu video, son zamanlarda 2 mcM kadar düşük konsantrasyonlarda TCS, önemli ölçüde bu klinik verileri ² için potansiyel bir açıklama getirmek, mast hücre fonksiyonu ve degranülasyonuna azalttığı göstermiştir. Bu klinik veriler için bir açıklama sağlamak için ek olarak, Palmer vd bulgular. ² TCS Kalsiyum girişi aşağı sinyal molekülleri hedef olduğunu göstermektedir. Birçok immünolojik ve diğer biyolojik süreçlerde sinyal kalsiyum önemi nedeniyle, TCS potansiyel olarak gerekli biyolojik süreçlerin çok çeşitli olumsuz etkileri olabilir. Aslında, Udoji ve ark. ³⁹ ASR önemli bir doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu, insan doğal katil hücre litik aktivitesini baskıladığı gösterdi.

Alerjik deri hastalığı (ya da tam tersine, bir immunotoxicant gibi) bir tedavi aracı olarak potansiyel ötesinde, TCS da Topu ^40-49 bir endokrin olabilir. Bu nedenle, çözüm bu kimyasal hazırlamak konusunda net bir prosedür itoksikoloji ilgilendiren s. TCS küçük hidrofobik molekülün olduğu için, organik bir araç genellikle su içinde daha fazla çözünür hale getirmek için kullanılır. TCS test edilmiştir en toksisite çalışmalarında, hazırlama, örneğin etanol, aseton, ^2,50,51 veya yağ gibi bir organik çözücü yardımı ile su içinde çözünme yer almıştır. Ancak, çoğu kez bu çözücülerin ve böylece test kimyasal veriler ⁵¹ yorumlanması zorlaştıran, kendileri biyolojik olarak aktiftir. Aslında, Rufli et al. ⁵² ve diğerleri ^53, bu akut toksisite deneylerinde test solüsyonları toksisite eserler oluşturmak için kimyasal çözücüler potansiyeli nedeniyle, kimyasal yöntemlere göre fiziksel yöntemler kullanılarak hazırlanır önerilir. Daha önce TCS% 0.24 etanol / su (hacim / hacim) içinde çözüldü ve 30 dakika azaltan RBL mast hücre degranülasyonunu ² sonike göstermiştir. % 0.24 'den daha yüksek konsantrasyonlarda Etanol mast hücre degra engellemek için gösterilmiştirnulation ^{54,55-örnekler} toksisite çalışmaları organik çözücülerin potansiyel karıştırıcı etkileri.

Sadece bu organizma ya da çalışma için kullanılan hücreler üzerinde çözücülerin etkisi dikkate alınması önemlidir, ama aynı zamanda bu test kimyasal kendisinde bir çözücü etkisini izlemek için önemlidir. Örneğin, Skaare ve ark. ⁵¹ yağların erime fonksiyonunun tam kaybına yol ise polietilen glikol TCS (genellikle diş macunu ve gargara bulunan) eritilmesi sağlıklı kadın kadınlarda anti-bakteriyel ve anti-plak etkilerini zayıflattı bulundu. Bu nedenle, farklı çözücüler yeteneği TCS da dahil olmak üzere toksik madde ve modüle etmek için ilaç, etkilerini tahlil tasarımında dikkate alınmalıdır. Yağ veya lezzet Katkı maddelerinin kullanımı çeşitli ürünler ^50,51 içinde TCS etkilerini etkileyebilir.

Organik çözücüler kullanma ihtiyacı ortadan kaldırmak için bir çaba olarak, organik bir sol ve kullanımı ortadan kaldırarak TCS ² çözülmesi için yöntem üzerine geliştirilmişdelik. Bu protokol, ısı (≤ 50 ° C) ile sulu tampon doğrudan TCS granül çözülür ve daha sonra UV-Vis spektrofotometresi bu TCS stok konsantrasyonu doğrulayın. TCS 40 uM (kadar suda çözünür olduğu için bu gelişmeler mümkündür http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) ve 50 ° C (ısıtıldığında, bozulmaya karşı dayanıklı gösterilmiştir http / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) ^56,57. TCS da güçlü 4.200 L / mol / cm ¹² molar sönüm katsayısı ile 280 nm ⁵⁸ de emmek için bilindiği gibi biz de, UV-Vis spektrofotometre yararı var.

Bu protokol, düşük maliyetli ve hızlı bir şekilde tesbit de dahil olmak üzere bir organik çözücü yardımı olmadan, bir tampon içine TCS granüller çözmek için basit ama etkili bir yol sağlarkonsantrasyon ve mast hücre degranülasyonu kimyasal etkileri izlenmesi için güçlü bir floresan mikro testi açıklar.

Protocol

Tüm tampon tarifleri protokol metnin sonunda bir tabloya dahil unutmayın. 1. GÜN: 1. Hücrelerinin Hazırlanması Kenar etkileri önlemek için düzen üzerinde test örnekleri merkezleme, 96 plaka kurulum düzeni dışarı planlayın. Ayırma her biri üç adet TCS konsantrasyonu test edilen (antijen ya da iyonoforun ± degranülasyonu uyarıcı), hem de standart hatası spontan salım için (Resim degranülasyonu uyarıcı), maksimum s…

Representative Results

50 kadar ısıtıldığında ° C de 90 dakika boyunca, ASR UV Vis absorbans spektrumu Şekil 1 'de gösterilen, 280 nm'de bir zirve ile yaklaşık 260 ve 300 nm arasında güçlü, hafif bir eğri, üretir. 280 nm Molar soğurma katsayısı yayınlanan 4,200 L / mol / cm 12 olduğu için UV-VIS spektrofotometresi, bu nedenle, konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılabilecek önemli bir araçtır. Biz TCS 50 ° C ısıtma (veriler gösterilmemiştir) ardından, tüm degranülasyonunun deney zaman dilim…

Discussion

2004 yılında, Naal ve ark. ¹ degranülasyonu yüksek verimlilik testleri için bir mast hücre biyosensör geliştirildi. Bu bizim TCS çalışmaları için uyarlanmış ve bu video ayrıntılı var ki sağlam bir testtir. Önceki Naal ve ark. ¹ denemesi, mast hücre degranülasyonu rutin olarak β-heksosaminidaz ^59-61 ile değerlendirilir, ancak bu yöntemler, bir erken örnekleme bir anda okunur edildiği Fluorometreler faydalanılmıştır. Önemli olarak, Naal ve ark. onları…

Materials

RBL-2H3 Cells	ATCC	CRL-2256	The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC
Triclosan/Irgasan	Sigma	72779 CAS# 3380-34-5	Should be stored in a low humidity environment
Trypsin	Gibco	25300-054 CAS# 3380-34-5
EMEM	Lonza	12-611F
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Gentamycin Sulfate	Lonza Biological Sciences	17-518
Albumin, Bovine Serum	Calbiochem	12659 CAS# 9048-46-8
Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)	Pierce	28314 CAS# 9002-93-1
HEPES	J.T Baker	4153-01 CAS# 75277-39-3
Magnesium Chloride	VWR	BDH0244-500G CAS# 7791-18-6
D-(+)-Glucose	Biomedicals	152527 CAS# 50-99-7
Potassium Chloride Crystal	J.T Baker	3046-01 CAS# 7447-40-7
Calcium chloride dihyrdate	Acros Organics	207780010 CAS# 10035-04-8
Glycine	Sigma	G8898 CAS# 56-40-6
4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)	EMD Biosciences	474502-250MG CAS # 37067-30-4	Wrap in foil – is light-sensitive
Anti-DNP Mouse IgE	Sigma	D8406	Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.
DNP-BSA	Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University		Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018
Calcium Ionophore A23187	Sigma	C75-22-1mg	Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully
DMSO	Sigma	D2650 CAS# 67-68-5
Acetic Acid	VWR	BDH3094-2 CAS# 64-19-7
Anhydrous Sodium Carbonate	Sigma	222321 CAS# 497-19-8
Sodium Chloride	Sigma	71376 CAS# 7647-14-5
Hydrochloric Acid	VWR	BDH3026 CAS# 7647-01-0
Reference Buffer, pH 7	VWR	BDH5046
Reference Buffer, pH 10	VWR	BDH5072
Reference Buffer, pH 4	VWR	BDH5018
pH electrode storage solution	VWR	14002-828
			Equipment:
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
DU 7500 Spectrophotometer	Beckmann	No longer sold
Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software	BioTek	Module S
Hematocytometer	Hausser Scientific	3110
7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate	VWR	97042-634
Centrifuge	Eppendorf	5430
Tissue culture water bath	VWR	Model# 89032-206
Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood)	The Baker Company	Model# SG403A-HE
Tissue culture incubator	ThermoScientific	Model# 3598
Pipetman	VWR		Range: P2-P1000
Balance	Mettler Toledo	Model# AG204
pH meter	Symphony/VWR	Model# SB70P
Pipet-Aid	Drummond Scientific	4-000-100
Combitip dispenser	Eppendorf	4981 000.019
			Recipes:
Name	Recipe	Notes
Acetate Buffer, pH 4.4	Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml	Sterile Filter into autoclaved glass bottle
Substrate (4-MU)	Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again	For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer
Glycine Carbonate Buffer, pH 10	26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10	Sterile filter into autoclaved glass bottle
Tyrodes (2 L), pH 7.4	135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4	Sterile filter into autoclaved glass bottle
RBL Cell Media	Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.	Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle
			Plastic material used:
Material Name	Company	Catalogue Number	Type of Plastic
200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack	VWR	53509-009	polypropylene
1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery	VWR	89003-420	polyethylene
10 µl micro tip low binding sterile	VWR	14217-704	polypropylene
Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force	VWR	20170-038	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-178	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-103	polypropylene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	690175	polystyrene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	658175	polystyrene
CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	607180	polystyrene
CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	710180	polystyrene
CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	606180	polystyrene
CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	760180	polystyrene
1 cm cuvettes	N/A	N/A	polystyrene
CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate	Greiner Bio One	655086	polystyrene
Combitips	Eppendorf	022266501	Polypropylene/ polyethylene