Un ensayo de microplacas para evaluar los efectos químicos sobre RBL-2H3 mástil degranulación: Efectos de Triclosan y sin uso de un disolvente orgánico

Summary

Degranulación de los mastocitos, la liberación de mediadores alérgicos, es importante en la alergia, el asma, y ​​la defensa parásito. Aquí demostramos técnicas ¹ para evaluar los efectos de las drogas y las sustancias tóxicas en la degranulación, la metodología utilizada recientemente para exhibir el poderoso efecto inhibidor del agente antibacteriano triclosán ^2.

Abstract

Los mastocitos juegan un papel importante en la enfermedad alérgica y la defensa inmune contra parásitos. Una vez activado (por ejemplo, por un alergeno), se desgranulan, un proceso que resulta en la exocitosis de mediadores alérgicos. La modulación de la degranulación de los mastocitos por las drogas y las sustancias tóxicas pueden tener efectos positivos o negativos sobre la salud humana. La función de los mastocitos ha sido diseccionado en detalle con el uso de mastocitos de rata leucémicas basófilas (RBL-2H3), un modelo ampliamente aceptado de mastocitos de la mucosa humanos ^3-5. Mástil componente de células granulares y el mediador alérgica β-hexosaminidasa, que se libera linealmente en tándem con histamina de los mastocitos ^6, se pueden medir fácilmente y de forma fiable a través de la reacción con un sustrato fluorogénico, dando la intensidad de fluorescencia medible en una microplaca de ensayo que es susceptible de alto rendimiento estudios ^1. Publicado originalmente por Naal et. Al ^1, hemos adaptado este ensayo degranulación para la detección of drogas y sustancias tóxicas y demostrar su uso aquí.

El triclosán es un agente antibacteriano de amplio espectro que está presente en muchos productos de consumo y se ha encontrado para ser una ayuda terapéutica en la enfermedad alérgica de la piel humana ^7-11, aunque se desconoce el mecanismo de este efecto. Aquí se demuestra un ensayo para el efecto de triclosán en la degranulación de los mastocitos. Recientemente, hemos mostrado que el triclosán afecta en gran medida la función de los mastocitos ^2. En un esfuerzo por evitar el uso de un disolvente orgánico, el triclosán se disuelve directamente en tampón acuoso con calor y agitación, y la concentración resultante se confirmó usando espectrofotometría UV-Vis (utilizando ε ₂₈₀ = 4.200 L / M / cm) ^12. Este protocolo tiene el potencial para ser utilizado con una variedad de productos químicos para determinar sus efectos sobre la desgranulación de los mastocitos, y en términos más generales, su potencial alérgico.

Introduction

Los mastocitos son altamente granular células inmunes efectoras que sirven como mediadores en el asma, las alergias, parásitos de defensa y la carcinogénesis ^13-16. Ellos residen en casi todos los tejidos vascularizados ^15, donde se almacenan de forma segura mediadores inflamatorios y alérgicos en los gránulos citoplasmáticos hasta que se activa a degranulación. La desgranulación es la exocitosis de gránulos unidos a la membrana, lo que resulta en la liberación de mediadores farmacológicamente activos, tales como histamina, triptasa, y los leucotrienos ^15. Este proceso resulta en la iniciación de las reacciones de hipersensibilidad de tipo I que son críticos en la defensa contra los parásitos de montaje, así como el inicio de las respuestas alérgicas, asmáticas, y carcinogénicos ^15.

Los mastocitos y basófilos expresan receptores varepsilon RI, los receptores de alta afinidad para la inmunoglobulina E (IgE) ^17. La exposición a un alérgeno o antígeno provoca la agregación de múltiples receptores varepsilon RI de IgE enlazados a ^17, y es este so-llamado "reticulación" de los receptores de Fc de IgE unidas a que inicie el proceso de desgranulación: una cascada de eventos de fosforilación de tirosina, la activación de la fosfolipasa C, flujo de calcio desde las reservas internas, y la afluencia de calcio en la célula ^18. Este influjo de calcio es necesario para la desgranulación, y, además, señales de fusión de gránulos con la membrana antes de causar la exocitosis de los gránulos ^15. Experimentalmente, un ionóforo de calcio se puede utilizar para transportar calcio directamente a través de la membrana de la célula ^19, que esencialmente no pasa por todos los pasos de transducción de señales antes de la etapa influjo de calcio ^20, lo que permite la identificación de un objetivo por vía de un tóxico como aguas arriba o aguas abajo de señalización de calcio ^20.

La desgranulación se puede medir con rapidez y eficacia mediante el control de la liberación de β-hexosaminidasa en sobrenadante de células, que se libera linealmente a partir de los gránulos junto con histamina ^6, pero is mucho más fácil de detectar utilizando una reacción enzima-sustrato simple y un lector de microplacas a ensayo el producto fluorescente. Esta microplaca de ensayo, como se detalla en la sección de protocolo, se basa en un método robusto desarrollado originalmente por Naal et al. ^1, que cuantifica la escisión del sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-N-acetil-β-D-glucosaminida por β- hexosaminidasa. Hemos modificado el ensayo a efectos de prueba de los fármacos y sustancias tóxicas, con triclosán resaltado aquí. Este método cuantifica con fiabilidad la desgranulación, es una alternativa económica a, por ejemplo, métodos de detección de citometría de flujo basados ​​en ^21, y tiene el potencial de que se presta muy bien a la selección de alto rendimiento de una amplia variedad de fármacos contra la alergia, así como inmunotóxicos o sustancias químicas alergénicas. Este último punto es particularmente importante a la luz de las "Pruebas de Toxicidad 2007 informe del Consejo Nacional de Investigación en el siglo ^21: una visión y una Stratgia "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), que aboga por el desarrollo de las pruebas de toxicología de alto rendimiento que utilizan cultivo de células para reducir el costoso uso de animales de laboratorio tradicionales tales como ratones. El protocolo desarrollado por la desgranulación de Naal et al. ¹ y modificado por nosotros ^2, utiliza la línea de células RBL-2H3, que es un modelo bien aceptado homóloga a mastocitos de la mucosa humanos o basófilos ^3-5. (Los métodos para el cultivo de células RBL-2H3 se detallan en Hutchinson et al. ^22). Este ensayo probablemente podría ser adaptado a cualquier tipo de célula mástil adjunto.

Triclosan (TCS) es un antimicrobiano de amplio espectro que se ha utilizado durante más de 30 años en los hospitales, productos de cuidado personal, y bienes de consumo ^23,24. El modo de acción antimicrobiana de la característica de TCS es la inhibición de la biosíntesis de ácidos grasos, probablemente mediante la inhibición de enoil-aciloproteína portadora reductasa ^25,26. Se encuentra en todo el mundo en una amplia gama de productos de consumo, tales como gel de ducha, loción para las manos, pasta de dientes, enjuague bucal, y en jabones de tocador en concentraciones de hasta el 0,3% o 10 mM ^24. El uso generalizado de TCS se ha traducido en niveles detectables en los seres humanos ^{27 a 29} y en los ríos y arroyos ^30. Un estudio realizado por Allmyr et al. ²⁷ demostró que los ECT y sus metabolitos están presentes tanto en el plasma y la leche de las madres lactantes. Es importante destacar que, TCS se absorbe fácilmente en la piel ^31-37. Queckenberg et al. Encontraron ³⁷ ~ 10% de absorción de un ~ 70 mM de TCS crema en la piel humana dentro de 12 horas, lo que resulta en una concentración significativa en la piel, donde residen las células cebadas.

TCS ha demostrado clínicamente para controlar la enfermedad alérgica en la piel humana ^7-11, pero el mecanismo por el cual TCS alivia las enfermedades alérgicas de la piel ha sido desconocido ^38. Uso de la microplaca de ensayo fluorescente detailed en este video, recientemente hemos demostrado que TCS, a concentraciones tan bajas como 2 M, amortigua significativamente la función de los mastocitos y degranulación, proporcionando una posible explicación de estos datos clínicos ^2. Además de proporcionar una explicación de estos datos clínicos, nuestros hallazgos en Palmer et al. ² sugieren que los ECT se dirige a moléculas de señalización aguas abajo de la entrada de calcio. Debido a la importancia de la señalización de calcio en muchos inmunológica y otros procesos biológicos, TCS potencialmente podría tener efectos adversos en una amplia variedad de procesos biológicos necesarios. De hecho, Udoji et al. ³⁹ demostraron que TCS suprime la actividad lítica de las células asesinas naturales humanos, otra importante función inmune innata.

Más allá de su potencial como una ayuda terapéutica en la enfermedad alérgica de la piel (o, a la inversa, como un inmunotóxico), TCS también puede ser un disruptor endocrino ^40-49. Así, un procedimiento claro sobre cómo preparar esta sustancia química en solución is de interés para los toxicólogos. Debido a TCS es una pequeña molécula hidrófoba, los vehículos orgánicos se utilizan a menudo para que sea más soluble en agua. En la mayoría de los estudios de toxicidad donde TCS ha sido probado, la preparación ha implicado la disolución en agua con la ayuda de un disolvente orgánico tal como etanol, acetona, o aceite ^2,50,51. Sin embargo, muchas veces estos disolventes son biológicamente activos a sí mismos, lo que complica la interpretación de los datos de la sustancia problema ^51. De hecho, de acuerdo con Rufli et al. ⁵² y otros ^53, se recomienda que las soluciones de prueba para los experimentos de toxicidad acuática se preparan utilizando métodos físicos sobre los métodos químicos, debido a la posibilidad de disolventes químicos para crear artefactos de toxicidad. Hemos demostrado anteriormente que los ECT disolvió en 0,24% de etanol / agua (vol / vol) y se sometió a ultrasonidos durante 30 min amortigua RBL degranulación de los mastocitos ^2. El etanol a concentraciones más altas que 0,24% se ha demostrado para amortiguar la degradación de los mastocitoscanulación ^{54,55-ejemplos} de los efectos de confusión potenciales de disolventes orgánicos en los estudios de toxicidad.

No sólo es importante tener en cuenta el efecto de los disolventes sobre el organismo o las células utilizadas para el estudio, pero también es importante para controlar el efecto de un disolvente sobre la propia sustancia de ensayo. Por ejemplo, Skaare et al. ⁵¹ encontraron que la disolución de TCS en polietileno glicol (comúnmente encontrado en los dentífricos y enjuagues bucales) debilitada efectos anti-bacterianos y anti-placa en las mujeres sanas, mientras que la disolución en aceites causó una pérdida completa de la función. Por lo tanto, la capacidad de los diferentes disolventes para modular tóxico y drogas, incluyendo TCS, efectos deben ser considerados en el diseño de ensayo. Uso de aceites o aditivos de sabor puede interferir con los efectos de TCS en diversos productos ^50,51.

En un esfuerzo por eliminar la necesidad de utilizar disolventes orgánicos, hemos mejorado sobre nuestro método para disolver TCS ² mediante la eliminación de la utilización de un sol orgánicodesahogarse. En el presente protocolo, disolvemos gránulos TCS directamente en tampón acuoso con el calor (≤ 50 ° C), a continuación, compruebe que la concentración de esta población TCS por espectrofotometría UV-Vis. Estas mejoras son posibles porque TCS es soluble en agua hasta 40 mM ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) y se ha demostrado para resistir la degradación cuando se calienta a 50 ° C ( http:// / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) ^56,57. También tenemos el beneficio añadido de espectrofotometría UV-Vis, como TCS también se conoce para absorber fuertemente a 280 nm ⁵⁸ con un coeficiente de extinción molar de 4200 L / mol / cm ^12.

Este protocolo proporciona una manera sencilla, pero eficaz para disolver gránulos de TCS en un tampón sin la ayuda de un disolvente orgánico, incluyendo bajo costo y verificación rápidade la concentración, y describe un potente microplaca de ensayo fluorescente para el seguimiento de los efectos químicos sobre la desgranulación de los mastocitos.

Protocol

Tenga en cuenta que todas las recetas de amortiguamiento se incluyen en una tabla al final del texto del protocolo. DÍA 1: 1. Preparación de las células Planificar de 96 pocillos esquema de configuración de la placa, centrado muestras de ensayo en el diseño con el fin de evitar los efectos de borde. Asignar tres réplicas para cada concentración probada TCS (± desgranulación estimulante de antígeno o ionóforo), así como por tripl…

Representative Results

Cuando se calienta a 50 ° C durante 90 min, el espectro de absorbancia de UV-Vis para TCS produce una fuerte curva, suave entre ~ 260 y 300 nm, con un pico a 280 nm, como se muestra en la Figura 1. Espectrofotometría UV-Vis es, por lo tanto, una herramienta importante que puede ser utilizado para calcular la concentración, ya que el coeficiente de absorción molar publicado a 280 nm es 4200 L / mol / cm 12. Hemos encontrado que los ECT no se caiga fuera de la solución durante el marco de tiempo de todo el exp…

Discussion

En 2004, Naal et. Al ¹ desarrolló un biosensor de los mastocitos para pruebas de alto rendimiento de la degranulación. Se trata de un ensayo robusto que hemos adaptado para nuestros estudios de TCS y detallados en este video. Antes de la Naal et al. ¹ ensayo, la desgranulación de mastocitos se ha evaluado de forma rutinaria a través de β-hexosaminidasa ^59-61, pero estos primeros métodos utilizados fluorómetros en el que una muestra se leyó a la vez. Es importante destacar que, Naal …

Materials

RBL-2H3 Cells	ATCC	CRL-2256	The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC
Triclosan/Irgasan	Sigma	72779 CAS# 3380-34-5	Should be stored in a low humidity environment
Trypsin	Gibco	25300-054 CAS# 3380-34-5
EMEM	Lonza	12-611F
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Gentamycin Sulfate	Lonza Biological Sciences	17-518
Albumin, Bovine Serum	Calbiochem	12659 CAS# 9048-46-8
Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)	Pierce	28314 CAS# 9002-93-1
HEPES	J.T Baker	4153-01 CAS# 75277-39-3
Magnesium Chloride	VWR	BDH0244-500G CAS# 7791-18-6
D-(+)-Glucose	Biomedicals	152527 CAS# 50-99-7
Potassium Chloride Crystal	J.T Baker	3046-01 CAS# 7447-40-7
Calcium chloride dihyrdate	Acros Organics	207780010 CAS# 10035-04-8
Glycine	Sigma	G8898 CAS# 56-40-6
4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)	EMD Biosciences	474502-250MG CAS # 37067-30-4	Wrap in foil – is light-sensitive
Anti-DNP Mouse IgE	Sigma	D8406	Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.
DNP-BSA	Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University		Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018
Calcium Ionophore A23187	Sigma	C75-22-1mg	Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully
DMSO	Sigma	D2650 CAS# 67-68-5
Acetic Acid	VWR	BDH3094-2 CAS# 64-19-7
Anhydrous Sodium Carbonate	Sigma	222321 CAS# 497-19-8
Sodium Chloride	Sigma	71376 CAS# 7647-14-5
Hydrochloric Acid	VWR	BDH3026 CAS# 7647-01-0
Reference Buffer, pH 7	VWR	BDH5046
Reference Buffer, pH 10	VWR	BDH5072
Reference Buffer, pH 4	VWR	BDH5018
pH electrode storage solution	VWR	14002-828
			Equipment:
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
DU 7500 Spectrophotometer	Beckmann	No longer sold
Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software	BioTek	Module S
Hematocytometer	Hausser Scientific	3110
7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate	VWR	97042-634
Centrifuge	Eppendorf	5430
Tissue culture water bath	VWR	Model# 89032-206
Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood)	The Baker Company	Model# SG403A-HE
Tissue culture incubator	ThermoScientific	Model# 3598
Pipetman	VWR		Range: P2-P1000
Balance	Mettler Toledo	Model# AG204
pH meter	Symphony/VWR	Model# SB70P
Pipet-Aid	Drummond Scientific	4-000-100
Combitip dispenser	Eppendorf	4981 000.019
			Recipes:
Name	Recipe	Notes
Acetate Buffer, pH 4.4	Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml	Sterile Filter into autoclaved glass bottle
Substrate (4-MU)	Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again	For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer
Glycine Carbonate Buffer, pH 10	26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10	Sterile filter into autoclaved glass bottle
Tyrodes (2 L), pH 7.4	135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4	Sterile filter into autoclaved glass bottle
RBL Cell Media	Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.	Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle
			Plastic material used:
Material Name	Company	Catalogue Number	Type of Plastic
200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack	VWR	53509-009	polypropylene
1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery	VWR	89003-420	polyethylene
10 µl micro tip low binding sterile	VWR	14217-704	polypropylene
Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force	VWR	20170-038	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-178	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-103	polypropylene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	690175	polystyrene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	658175	polystyrene
CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	607180	polystyrene
CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	710180	polystyrene
CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	606180	polystyrene
CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	760180	polystyrene
1 cm cuvettes	N/A	N/A	polystyrene
CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate	Greiner Bio One	655086	polystyrene
Combitips	Eppendorf	022266501	Polypropylene/ polyethylene