Summary
ここで任意のタンパク質をそれのドミナント ネガティブ変異体バージョンを元に戻せる状態 ⓫ 条件付きで不活性化することができます、ドミナント ネガティブ誘導システムを開発するためのプロトコルを提案する.
Abstract
ドミナント ネガティブ (DN) タンパク質阻害タンパク質の機能を操作するための強力な方法は、他のゲノム情報に基づくアプローチに比べていくつかの利点を提供しています。たとえば、キメラがCre LoxPターゲット戦略が広く使用されている、(すなわち、漏れのプロモーター活性、モザイクCre式等)、これらの戦略の本質的な制限は制限が大幅にアプリケーション。また、多くの内在性遺伝子の完全な削除、強肩致命的、生後の遺伝子機能を研究することは不可能です。これらの課題に対処するため我々 は初期遺伝子工学プロトコルを大幅に変更し、ライソゾーム プロテアーゼの Rb1 遺伝子の短い (遺伝子組換え) バージョンの併用 procathepsin B (CB)、Rb1 の DN マウス モデルを生成する (CBRb)。ライソゾーム プロテアーゼの存在のために全体の CB RB1 融合タンパク質およびその相互作用の複合体はプロテアソームを介した分解にルーティングされます。また、遺伝子導入構成体のテトラサイクリン誘導 (情報を頼むこと) 要素の存在により RB1 蛋白質の誘導性かつ可逆的な規制です。CBRb マウス モデルにおけるユビキタス ローザ CAG プロモーターの存在はそれに一時的の Rb1 遺伝子アブレーションを実施し、研究者に事実上任意のセル型での活動を理解するためのリソースを提供する便利なツール、RB1 が表されます。
Introduction
遺伝子および蛋白質の試練を目指すほとんどのアプローチは、一般的に完全な除去や遺伝子、rna、または興味 (POI) の蛋白質の切り捨てにつながる永続的なプロセスに依存します。このメソッドの全体的な目標は、内因性、野生型タンパク質の機能を廃止する組換え蛋白質をエンジニア リングすることです。再訪し、DN の抑制を介してポイの一時的なアブレーションは、代替戦略1,2を刷新しました。このメソッドは、ポリコームタンパクと単量体ペプチドの両方のために働くが、ポリコームタンパク アセンブリ内で機能する蛋白質に最適です。
メソッドは、溶断ポリコームタンパク ポイ (CB 融合タンパク複合体) のサブユニットにライソゾーム プロテアーゼ CB で構成されます。複雑な結果の CB の融合との対話し生内因性のタンパク質を消化したり劣化3リソソームに全体の CB-POI の複合体をそらします。また、テトラサイクリン制御転写活性化 (重音テト) 系の誘導の自然と、CB 融合タンパク複合体の組み合わせは、リバーシブル ファッション2遺伝子の誘導と制御式にできます。多くの状況で有用遺伝子または蛋白質の生体内での完全な削除は致死率4,5,6で起因できます。同様に、それは最終的には、重要なゲノムの要素7の永久的な損失につながるのいくつかの遺伝子または蛋白質 Cre/Lox システムを使用して組織に固有の条件付きの削除は簡単にできません。したがって、遺伝子や POI によってこれらのアプローチのどちらも有効であるその後の研究のための有用なモデルを提供する特に遺伝子または蛋白質の後半の産後と大人のマウスの機能の研究。
提案手法の有効性に関する証拠の原則そのようなアプローチに関連する問題を回避し、提供、我々 は網膜芽細胞腫 1 (RB1) 蛋白質の条件付き DN バージョンを生成することによって、ここで紹介する方法をテストする分野します。いくつかのオプションは、内因性 RB1 の機能を廃止する提案8,9,10をされています。しかし、それらのすべての上記で説明した同じ制限に直面: RB1 の永久的な生殖削除は強肩致死、その腫瘍サプレッサーの役割と永続的な一貫性のある RB1 条件付き削除へとつながって様々 な腫瘍11。にもかかわらず、RB1 の DN バージョンは、自然に発生するとは思えない、現在利用可能な戦略をより良い代替手段が内因性の RB1 の一時的に制御された不活性化を可能にする、最終的に復元する別のメカニズムを提供する、関数。そのような構築のための基礎は前に二十年以上に述べた1。ただし、技術的な制限のためには組織特異性、応答制御遺伝子の活性化機構を欠けていた。本研究ではドキシサイクリン (Dox) の優雅を結合する最初のライソゾーム プロテアーゼ CB とRb1蛋白質の組み換え遺伝子組換えコンストラクト依存転写システム。結果の CBRb マウス モデルは、一時的に規制 Dox を介した RB1 規制2。プロテオーム ベースのアプローチを使用して遺伝子の働きを研究するの利点は、それがその活動を最小限の情報で関心の任意の遺伝子が採用されることがあります。
DN 遺伝子手法では、従来の方法に比べて多くの利点を提供しています。まず、DN タンパク質阻害は蛋白質の活動、したがって残留内因性表現を維持にのみ部分的なアブレーションに します。そのような結果は蛋白質の活動の完全な除去が胚性致死率は、大きく生きているマウスの遺伝子の機能を研究する任意の調査を制限することにつながるような状況で非常に望ましい。第二に、重音テト システムの存在は、遺伝子活動の効率的かつ可逆的な制御が可能の抗生物質の存在下でのみ遺伝子活性化できます。したがって、抗菌薬の投与を中止、形質転換システムは非アクティブにできますと通常の RB1 式は元の場所に。第三に、導入遺伝子発現の特異性は、任意のプロモーターによって異なります。原理実証のためのユビキタス ローザ CAG プロモーターをいただいて、組織固有のプロモーター遺伝子を配置することは不要な遺伝子発現を制限し、この遺伝子治療への応用に関する研究を促進する可能性が高い方法論。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
トランスジェニック マウスの CBRb の動物の世話と研究に関連する実験のすべての世代はクレイトン大学施設動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) により承認され、彼らのガイドラインによって実行されます。
1. 遺伝子組換え CB Myc6-Rb1 コンストラクト
注:CBRb の pTet_Splice のベクトルへのクローニングは、複数の手順 (図 1 aと1 b) で行われました。
-
最初のステージ pCS2 + CB Myc6 ベクトルにクローン作成を実行します。
- CBRb 遺伝子コンストラクトを作成、次のプライマーを用いた RB1 蛋白質の 1583 bp 長Rb1 cDNA 断片 (528 のアミノ酸アミノ酸領域 369-896 に対応する) を増幅する設定: EcoRI +RB 1243F、GGGGAATTCAを使用TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTCと XbaI + EcoRV +RB 2826R、CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCCを使用します。
- クローン フラグメントには、pCS2 + 前述1,12CB Myc6 ベクトルのEcoR1とXbaI制限のサイト間 (1546 bp) が生成されます。
注: 1012 bp 長 CB Myc6 構築 (337 アミノ酸) Rb1フラグメントに融合結果内因性 RB1 蛋白質 (~ 110 kDa) よりわずかに小さいである約 865 アミノ酸 (約 108 kDa) のタンパク質 (図 1 )、N 末端と C 末端のRb1の CB Myc6タグに。
-
PTet スプライス ベクトルに 2 番目のステージの subcloning を実行します。
- CB RB Myc6 融合フラグメントを増幅してテト プロモーターを得るために、増幅EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) とサリサイトを含むプライマーを用いてCB myc6 Rb1から成るカセット: サリ +CBf、CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTCを使用します。
- PTet スプライス ベクトル、サリとEcoRV制限サイトのように間に生成されたフラグメント (2567 bp) を subclone SV40 イントロン、ポリアなど全体の重音テト DN CB myc6 Rb1遺伝子の信号方法ノッティ(図 1B) と 1 つの消化を分離することができます。
注: 東北大学からのフラグメントは、トランスジェニックの資金提供者の生成に使用されました。
2重音テト DN CB myc6 Rb1遺伝子の体外試験で
-
Dox-規則: NIH3T3 細胞株
注:明記されていない限り、6 ウェル プレートのすべてのボリュームを調整されています。- NIH3T3 細胞 10% CO2と 37 ° C で 10% 牛胎児血清を含む推奨される細胞培養媒体を使用して、ベンダーの仕様を成長します。
- PTet 継手とセルを cotransfect し、24 時間の (手順 1) から pCMV Tet3G ベクトル失うか、下記手順に従ってください。
- 脂質ベースのトランスフェクション試薬/井戸の 2-4 μ L と 1 mL の (血清) せずに不完全なダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 室温で 5 分間混ぜます。12 または 24 ウェル プレートそれぞれ、文化、メディアの 250 または 500 μ L を使用し、トランスフェクション試薬の音量を調節します。
- トランスフェクション試薬 DMEM にプラスミド DNA/ウェルの 2-3 μ g を追加し、室温で 20 分間インキュベートします。
- DNA と各ウェルに DMEM でトランスフェクション試薬を含むミックスを追加します。インキュベーションの 3-4 時間後 (つまり、最終巻は 2 mL/も) 完全なメディアの 1 つの mL を追加します。Dox 株式 (1 mg/mL) の因数を維持し、井戸 (+ Dox) の各 2 μ L を追加します。5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。
注:コントロールのサンプルは Dox と扱われない cotransfected 細胞に成るべきである (-Dox)、NIH3T3 細胞転写活性化 pCMV Tet3G ベクトルのみをトランスフェクトした、24 時間の治療を Dox と同様。PCMV-Tet3G、濃度の 0.1-1 μ G/ml Dox は、導入遺伝子の発現を誘導するために十分なはずです。
-
HEK293 細胞ラインを使用して、構成の可逆性をテストします。
- 重音テト DN CB myc6 Rb1遺伝子の可逆性、HEK293 細胞でワシの最低不可欠な媒体 (実装された EMEM) 次のベンダーの仕様をテストし、前述の 24 h の pTet 継手と pCMV Tet3G の両方のベクトルと cotransfect上記の (ステップ 2.1.2)。
- 遺伝子不活化の 24 h 後 Dox を含むメディアを削除し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でセル 2 x-3 x を洗浄し、さらに 24 時間 Dox 自由な媒体のそれらを孵化させなさい。
注:Dox 取り外した遺伝子不活性化および通常蛋白質の表現は、24 h 以内に再開されるべき。
-
スケジュールされていない細胞増殖を促進する上での重音テト DN CB myc6 Rb1コンストラクトの機能を評価するために下記のとおり、丙 OC1 のセルラインを使用して解析を実行します。
- 文化丙 OC1 細胞 10% の下で寛容な DMEM 条件 (10% CO2の 33 ° C)。細胞増殖研究 200 μ L のボリュームの 96 ウェル プレートでセル カウンターとプレート 10,000 丙 OC1 細胞を使用して細胞を数えます。セルを一晩インキュベートします。
- 次の日に脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いた pTet スプライス pCMV Tet3G ベクターの過渡失うかを実行 (手順 2.1.2 参照)。個別の井戸で pmR ZsGreen1 トランスフェクション at2 μ トランスフェクション率を計算する (ステップ 2.1.2) 脂質ベースのトランスフェクション試薬を使用してを実行します。コントロールとして非 transfected セルを使用します。
- 蛍光顕微鏡下で緑色蛍光を検出 (励起 = 485 nm、発光 = 530 nm) の transfected セル トランスフェクション後の 24 h。緑の蛍光性の有無を記録し、DAPI (総細胞) の付いたセルに GFP 陽性細胞 (transfected セル) の総数としてトランスフェクションのレートを計算します。
注:〜 70% の導入率を推定しました。 - 遺伝子発現を誘導して、1 μ g/mL Dox を transfected セルのサブセットに制御として他のサブセットを使用しながら追加 (-Dox)。追加のコントロールとして未処理丙 OC1 セルを使用します。
- 細胞増殖を評価するために、製造元のプロトコルに従って細胞増殖キットを使用します。
- 簡単に言えば、トランスフェクション後、48 h は細胞培養液を取り外して、マイクロ プレートの各ウェルに 100 μ L の色素結合ソリューション x 1 を追加します。37 ° C で 1 時間インキュベートします。
- その後、蛍光マイクロ プレート リーダーを使用して各サンプルの蛍光強度を測定 (励起 = 485 nm、発光 = 530 nm)。
- さらに免疫細胞化学を使用して細胞増殖を評価、12 ウェル プレートでカバーガラスの丙 OC1 細胞をプレート、37 ° C で一晩インキュベートするには
- 次の日、pTet 継手と pCMV Tet3G cotransfect し、Dox 治療 (+ Dox) を実行します。融合細胞をコントロールとして使用します。プロセス丙 OC1 ki-67 標識細胞。
- PBS、pH 7.4 では、室温で 10 分間で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で細胞を固定します。洗浄セル 3 x 氷冷 PBS で 10 分 PBS で 0.25% 非イオン性洗剤で細胞をインキュベートし、。
- セルを洗浄して 5 分、室温で 1 時間加湿チャンバーで 10% 血清を使用してブロックの PBS で再度、3 x。
- 室温で 3 h の Ki 67 一次抗体 (希釈 1: 200) を 500 μ l 添加のセルを孵化させなさいまたは 4 ° C で一晩
- 3 セルを洗浄する PBS と 5 分のための倍。その後、暗闇の中で部屋の温度で 1 時間の二次抗体と細胞をインキュベートします。
- 二次抗体溶液を取り外して洗浄セル 3 x PBS と暗闇の中で 5 分間。
- ファロイジン ラベルは、30 分の 1: 200 ファロイジンの丙 OC1 セルをインキュベートします。細胞の核にラベルを付ける、室温で 10 分間の 5 μ g/mL DAPI でセルをインキュベートします。
注:ファロイジン色素共役が二次抗体の共役と異なることを確認します。
3 世代 CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) のトランスジェニック マウスおよび DN CBRb アプローチの生体内テストで
- 重音テト DN CB myc6 Rb1遺伝子の効果的な Dox 規制の確認後は、東北大学からのフラグメントを浄化し、擬似妊娠した女性に後で転送されるマウス受精卵にそれらを microinject します。
注:これらの手順は、ネブラスカ大学医療センター (UNMC) マウスのゲノム工学中核施設で行われました。 - 産後、遺伝子のプライマーを使用して子犬CB Rb1融合領域に固有の設定: CBRb F、5' 3 CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG ', を使用し、CBRB R、5 'GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3' を使用します。
注:Agarose のゲルで観察された PCR の製品サイズは 401 bp (60 bp CB 地域 + 341 bp Rb1地域 (表 1)。重音テト DN CB myc6 Rb1遺伝子の存在に基づいて 10 の独立した創業者行が識別されました。これらの行の 5 つ、子孫継承遺伝子、遺伝子の生殖細胞系の伝送を確認しました。トランスジェニックのラインの 1 つは最終的に確立、ラインを維持して、さらなる研究のための実験の重音テト DN CB myc6 Rb1動物を生成する使用されました。 - 実験の DN CBRb マウスを生成するローザ CAG 情報を頼むことテトラサイクリン誘導ライン (株式 #006965) (また、tTA インデューサ ラインに品種) に重音テト DN CB myc6 Rb1成体を飼育します。この次のプライマー セットを使用して十字の子孫の遺伝子型: 情報を頼むこと WT R 用 GGAGCGGGAGAAATGGATATG;情報を頼むこと突然変異体 R、GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; を使用します。情報を頼むこと共通、AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT を使用します。PCR の製品のサイズが 340 bp (変異) 340 bp と 650 bp (ヘテロ) と 650 bp (野生型)。
- 次の時間と、遺伝子発現を引き出すために必要な Dox 治療の長さを決定する Dox 治療 RB1 蛋白質の用量-反応曲線を生成します。
注:この実験では、西部のしみ、qRT PCR は組織特異遺伝子の活性化と RB1 の式を評価するために使用されました。 - 蛍光現場の交配 (魚) 遺伝子のゲノムの挿入を確認するを実行します。
注:これ実施したセンターで病院の応用ゲノム病児 (トロント、カナダ)。遺伝子の活性化、組織特異性および内因性の POI のレベルの変化を評価するためには、ELISA やウェスタンブロッティング (蛋白質特定の抗体を使用して) を使用できます。DN-CB-myc6-Rb1コンストラクト アンチ RB1 抗体を使用しました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
一般的には、DN の突然変異を設計するには、大量の構造に関する情報と POI の機能が必要です。対照的に、POI の構造と機能情報が限られた場合、ここに示す DN 戦略は特に役立ちます。ライソゾーム プロテアーゼに 1 つのサブユニットの融合支配的組み立て多量体と、潜在的に、内因性サブユニットのタンパク質分解との細胞の転換の組み合わせにより他の配位子を抑制できるポリコームタンパク タンパク質が場合、リソソームに多量体。安定、情報を頼むことを示したマウス NIH3T3 細胞にトランスフェクションはコンストラクトのクローニングに成功を確認し、Dox 規制遺伝子活性化、重音テト DN CB myc6 Rb1を含んでいる精製 pTet スプライス プラスミッドの有効性をテストするには蛋白質、しかしない Rb113。Dox のない場合は、情報を頼むことを表現するセルは表示されません RB1 式堅牢な RB1 式は Dox (図 2A) の存在下で観察されたに対し。システムの可逆性をテストするには、次に、精製 pTet スプライスと (内生表現Rb114) HEK293 細胞を cotransfected 我々/重音テト DN CB myc6 Rb1と pCMV Tet3G ベクトル。予想通り、RB1 の内因性のタンパク質の発現により抑制された遺伝子活性化の細胞培養媒体 (図 2B) に Dox の追加。HEK293 細胞のサブセットの 24 時間の期間の後、システムの可逆性をテストするのには我々 は新鮮な Dox 無料メディアに Dox を含む細胞の培養基を置き換えられ、Dox 規制可逆性を RB1 のサポート追加 24 h の細胞を培養式は、文化メディア (図 2B) から Dox 除去時に復元されました。Dox と扱われなかった HEK293 細胞をトランスフェクションまたは Dox 扱わ HEK293 細胞をトランスフェクトした pCMV Tet3G ベクトルのみ (図 2B) 内因性 RB1 表現の基底レベルを示した。NIH3T3 細胞は当然のことながら RB1 蛋白質を表現しないので RB1 の肯定的な反応性は遺伝子 RB1 蛋白質の蓄積によるものです。PTet 継手の全 DNA 量を測定した聴覚系の重音テト DN CB myc6 Rb1構築の潜在的な増殖効果に関心を与え、細胞 (重音テト DN CB myc6 Rb1- と pCMV Tet3G トランスフェクション丙 OC1/コルティ由来細胞の内耳器官) の存在と Dox の不在で。ここで示した作業仮説と一致して、Dox 処理 (セル数の増加に対応する) DNA 量の大幅な増加が観察されたが、ない (無処理) transfected 丙 OC1 細胞 (図 3 a - 3 C).
次の遺伝子の活動と機能の in vitro における確認、トランスジェニック マウス モデルが生成されました。魚、重音テト DN CB myc6 Rb1ジゴキシゲニン (DIG) を使用して-ペルオキシダーゼ (HRP)/チラミン-ビオチン ・ アビジン-Cy5-ラベル プローブ、雄マウスの脾細胞と耳の線維芽細胞の G バンディングの遺伝子の挿入を確認するため行った、トランスジェニック マウスのゲノム。5 生殖の送信、創設者の間で一貫性のある遺伝子を示した 14 行目のカーソル位置セグメント 10 C 3 ~ D2 (図 4 a - 4 C)。この線からマウス繁殖コロニーを確立し、さらなる研究のために実験動物を生成する使用されました。Dox 誘導と重音テト DN CB myc6 Rb1遺伝子の活性化に最適な時間を決定する前記 Dox は、時間の長さが可変の水を飲むで投与された 3 つの異なるグループにトランスジェニック マウスを分ける:グループ 1(治療の 3 日間)、グループ 2 (治療の 7 日) とグループ 3 (治療の 10 日)。治療が完了したら、RB1 蛋白質発現の変化は西部しみが付く (図 5 a - 5d) によって評価しました。DN とネイティブの RB1 蛋白質同じような分子量があるため西部のしみに互いから解決できません。ただし、初期の増加と一貫性のある RB1 蛋白質 (のために DN RB1 と内因性のタンパク質の蓄積)、コントロール群 (図 5のトランスジェニック マウス蝸牛総 RB1 蛋白質の表現の初期の増加があったA). また、重音テト DN CB myc6 Rb1遺伝子プロダクトの抑制とタンパク質分解の活動と一致して、RB1 式で定量化可能な削減で観察されたグループ 2 と 3 の 1 および制御グループ (と比較して図 5 a - 5d)。注記のうち、10 日以上の治療は、RB1 蛋白質の表現のさらなる変更でされませんでした。したがって、Dox 治療の 10 日は、最適とさらなる研究のために使用されると考えられました。
任意の組織または RB1is が内生的表されるセルの RB1 は潜在的抑制されること情報を頼むことと、その結果、重音テト DN CB myc6 Rb1遺伝子活性化ユビキタスローザ CAGプロモーターなので (例えば、肺、心臓、網膜)。この前提をテストおよび遺伝子の組織特異性を評価、蝸牛、肺、心臓、左右目の生検からTetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA、解剖され、コントロール マウス (ローザ CAG 情報を頼むこと遺伝子を持っていない)RB1 式 (図 6A - 6 C) の評価。分析して、組織に関係なく RB1 蛋白質の大幅な削減は制御グループ (図 6A) ではなくTetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTAで観察されました。対照的に、qRT PCR 解析、目、心臓、Dox 治療TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTAと元が組織における DN CBRb トラン スクリプトの重要なアップレギュレーション, 年齢をマッチさせた対照マウス蝸牛、後者のマウス (図 6C)。完全に、これらの結果は構成要素の効率を確認します。転写産物発現の増加には、効果的な Dox 規制遺伝子誘導が反映されます。同様に、タンパク質発現の減少、内因性の RB1 のルーティングと蛋白質分解低下と一致。
図 1:多段階誘導の発生と CBRb のクローニング TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA.(A) pCS2 CB Myc6ベクトルにRb1断片のクローニング、このパネルが表示されます。1583 bp Rb1遺伝子産物は、 EcoRI + RB1243前方とXba + EcoRV + RB2826逆プライマーを使用して増幅される PCR をだった。結果のRb1フラグメントは、 Rb1 + CB myc6 pCS2ベクターを生成するCB Myc6コンストラクトを含む pCS2 ベクトルのEcoRIとXbal制限のサイト間複製されました。(B) CB myc6 + Rb1フラグメントは、サリとEcoRV制限サイト間pTetSpliceベクトルに複製されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:Dox 規制遺伝子活性化の有効性。(A) NIH3T3 細胞は通常 RB113を表現しないでください。重音テト DN CB myc6 Rb1構築の効率的な活性化を確認し、反 RB1 抗体を用いたウエスタンブロット法は Dox (レーン 1 と 3) の存在下ではなく不在 (レーン 2、4)、堅牢な RB1 式を明らかにしました。(B) Rb114を内生的表現、HEK293 細胞で重音テト DN CB myc6 Rb1と pCMV Tet3G トランス ベクトル cotransfected いた。Dox (1 レーン) がない場合は、RB1 の正が観察されました。Dox のシステムへの追加は、重音テト DN CB myc6 Rb1活性化と RB1 ダウンレギュレーション (2 車線) を引き起こした。Dox (3 車線) のメディアから削除された後、RB1 式は 24 h を再開されました。C = コントロール、融合 HEK293 細胞 Dox と扱われない。これはもともと細胞神経科学の最前線2誌に掲載の図から適応です。その複製は、フロンティア'著者のポリシー' 著作権保持に同意します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: Dox を介した DN CBRb 遺伝子の活性化が細胞増殖を増加します。(A) 丙 OC1 細胞精製重音テト DN CB myc6 Rb1と cotransfected し、pCMV Tet3G ベクトルが (−) の不在あるいは Dox の (+) 存在下で培養しました。細胞の増殖は、拡散の試金を使用してトランスフェクション後 48 時間を決定しました。増殖の変化率は、コントロールとして融合細胞の蛍光値を変更を使用して計算しました。細胞数のささやかな、重要な増加は、Dox の処置に続く transfected セルで観察されました。対照的に、大幅な変更は認められなかった丙 OC1 transfected セル間 (−) と処理されていない Dox と融合の制御。(B) または (C) cotransfected 精製重音テト-DN-CB-myc6-Rb1 と Dox の (+) 存在下で培養 pCMV Tet3G ベクトル Ki 67 (赤)、ファロイジン (緑)、DAPI (青) とラベル付けされた丙 OC1 細胞融合。P < 0.05。スケール バー = 10 μ m。これはもともと細胞神経科学の最前線2誌に掲載の図から適応です。その複製は、フロンティア'著者のポリシー' 著作権保持に同意します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:重音テト DN CB myc6 Rb1遺伝子のゲノムの挿入の交配 (魚) 確認蛍光の in situ 。PCS2 CBRb (ジゴキシゲニン プローブ/反-DIG-HRP/パスチラミドシグナル-ビオチン ・ アビジン-cy5 の組合せ、赤で) テスト プローブはプローブ信号を検出することができるかどうかを参照してくださいに脾細胞と耳の線維芽細胞細胞染色または 2.5 kb の 1 つコピー先挿入サイズではなく交配されました。PCS2 CBRb テスト プローブ 1 つ染色体 10 セグメント 10 C の 3 D2 内で重音テト DN CB myc6 Rb1遺伝子の挿入を示す明るい、ダブレット プローブ信号にハイブリダイズします。RP23-267 24 (スペクトルの緑) コントロール プローブ ハイブリダイズ染色体に 10 バンド 10A1 予想と確認で関心の CBRb DNA が染色体 10 に挿入されています。(A) このパネル ショー G バンド中期。(B) このパネルはパネルAのように、同じ中期からパスチラミドシグナル信号の増幅 (TSA) 魚のイメージを示しています。(C) このパネル 10 (1) G バンディング、TSA (2) 魚を示す染色体の合成画像を示し (3) TSA 魚の反転 DAPI バンディングします。赤 = pCS2 CBRb プローブ;青 = DAPI はバンディング;緑 = RP23-267 24 コントロール プローブ。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: DN CBRb 生後 (P) 36 の内耳の遺伝子活性化TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb+) とローザ CAG 情報を頼むこと+ (CBRb−) 3 (グループ 1) 後のマウス 7 (グループ 2) と 10 (グループ 3) Dox の日治療します。(A~C)アンチ-RB1、よくとして反-c-myc 抗体検出のため使用されたように rb1、過リン酸化と hypophosphorylated の両方のフォームと反応します。薄層クロマトグラフィー分析を行った ImageJ ソフトウェアを使用しています。ネガティブ コントロール CBRb に対応する値が正規化された− (-) そして β-アクチンへ。相対の RB1 の表現のレベルは、各しみの下に表示されます。(D)正規化された RB1 発現レベルのグラフィック表現CBRb+ (+) でさまざまな治療法の一貫して低い RB1 のハイライト検出に対するサンプルのプロット。西部のしみのゲルの各レーンとグラフィックの各列は、異なる個々 に対応します。P < 0.05.This 図もともと細胞神経科学の最前線2誌に掲載されました。その複製は、フロンティア'著者のポリシー' 著作権保持に同意します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: P18 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (+) DN CBRb+のTetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTAの遺伝子の活性化の空間分析/ローザ CAG 情報を頼むこと−負 (-) マウス心臓、眼、肺と蝸牛。(A) Dox を介した遺伝子活性化の効率を確認するには、内因性の RB1 の式だった CBRb+でダウンレギュ レート/ローザ CAG 情報を頼むこと+の組織陰性対照マウス組織ではないです。デンシトメトリー分析は、図 5で説明したように実行されました。相対の RB1 の表現のレベルは、各しみの下に表示されます。(B) このパネルには、さまざまな組織に対してプロット正規化された RB1 発現レベルのグラフィック表現が表示されます。内因性の RB1 レベルに個体差は、遺伝子の活性化と RB1 ダウンレギュレーションする個々 の応答の相違を説明するかもしれない。(C) RT-PCR を心の目で分析し、蝸牛が Dox 治療TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+組織におけるTetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTAのトラン スクリプトの重要なアップレギュレーションを明らかにDN CBRb+で/ローザ CAG 情報を頼むこと−負の制御グループ。CBRb+/rtTA+ = TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+;CBRb−/rtTA+ =ローザ-CAG 情報を頼むこと+;P < 0.05。この図は元細胞神経科学の最前線2ジャーナルで出版されました。その複製は、フロンティア'著者のポリシー' 著作権保持に同意します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
表 1: PCR の条件をチェックするために使用、CB Rb1融合領域。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
伝統的な形質転換戦略に関連付けられている制限を回避するために我々 は内因性ポイを時空間的にそれの DN の変異形を ⓫ 条件付きで不活性化することができますマウス モデルを生成しようと思う。内因性のランドマークの機能を廃止するには、いくつかのオプションは、15,,16,17をされています。式の表現に影響を与える突然変異体のペプチドを生成するライソゾーム プロテアーゼ CB の融合を用いた簡単な戦略に Dox 依存型転写システムを組み合わせることにより以前の遺伝の作戦1を変更しました。ポイの内因性2。最も重要なは、この方法には、ポイに関連付けられている経路の事前知識は必要ないです。DN タンパク質阻害する現在の戦略は、リソソーム2,3に向けて全体の RB と相互作用する複合体を CBRb 融合遺伝子にライソゾーム局在化シグナルに転換を示しています。一度リソソーム内部の劣化3につながるこれらの蛋白質のプロテアーゼによるプロセシングは開始されます。CB 融合タンパク質は、重音テト システムのリバーシブル ベンツピレン誘発関連付けの固有特性がこれは従来の形質転換戦略 (例えば、完全な遺伝子ノックアウト、条件付き削除) 有用な代替特にとき、興味の遺伝子の完全な削除は望ましくありません。
我々 は当初 RB1 蛋白質の研究を集中しました。DN の突然変異、タンパク質二量体や多量として機能を最も簡単に説明します。日には、RB1 分子の直接物理的な相互作用の証拠はないです。それにもかかわらず、その活動の本質的な性質は、与えられた時に同じ団地に複数の RB1 分子の存在をできます。たとえば、hypophosphorylated のバインディング E2F1 DP ヘテロダイマーに RB1 は、ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC)18,19,20通常占められる追加のバインディング サイトを提供します。その一方で、HDAC1 RB1 と物理的に相互に作用し、この複雑な順番、追加転写抑制18をこうして提供する E2F1 DP RB1 heterotrimer バインドします。このアプローチに従って DN の変異体は、RB1 分子グループ内の少なくとも 1 つ場合に、それから内因性 RB1、RB1 null 表現型をこのように引き出すのレベルは低くなりますが、転写を抑制複合体ができなくなります。ここでは、RB1 の内因性阻害は飲料水で Dox の投与後 10 日目に観察されました。Dox 誘導の最適用量は、システムごとに経験的に決定する必要があります、ただし。また、 Rb1遺伝子のシーケンスのほとんどは、構築メイクで使用されていた、それがので、内因性 RB1 の不在でも変異 RB1 できますとの対話、RB1 の結合パートナーのいずれかの DN 阻害を引き出します。この前提は、知られている RB1 結合分子の発現レベルを評価することによってテストできます。
大いに必要な細かく規制時間的・可逆的なタンパク質不活性化はさまざまな研究分野の基礎となる複雑な生化学的なメカニズムに光を当てるために検索数がより広い研究の開発の基礎を提供します。遺伝子と proteinactivity のさまざまな側面。ポイは、によってその分子的複雑さを理解することは成功した治療戦略を設計する研究者の能力を向上させる可能性があります。組織特異的発現プロモーター tTA または情報を頼むことのラインを駆動する DN マウスの繁殖によって増加した遺伝子特異性を実現できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
PCS2 + CB Myc6 ベクトルだったマーシャル ・ ホロウィッツ (ワシントン大学, シアトル、ワシントン州、米国) からの贈り物。丙 OC1 セルは、Fedrico Kalinec (デイヴィッド ・ ゲフィン医学カリフォルニア大学ロサンゼルス校、ロサンゼルス、カリフォルニア、米国) によって提供された親切。テクニカル サポートは、UNMC マウスのゲノム工学中心 (C.B. Gurumurthy、ドンは害を与える、・ ローレン クアドロス)、クレイトン大学統合医学イメージング施設 (リチャード ・ Hallworth、ジョン ・ Billheimer) によって提供されました。番号 P20 GM103471 を付与 UNMC マウスのゲノム工学の NIH/日の出から機関の開発賞 (アイデア) 支えられました。統合生体イメージング施設は、クレイトン大学医学部医学科 GM103427 と NIH/日の出から GM110768 の補助金によって支えられました。研究資源 (RR016469) センターからの助成金からの支援で建設された施設と日の出 (GM103427)。本研究では生成されたマウスの行は、クレイトン大学動物資源機能、NIH/NCRR/G20RR024001 での助成金による向上とその経済基盤で維持されました。この作品は、過去の NIH/NCRR/5P20RR018788-/NIH/日の出 8P20GM103471 COBRE 付与 (シェリー d. スミス) に、NIH/ORIP R21OD019745 01A1 (滿 s.)、および (S. Tarang) に公聴会健康づくり財団から新興の研究助成による支援を受けた。本研究の内容は著者の責任し、国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
- Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
- Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).
- Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
- Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
- Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
- Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
- Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
- Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
- Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
- Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
- Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
- Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
- Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
- Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
- Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
- Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).
