Summary
Her præsenterer vi en protokol for at udvikle en dominerende negativ inducerbar system, som kan enhver protein betinget inaktiveret ved reversibelt overekspression en dominerende negativ mutant version af det.
Abstract
Dominerende-negative (DN) protein hæmning er en kraftfuld metode til at manipulere protein funktion og tilbyder flere fordele sammenlignet med andre genom-baserede tilgange. For eksempel, selv om kimære og Cre-LoxP rettet mod strategier har været udbredt, de iboende begrænsninger af disse strategier (dvs, utætte promotor aktivitet, mosaik Cre udtryk, etc.) har betydeligt begrænset deres ansøgning. En fuldstændig sletning af mange endogene gener er desuden embryonically dødbringende, hvilket gør det umuligt at studere genfunktion i postnatal liv. For at imødegå disse udfordringer, vi har foretaget væsentlige ændringer til en tidlig genteknologi protokol og kombineret et kort (transgene) version af Rb1 gen med et lysosomale protease procathepsin B (CB), til at generere en DN musemodel af Rb1 (CBRb). På grund af tilstedeværelsen af en lysosomale protease dirigeres hele CB-RB1 fusion protein og dens interagerende komplekse til proteasom-medieret nedbrydning. Derudover muliggør tilstedeværelsen af en tetracyklin inducer (rtTA) element i den transgene konstruere en inducerbar og reversibel regulering af RB1 protein. Tilstedeværelsen af en allestedsnærværende ROSA-CAG promotor i CBRb musen model gør det et nyttigt værktøj til at udføre vandrende og reversible Rb1 gen ablation og give forskere en ressource for at forstå sin aktivitet i stort set enhver celletype hvor RB1 udtrykkes.
Introduction
De fleste tilgange med sigte på gen- og protein ablations stole på permanent processer, som generelt fører til fuldstændig fjernelse eller trunkering af genet, RNA sekvenser eller protein af interesse (POI). Det overordnede mål med denne metode er at ingeniør en rekombinant protein for at ophæve funktionen af endogent, wild-type protein. Vi har fornyet og moderniseret en alternativ strategi1,2, som giver mulighed for den midlertidige ablation af en POI gennem DN hæmning. Denne metode virker for både multimeriske og monomere peptider men er bedst egnet til proteiner, der fungerer i en multimeriske forsamling.
Metoden består af sammensmeltning den lysosomale protease CB til en underenhed af en multimeriske POI (CB fusion komplekse). Den resulterende CB fusion komplekse kan interagere med og proteolytically fordøje den endogene protein eller aflede den hele CB-POI kompleks at lysosomet at være forringet3. Desuden, en kombination af CB fusion kompleks med inducerbar arten af tetracyclin-kontrollerede transcriptional (Millie) aktiveringssystem tillader for inducerbar og kontrolleret udtryk af transgenet i en reversibel mode2. Skønt nyttig i mange situationer, kan den fuldstændig sletning af gener eller proteiner in vivo resultere i dødelighed4,5,6. Væv-specifikke, betinget sletning af nogle gener eller proteiner ved hjælp af Cre/Lox system kan ligeledes ikke være ligetil, som det vil i sidste ende føre til permanent tab af kritiske genomisk elements7. Derfor, afhængigt af genet eller POI, ingen af disse tilgange vil være effektive i at yde en nyttig model for efterfølgende undersøgelser, især gener eller proteiner funktionelle studier i sen postnatal og voksen mus.
For at omgå de problemer i forbindelse med sådanne tilgange og give proof-of-principle på effektiviteten af den foreslåede metode, har vi valgt at teste metoden præsenteret her ved at generere en betinget DN version af Retinoblastom 1 (RB1) protein. Flere muligheder har været foreslået8,9,10 at afskaffe funktionen af endogent RB1; men alle af dem står over for nogle af de samme begrænsninger diskuteret ovenfor: permanent kønscelleoverførsel sletning af RB1 er embryonically dødbringende, og i overensstemmelse med dens tumor suppressor rolle, permanent RB1 betinget sletning fører til en bred vifte af tumorer11. Selvom en DN version af RB1 ikke synes at forekomme naturligt, et bedre alternativ til de aktuelt tilgængelige strategier bør give mulighed for et tidsligt styret Inaktiveringen af den endogene RB1 og give en alternativ mekanisme til sidst gendanne dens funktion. Grundlaget for sådan en konstruktion blev beskrevet mere end to årtier siden1. Men på grund af teknologiske begrænsninger, det manglede en mekanisme til kontrol transgen aktivering, svar og væv specificitet. Denne undersøgelse er først til at kombinere elegance af doxycyclin (Dox)-afhængige transcriptional system med en manipuleret transgene konstruktion af lysosomale protease CB og Rb1 proteiner. Den resulterende CBRb musen model giver mulighed for en midlertidigt regulerede Dox-medieret RB1 forordning2. Fordelen ved at bruge sådan en proteom-baseret tilgang til at studere genfunktion er, at det kan vedtages for enhver gen af interesse, med minimal information om sin aktivitet.
Den foreslåede DN transgen strategi tilbyder mange fordele i forhold til traditionelle metoder. Første, DN protein hæmning fører til kun en delvis ablation i protein aktivitet, dermed bevare en resterende endogene udtryk. Et sådant resultat er ønskeligt i situationer hvor en fuldstændig fjernelse af protein aktivitet fører til embryonale dødelighed, stærkt begrænse enhver undersøgelse for at studere genfunktion i en levende mus. Andet, tilstedeværelsen af Millie system muliggør transgen aktivisering kun ved tilstedeværelse af et antibiotikum, der muliggør en effektiv og reversible kontrol af transgenet aktivitet. Således, ved at ophøre med den antibiotikaet administration, transgene systemet kan deaktiveres, og en normal RB1 udtryk er tilbage på plads. For det tredje kan specificiteten af transgenet udtryk variere afhængigt af promotor af valg. Mens vi har valgt den allestedsnærværende ROSA-CAG promotor for proof-of-principle, er placere transgen et væv-specifikke promotor tilbøjelige til at begrænse uønskede transgen udtryk og lette undersøgelser om den terapeutiske anvendelse af denne transgen metodologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Generation af transgene CBRb musen og alle dyrs pleje og eksperimenter i forbindelse med undersøgelsen blev godkendt af Creighton University institutionelle dyrs pleje og brug udvalg (IACUC) og udføres af deres retningslinjer.
1. transgene CB-Myc6-Rb1 konstruktion
Bemærk: Kloning af CBRb i en pTet_Splice vektor blev gjort i en multi-step proces (figur 1A og 1B).
-
Udføre den første fase kloning til pCS2 + CB-Myc6 vektor.
- Oprette CBRb transgen konstruktion, forstærke en 1583-bp-lange Rb1 cDNA fragment (528 aminosyrer svarende til aminosyre region 369-896) af RB1 protein ved hjælp af de følgende primer sat: for EcoRI +RB 1243F, brug GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTC, og XbaI + EcoRV +RB 2826Rasmussen, at bruge CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.
- Klon fragmentet genereret (1546 bp) mellem EcoR1 og XbaI begrænsning steder af pCS2 + CB-Myc6 vektor som tidligere beskrevet1,12.
Bemærk: 1012-bp-lange CB-Myc6 konstruktion (337 aminosyrer) smeltet til Rb1 fragment resulterede i et protein af ca 865 aminosyrer (omkring 108 kDa), som er lidt mindre end de endogene RB1 protein (~ 110 kDa) (figur 1 En), med en CB-Myc6 tag på N-terminus og Rb1 på C-terminus.
-
Udføre den anden fase subcloning i pTet-Splice vektor.
- At forstærke CB-RB-Myc6 fusion fragment og få Tet-promotor forstærke kassette, bestående af CB-myc6-Rb1 ved hjælp af primere, der indeholder EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) og SalI websteder: for SalI +CBF, Brug CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.
- Subclone fragmentet genereret (2567 bp) i pTet-Splice vektor, mellem SalI og EcoRV begrænsning websteder, på en sådan måde, at hele Millie-DN-CB-myc6-Rb1 transgenet, herunder SV40 intron og PolyA signal, kan være isolerede gennem en enkelt fordøjelse med NotI (figur 1B).
Bemærk: Opdag Fragmentet har været brugt til at generere de transgene finansieringskilder.
2. i in Vitro test af Millie-DN-CB-myc6-Rb1 transgenet
-
DOX-forordning: NIH3T3 cellelinje
Bemærk: Medmindre andet er angivet, er alle diskenheder blevet justeret for en 6-godt plade.- Vokse NIH3T3 celler efter leverandørens specifikationer, ved hjælp af de anbefalede celle Kulturmedier indeholdende 10% føtal bovint serum ved 37 ° C med 10% CO2.
- Cotransfect celler med pTet-splejsning og pCMV-Tet3G vektorer (fra trin 1) til 24 h. Følg trinene nævnt nedenfor for cotransfection.
- Bland 2 – 4 µL af lipid-baserede Transfektion reagens/brønd og 1 mL af ufuldstændig (uden serum) Dulbecco ændret Eagle Medium (DMEM) i 5 min ved stuetemperatur. For en 12 - eller 24-godt plade, bruge 250 eller 500 µL af dyrkningsmedier, henholdsvis, og justere Transfektion reagens volumen i overensstemmelse hermed.
- Tilføjes Transfektion reagens-DMEM 2-3 µg af plasmid DNA/brønd og Inkuber i 20 min ved stuetemperatur.
- Tilføje den blanding, der indeholder DNA og Transfektion reagens i DMEM til hver brønd. Efter 3-4 h inkubation, der tilsættes 1 mL af komplette medier (således at det endelige rumfang er 2 mL/hul). Holde delprøver af Dox stock (1 mg/mL) og Tilføj 2 µL i hver af brønde (+ Dox). Inkuber celler ved 37 ° C med 5% CO2.
Bemærk: Kontrolprøver bør bestå af cotransfected celler ikke behandlet med Dox (-Dox), såvel som NIH3T3 celler transfekteret kun med transaktivatoren pCMV-Tet3G vektor og behandlet med Dox i en 24-timers periode. For pCMV-Tet3G, koncentrationer af 0,1-1 µg/mL Dox bør være tilstrækkelig til at fremkalde transgen udtrykket.
-
Teste reversibilitet af konstruktionen ved hjælp af HEK293-cellelinie.
- At teste reversibilitet af Millie-DN-CB-myc6-Rb1 transgen, kultur HEK293 celler i Eagle's Minimum afgørende Medium (Maibritt VITH) efter leverandørens specifikationer og cotransfect med både pTet-splejsning og pCMV-Tet3G vektorer for 24 h, som beskrevet ovenfor (trin 2.1.2).
- For transgen inaktivering, fjerne den Dox-holdige medier efter 24 h, vaske cellerne 2 x-3 x med fosfatbufferet saltopløsning (PBS), og der inkuberes dem i Dox-gratis medier for en yderligere 24 h.
Bemærk: På Dox-fjernelse, bør transgen inaktivering og regelmæssig protein udtryk genoptages inden for denne frist, 24 h.
-
For at vurdere funktionaliteten af Millie-DN-CB-myc6-Rb1 konstruere fremme uplanlagt celleproliferation, udføre de funktionelle analyser ved hjælp af en HEI-OC1 cellelinie, som beskrevet nedenfor.
- Kultur HEI-OC1 celler i 10% DMEM under eftergivende betingelser (33 ° C med 10% CO2). For celle spredning undersøgelser, Tæl de celler ved hjælp af en celle counter, og pladen 10.000 HEI-OC1 celler på en 96-brønd plade i en 200 µL volumen. Inkuber cellerne natten over.
- Den følgende dag, udføre en forbigående cotransfection pTet-splejsning og pCMV-Tet3G vektorer ved hjælp af et lipid-baserede Transfektion reagens (Se trin 2.1.2). I en separat godt udføre pmR-ZsGreen1 Transfektion at2-µg ved hjælp af lipid-baserede Transfektion reagens (trin 2.1.2) til at beregne de Transfektion. Brug ikke transfekteret celler som kontrol.
- Påvise tilstedeværelsen af grønne fluorescens under et fluorescens mikroskop (excitation = 485 nm, emission = 530 nm) for de transfected celler 24 h efter Transfektion. Registrere tilstedeværelsen eller fraværet af grønne fluorescens og beregne satsen af Transfektion som det samlede antal NGL-positive celler (transfekteret celler) over de celler, der er mærket med DAPI (samlede celler).
Bemærk: Vi anslog en Transfektion på ~ 70%. - For at fremkalde transgen udtryk, tilføje 1 µg/mL Dox til et undersæt af transfekteret celler mens du bruger anden delmængden som kontrol (-Dox). Brug ubehandlet HEI-OC1 celler som yderligere kontrol.
- For at vurdere celleproliferation, bruge en celle spredning kit efter producentens protokol.
- Kort sagt, 48 timer efter Transfektion, fjerne cellekulturmedium og tilsæt 100 µL 1 x farvestoffet-bindende løsning til hver brønd med mikrotiterplade. Inkuber i 1 time ved 37 ° C.
- Derefter måler fluorescens-intensiteten af hver prøve ved hjælp af et fluorescens mikrotiterplade læser (excitation = 485 nm, emission = 530 nm).
- At vurdere celleproliferation ved hjælp af immuncytokemi, plade HEI-OC1 celler på et cover glas i en 12-godt plade og inkuberes natten over ved 37 ° C.
- Den følgende dag, cotransfect med pTet-splejsning og pCMV-Tet3G og udføre den Dox behandling (+ Dox). Bruge untransfected celler som kontrol. Proces HEI-OC1 celler for Ki-67 mærkning.
- Fix cellerne med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS, pH 7,4, i 10 min ved stuetemperatur. Vaske cellerne 3 x med iskold PBS og inkuberes celler i 0,25% nonionisk detergent i PBS i 10 min.
- Cellerne vaskes igen, 3 x i PBS for 5 min, og blok med 10% serum i en fugtig kammer i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkuber celler i 500 µL af Ki-67 primære antistof (1:200 fortynding) i 3 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
- Vaske cellerne 3 x til 5 min med PBS. Efter at udruge celler med den sekundære antistof i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
- Sekundær antistof-opløsning og vaske cellerne 3 x med PBS i 5 min. i mørke.
- For phalloidin mærkning, Ruger HEI-OC1 celler i 1:200 phalloidin for 30 min. Hvis du vil navngive kerner af celler, Ruger celler med 5 µg/mL DAPI i 10 min ved stuetemperatur.
Bemærk: Sikre, at phalloidin farvestof konjugat er anderledes end sekundær antistof konjugat.
3. generation af CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) Transgene mus og i Vivo test af metoden DN-CBRb
- Efter bekræftelse af effektiv Dox regulering af Millie-DN-CB-myc6-Rb1 transgen, rense NotI fragmentet og microinject dem ind i musen zygotes, som er senere overført til pseudo drægtige hundyr.
Bemærk: Disse procedurer blev udført på University of Nebraska Medical Center (UNMC) mus genom Engineering Core facilitet. - Efter levering, genotype hvalpene ved hjælp af en primer angivet specifikke til CB-Rb1 fusion region: CBRb F, bruge 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3 ', og for CBRB R, bruge 5 ' GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3′.
Bemærk: PCR produktstørrelse observeret på agarosegel er 401 bp (60-bp CB region + 341-bp Rb1 region (tabel 1). Ti uafhængige grundlægger linjer blev identificeret, baseret på tilstedeværelsen af Millie-DN-CB-myc6-Rb1 transgenet. I fem af disse linjer arvede afkom transgen, som bekræftede germline transmissionen af transgenet. En af de transgene linjer var i sidste ende anvendes til at etablere og vedligeholde linjen og generere Millie-DN-CB-myc6-Rb1 forsøgsdyr for yderligere undersøgelser. - Opdrætte voksne Millie-DN-CB-myc6-Rb1 mus til ROSA-CAG-rtTA tetracyclin inducer linje (lager #006965) (alternativt race til en tTA inducer linje) for at generere eksperimentelle DN-CBRb mus. Genotype afkom af dette kryds ved hjælp af følgende primer sæt: for rtTA-WT R, bruger GGAGCGGGAGAAATGGATATG; for rtTA Mutant Rasmussen, brug GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; og til rtTA fælles, brug AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. PCR produktstørrelser er 340 bp (mutant), 340 bp og 650 bp (heterozygote) og 650 bp (wild-type).
- Generere en dosis-respons kurve af RB1 protein efter Dox behandling at bestemme tid og længde af Dox behandling nødvendig for at fremkalde en transgen udtryk.
Bemærk: I dette eksperiment, blev vestlige skamplet og qRT-PCR brugt til at vurdere væv-specifikke transgen aktivering og RB1 udtryk. - Udføre fluorescens i situ hybridisering (FISH) til at bekræfte den genomisk indsættelse af transgenet.
Bemærk: Dette blev udført på centret for anvendt genomforskning på hospitalet for syge børn (Toronto, Canada). ELISA eller western blotting (ved hjælp af protein-specifikke antistof) kan bruges til at vurdere transgen aktivering, væv-specificitet, og ændringer i niveauet af den endogene POI. For DN-CB-myc6-Rb1 konstruktion brugte vi en anti-RB1 antistof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generelt, designe en DN mutation kræver en betydelig mængde oplysninger om struktur og funktion af POI. Derimod er DN strategien præsenteret her især nyttig, når de strukturelle og funktionelle oplysninger for POI'EN er begrænset. Hvis POI'ET er en multimeriske protein, en sammensmeltning af en underenhed til en lysosomale protease overvejende kan hæmme den forsamlede multimer og potentielt andre ligander gennem en kombination af proteolyse af de endogene underenheder og subcellulært omlægning af den Multimer til lysosomet. For at bekræfte vellykket kloning og teste effektiviteten af Dox-regulerede transgen aktivering, renset pTet-Splice plasmid som indeholder Millie-DN-CB-myc6-Rb1 var konstruktion transfekteret til mus NIH3T3 celler, der stabilt udtrykt i rtTA protein, men ikke Rb113. I mangel af Dox vises celler, der udtrykker rtTA ingen RB1 udtryk, hvorimod en robust RB1 udtryk blev observeret i overværelse af Dox (fig. 2A). Næste, for at teste, reversibilitet af systemet, vi cotransfected HEK293 celler (som endogent express Rb114) med renset pTet-Splice /Millie-DN-CB-myc6-Rb1 og pCMV-Tet3G-vektorer. Som forventet, var udtryk for den endogene RB1 protein betydeligt hæmmet på transgen aktivering ved tilsætning af Dox i celle kultur medier (figur 2B). For at teste systemet, reversibilitet efter en 24-timers periode, i en delmængde af HEK293 celler, vi erstattet Dox-holdige celle Kulturmedier med friske Dox-frie medier og inkuberes celler for en yderligere 24 h. støtte den Dox-regulerede reversibilitet, RB1 Udtrykket blev restaureret efter Dox udtagning fra dyrkningsmedier (figur 2B). Transfekteret HEK293 celler, der ikke blev behandlet med Dox eller Dox-behandlede HEK293 celler transfekteret med den pCMV-Tet3G vektor kun (figur 2B) viste basal niveauer af endogent RB1 udtryk. Fordi NIH3T3 celler ikke udtryk RB1 protein naturligvis, er den positive RB1 reaktivitet på grund af ophobning af transgene RB1 protein. Da vores interesse i den potentielle proliferativ effekt af Millie-DN-CB-myc6-Rb1 konstruktion i det auditive system, vi målte det samlede DNA-indhold i pTet-Splice /Millie-DN-CB-myc6-Rb1- og pCMV-Tet3G-transfekteret HEI-OC1 celler () indre øre orgel af en Corti-afledte cellelinje) i tilstedeværelse og fravær af Dox. Overensstemmelse med Arbejdshypotesen præsenteres her, en betydelig stigning i DNA indhold (svarende til en stigning i celle nummer) blev observeret i Dox-behandlet men ikke ubehandlet (kontrol) transfekteret HEI-OC1 celler (figur 3A - 3 C ).
Efter in vitro-bekræftelse af transgenet aktivitet og funktion, transgene musemodel blev genereret. FISK, ved hjælp af en Millie-DN-CB-myc6-Rb1 digoxigenin (grave)-hest radise peberrodsperoxidase (HRP) / tyramin-biotin/begærlighed-Cy5-mærket sonde, og G-striber af mandlige mus splenocytes og øre fibroblaster blev udført for at bekræfte transgene indsættelsen i den Transgene mus genom. Blandt de fem kønscelleoverførsel fremsendende stiftere, linje 14 viste en konsekvent transgen indsættelse inden for segmentet 10C 3 ~ D2 (figur 4A - 4 C). Mus fra denne linje blev brugt til at etablere avl kolonier og generere forsøgsdyr for yderligere undersøgelser. For at fastslå det optimale tidspunkt for Dox induktion og Millie-DN-CB-myc6-Rb1 transgen aktivering, vi opdelt de Transgene mus i tre forskellige grupper, hvori Dox blev administreret i drikkevand for varierende længder af tid: gruppe 1 (3 dage af behandlingen), gruppe 2 (7 dage af behandlingen) og gruppe 3 (10 dage af behandling). Efter afslutningen af behandlingen, blev ændringer i RB1 protein udtryk vurderet ved western blotting (figur 5A - 5 D). Fordi DN og indfødte RB1 proteiner har lignende Molekylær vægt, kan ikke de løses fra hinanden på en vestlige skamplet. Dog, i overensstemmelse med en indledende stigning i RB1 protein (på grund af ophobning af DN-RB1 og endogene proteiner), der var en indledende stigning i samlede RB1 protein udtryk i Transgene mus cochleae sammenlignet med kontrolgruppen (figur 5 A). Desuden, i overensstemmelse med de hæmmende og proteolytiske aktivitet af Millie-DN-CB-myc6-Rb1 transgen produkt, en målelig reduktion i RB1 udtryk blev observeret i gruppe 2 og 3 i forhold til gruppe 1- og kontrolgrupper ( Figur 5A - 5 D). Af note resulterede behandling længere end 10 dage ikke i yderligere ændring af RB1 protein udtryk. Således 10 dage af Dox behandling blev anset for optimal og anvendes til yderligere undersøgelser.
Fordi rtTA og dermed Millie-DN-CB-myc6-Rb1 transgen aktivering er den allestedsnærværende ROSA-CAG promotor, RB1 potentielt kunne hæmmes i enhver vævs- eller hvor RB1is endogent udtryk (fx lunger, hjerte, nethinden). For at teste denne forudsætning og evaluere den transgene væv specificitet, cochleae, lunger, hjerte og øjne biopsier blev dissekeret fra TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA, og kontrol mus (ikke transporterer ROSA-CAG-rtTA transgenet) blev vurderet for RB1 udtryk (figur 6A - 6 C). Uanset væv analyseres, blev en væsentlig reduktion i RB1 protein observeret i TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA men ikke i kontrolgruppen (figur 6A). I skarp kontrast, qRT-PCR analyser i øjet, hjertet og cochleae af Dox-behandlet TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA og alder-matchede kontrol mus viste en betydelig opregulering af DN-CBRb udskrift i væv af tidligere, men ikke den sidstnævnte mus (figur 6C). Disse resultater bekræfter helt, effektiviteten af konstruktionen. En stigning i afskriften udtryk afspejler den effektive Dox-regulerede transgen induktion. Ligeledes er en reduktion i protein udtryk foreneligt med de routing og proteolytisk nedbrydning af den endogene RB1.
Figur 1: Multi-trins kloning af CBRb og generation af den inducerbar TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA. (A) dette panel viser kloning af Rb1 fragment i pCS2-CB-Myc6 vektor. En 1583-bp Rb1 gen produkt var PCR forstærket ved hjælp af EcoRI + RB1243 frem og Xba + EcoRV + RB2826 omvendt primere. Den resulterende Rb1 fragment er klonet mellem EcoRI og Xbal begrænsning websteder pCS2 vektor indeholdende CB-Myc6 konstruktion for at generere pCS2 + CB-myc6 + Rb1 vektoren. (B) den CB-myc6 + Rb1 fragment er klonet i pTetSplice vektor mellem SalI og EcoRV begrænsning websteder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Effektiviteten af aktiveringen af Dox-regulerede transgenet. (A) NIH3T3 celler ikke normalt udtryk RB113. Bekræfter effektiv aktivering af Millie-DN-CB-myc6-Rb1 konstruktion, afslørede en western blot analyse med anti-RB1 antistof en robust RB1 udtryk i overværelse af Dox (spor 1 og 3), men ikke i sit fravær (baner 2 og 4). (B) HEK293 celler, som endogent express Rb114, var cotransfected med Millie-DN-CB-myc6-Rb1 og pCMV-Tet3G transaktivatoren vektor. I mangel af Dox (lane 1), blev en positiv RB1 udtryk observeret. Tilføjelsen af Dox til systemet forårsaget Millie-DN-CB-myc6-Rb1 aktivering og RB1 downregulation (lane 2). Udtrykket RB1 blev genoptaget 24 h efter Dox blev fjernet fra media (lane 3). C = kontrol, untransfected HEK293 celler ikke behandlet med Dox. Dette er en tilpasning af en figur, oprindelig offentliggjort i tidsskriftet grænser i Cellular Neuroscience2. Dens reproduktion enig grænser'politik på forfattere' ophavsret fastholdelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Dox-medieret DN-CBRb transgen aktivering øger celledelingen. (A) HEI-OC1 celler cotransfected med renset Millie-DN-CB-myc6-Rb1, og pCMV-Tet3G-vektorer var kulturperler i fravær (−) eller tilstedeværelse (+) af Dox. Celledelingen var fast besluttet på 48 timer efter Transfektion ved hjælp af en spredning assay. Den procentvise ændring i spredning blev beregnet ved hjælp af en ændring i fluorescens værdier med untransfected celler som kontrol. En beskeden, men signifikant stigning i celle nummer blev observeret i de transfected celler, efter Dox behandling. Derimod ingen væsentlige ændringer blev observeret mellem transfekteret HEI-OC1 celler ikke behandles med (−) Dox og den untransfected kontrol. (B) HEI-OC1 celler untransfected eller (C) cotransfected med renset Millie-DN-CB-myc6-Rb1 og pCMV-Tet3G vektorer kulturperler tilstedeværelse (+) af Dox var mærket med Ki-67 (rød), Phalloidin (grøn) og DAPI (blå). P < 0,05. Skalalinjen = 10 µm. Dette er en tilpasning af en figur, oprindelig offentliggjort i tidsskriftet grænser i Cellular Neuroscience2. Dens reproduktion enig grænser'politik på forfattere' ophavsret fastholdelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Fluorescerende i situ hybridisering (FISH) bekræftelse af genomisk indsættelse af Millie-DN-CB-myc6-Rb1 transgenet. En pCS2-CBRb (digoxigenin probe/anti-DIG-HRP/tyramide-biotin/begærlighed-Cy5, i rød) test sonde var hybridiseret at splenocytes og øre fibroblast celle metafase at se hvis sonden signal kunne påvises eller ikke med en one-Kopieringsdestinationen skærstørrelse på 2,5 kb. PCS2-CBRb test sonde hybridiseret at en kromosom 10 med lyse, doublet sonde signaler, der viste indsættelse af Millie-DN-CB-myc6-Rb1 transgenet inden for segmentet 10 C 3-D2. RP23 - 267G 24 (spektrum grøn) kontrol sonde hybridiseret at kromosom 10 på bandet 10A1 som forventede og bekræftede at CBRb DNA af interesse indsat i kromosom 10. (A) dette panel viser G-band metafase. (B) dette panel viser tyramide signal forstærkning (TSA) fisk billede fra den samme metafase som vist i panelet A. (C) dette panel viser sammensatte billeder af kromosom 10 viser (1) G-banding, (2) TSA fisk, og (3) TSA fisk med omvendt DAPI banding. Rød = pCS2-CBRb sonde; blå = DAPI banding; grøn = RP23 - 267G 24 kontrol sonde. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : DN-CBRb transgen aktivering i det indre øre af postnatal (P) 36 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb+) og ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb−) mus efter 3 (gruppe 1), 7 (gruppe 2) og 10 (gruppe 3) dage af Dox behandling. (A-C) Anti-RB1, som reagerer med både hyperphosphorylated og hypophosphorylated former af RB1, som godt som anti-c-myc antistoffer blev brugt til registrering. Densitometric analyse blev udført ved hjælp af ImageJ software. De tilsvarende værdier opnået var normaliseret til den negative kontrol CBRb− (-) og derefter til β-actin. De relative RB1 udtryk niveauer er vist nedenunder hver skamplet. (D) Den grafiske gengivelse af normaliserede RB1 udtryk niveauer plottes forskellige behandlinger højdepunkter en konsekvent lavere RB1 påvisning i CBRb+ (+) prøver. Hver lane på vestlige skamplet gel og hver kolonne på grafikken svarer til en anden person. P < 0.05.This figur blev oprindeligt offentliggjort i tidsskriftet grænser i Cellular Neuroscience2. Dens reproduktion enig grænser'politik på forfattere' ophavsret fastholdelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Rumlige analyser af TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA transgen aktivering i P18 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (+) og DN-CBRb+/ROSA-CAG-rtTA− negative kontrol (-) mus hjertet, øjet, lunger og cochlea. (A) bekræfte effektiviteten af Dox-medieret transgen aktivering, udtryk for den endogene RB1 var downregulated i CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ væv, men ikke i negativ kontrol mus væv. Densitometric analyse blev udført som beskrevet i figur 5. De relative RB1 udtryk niveauer er vist nedenunder hver skamplet. (B) dette panel viser en grafisk repræsentation af normaliserede RB1 udtryk niveauer plottes i de forskellige væv. En interindividual variant af endogene RB1 niveauer kan forklare forskelle i individuelle reaktioner på transgen aktivering og RB1 downregulation. (C) RT-PCR analyser i øjnene, hjerte, og cochleae viste en betydelig opregulering af TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA udskriften i Dox-behandlede TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ væv, men ikke i DN-CBRb+/ROSA-CAG-rtTA− negativ kontrolgruppe. CBRb+/rtTA+ = TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+; CBRb−/rtTA+ = ROSA-CAG-rtTA+; P < 0,05. Dette tal blev oprindeligt offentliggjort i tidsskriftet grænser i Cellular Neuroscience2. Dens reproduktion enig grænser'politik på forfattere' ophavsret fastholdelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: PCR tilstand anvendes til at kontrollere de CB-Rb1 fusion region.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at omgå de begrænsninger, der er forbundet med traditionelle transgene strategier, forsøgte vi at generere en musemodel, hvor kan en endogen POI betinget inaktiveret ved overekspression en DN mutant form af det på en spatiotemporelle måde. For at ophæve funktionen af endogent POI'er, har flere muligheder været foreslået15,16,17. Vi har ændret en tidligere genetiske strategi1 ved at kombinere Dox-afhængige transcriptional system til en enkel strategi beskæftiger en fusion af den lysosomale protease CB at generere en mutant peptid hvis udtryk påvirker udtryk for den endogene POI2. Vigtigst, kræver denne teknik ingen forudgående kendskab til pathway forbundet med POI. Den nuværende strategi til DN protein hæmning viser, at den lysosomale lokalisering signal på CBRb fusion gen omstillinger hele RB-interagere komplekset mod lysosomet2,3. Én gang inde i lysosomet, proteolytiske behandling af disse proteiner er indledt, fører til deres nedbrydning3. Den iboende egenskab ved den CB-smeltet protein, tilknyttet den reversible inducibility ordningens Millie gør dette et nyttigt alternativ til traditionelle transgene strategier (fx komplet gen knockout, betinget sletning), især når de fuldstændig sletning af gen af interesse er ikke ønskeligt.
Vi fokuserer i første omgang forskningen på RB1 protein. DN mutationer er lettest beskrives i proteiner, der fungerer som en dimer eller multimerer. Til dato, er der ingen tegn på et direkte fysisk interaktion mellem RB1 molekyler. Ikke desto mindre, den iboende karakter af sin aktivitet giver mulighed for tilstedeværelsen af flere RB1 molekyler i samme kompleks på et givet tidspunkt. For eksempel, binding af hypophosphorylated RB1 til E2F1-DP heterodimer giver en ekstra bindingssted, som normalt er besat af Histon deacetylase (HDAC)18,19,20. På den anden side HDAC1 interagerer fysisk med RB1 og dette kompleks, til gengæld binder sig til E2F1-DP-RB1 heterotrimer, hvilket giver yderligere transskription undertrykkelse18. Ifølge denne fremgangsmåde, hvis mindst én af RB1 molekyler i gruppen er en mutant, DN, vil det forhindre komplekset fra at undertrykke transkription, mens det reducerer niveauet af endogent RB1, dermed fremkalde en RB1-null fænotype. Her, blev endogene RB1 hæmning observeret 10 dage efter administration af Dox i drikkevand. Den optimale dosis for Dox induktion kan, men skal være empirisk bestemmes for hvert system. Desuden, da de fleste af Rb1 gensekvens blev brugt på at konstruere makeup, det er muligt, at mutant RB1 selv i mangel af endogene RB1, kan interagere med og fremkalde DN hæmning af nogen af de RB1 bindende partnere. Denne forudsætning kan testes ved at vurdere niveauet udtryk af kendte RB1-bindende molekyler.
Tiltrængt, fint regulerede tidsmæssige og reversible protein inaktivering vil danne grundlag for udviklingen af en bred vifte af undersøgelser i et endnu større antal forskningsområder søgning for at kaste lys over de underliggende komplekse biokemiske mekanismer de forskellige aspekter af genet og proteinactivity. Afhængigt af POI, forstå dens molekylære kompleksitet er tilbøjelige til at forbedre forskernes evne til at designe succesfulde terapeutiske strategier. Øget transgen specificitet opnås ved avl DN musen til væv-specifikke projektledere køre enten tTA eller rtTA linjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
PCS2 + CB-Myc6 vektor var en gave fra Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, USA). HEI-OC1 celler blev venligst leveret af Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Teknisk støtte blev leveret fra den UNMC mus genom Engineering Core (C.B. Annis, Don Harms, Rolen Quadros) og Creighton University integreret biomedicinsk Imaging anlægget (Richard Hallworth, John Billheimer). UNMC musen genom Engineering blev støttet af en institutionel udvikling Award (idé) fra NIH/NIGMS, give nummer P20 GM103471. Den integrerede biomedicinsk Imaging facilitet blev støttet af Creighton University School of Medicine og grants GM103427 og GM110768 fra NIH/NIGMS. Anlægget blev bygget med støtte fra tilskud fra det nationale Center for forskningsressourcer (RR016469) og NIGMS (GM103427). Mus linjer oprettes i denne undersøgelse blev opretholdt på Creighton Universitys dyr ressource facilitet, hvis infrastrukturen er blevet forbedret gennem et tilskud af NIH/NCRR G20RR024001. Dette arbejde fik forbi støtte gennem en NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE yde (til Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) og en spirende forskning tilskud fra Hearing Health Foundation (til S. Vagn). Indholdet af denne forskning er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
- Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
- Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).
- Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
- Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
- Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
- Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
- Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
- Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
- Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
- Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
- Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
- Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
- Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
- Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
- Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
- Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).
