Summary
O crescimento de culturas bacterianas radiolabeled em pratos do de microtitulação facilita a amostragem elevada da taxa de transferência que permite testes técnicos e biológicos múltiplos da repetição da abundância da associação do nucleotide, incluindo aquele de (p) ppgpp. Os efeitos das transições de crescimento provocados por fontes de estresse fisiológico, bem como a recuperação do estresse podem ser monitorados.
Abstract
O nucleotídeo (p) ppGpp funciona como um regulador global em bactérias em resposta a uma variedade de estresse físico e nutricional. Tem um início rápido, em segundos, o que leva ao acúmulo de níveis que se aproximam ou excedem os de pools de GTP. Ocasiões de reversão de estresse um rápido desaparecimento de (p) ppGpp, muitas vezes com uma meia-vida de menos de um minuto. A presença de (p) ppGpp resulta em alterações da expressão gênica celular e do metabolismo que contrariam os efeitos nocivos do estresse. As bactérias Gram-negativas e Gram-positivas têm diferentes mecanismos de resposta, mas ambas dependem da (p) concentração de ppGpp. Em todo o caso, há uma necessidade de monitorar simultaneamente muitas culturas bacterianas radioolabeled em intervalos de tempo que podem variar de 10 segundos às horas durante períodos críticos da transição do esforço. Este protocolo aborda este desafio técnico. O método aproveita-se das incubadoras do prato da temperatura-e do Shaker-controlled do de microtitulação que permitem a monitoração paralela do crescimento (absorvância) e a amostragem rápida de culturas uniformemente fosfato-radiolabeled para resolver e quantificar associações do nucleotide por cromatografia em camada delgada em PEI-celulose. Pequenas quantidades de amostra são necessárias para múltiplas repetições técnicas e biológicas de análises. As transições complexas de crescimento, como o crescimento diauxico e as taxas de rotatividade rápida (p) ppGpp, podem ser avaliadas quantitativamente por esse método.
Introduction
O (p) ppgpp segundo mensageiro é um regulador global que modula a expressão de um grande número de genes, incluindo genes para sintetizar ribossomas e aminoácidos1,2. Embora inicialmente descoberto em Escherichia coli3, (p) ppgpp pode ser encontrado em bactérias gram positivas e Gram negativas, bem como em clorotipados de plantas4,5. Para e . coli e outras bactérias Gram-negativas, (p) ppgpp interage diretamente com a RNA polimerase em dois sítios diferentes6,7,8. Em gram positivos, (p) ppgpp inibe a abundância de GTP, que é detectado por CodY, uma proteína de ligação de GTP com motivos de reconhecimento de DNA específicos do gene que levam à regulação9,10. (p) o ppgpp se acumula em resposta à inanição por diferentes nutrientes e condições de estresse, resultando em crescimento lento e ajustes da expressão gênica para permitir a adaptação ao estresse11,12.
A quantidade líquida de ppgpp acumulada reflecte um equilíbrio entre as actividades da sintetase e da hidrolase. Em e. coli RelA é uma forte sintetase e mancha é bifuncional, com uma forte hidlase e uma sintetase fraca, cada uma das quais pode ser regulada de forma diferente de forma dependente do stress. A forte relação sintetase é ativada quando a disponibilidade de Codon-especificado cobrado tRNA vinculado ao ribossomal um site quando ele não consegue acompanhar as demandas de síntese protéica13,14,15. O ponto fraco (p) ppgpp sintetase é ativado enquanto a forte (p) ppgpp hidrolase é inibida em resposta a outras condições de estresse e através de outros mecanismos. algumas condições, proteínas como ACP ou RSD podem se vincular ao ponto, o que também altera o equilíbrio entre a hidrólise e a síntese16,17. Em gram positivos, a síntese e a hidrólise refletem um equilíbrio mais complexo entre uma única proteína do homólogo do ponto de RelA (RSH) com atividades fortes da síntese e da hidrólise assim como hidrolases e/ou sintetases menores12.
Os nucleotídeos de (p) ppgpp foram descobertos primeiramente como os pontos 32p etiquetados incomuns que apareceram em autoradiograms de cromatogramas da fino-camada (TLC) durante uma resposta estrita induzida pela inanição do ácido aminado3. Os protocolos de rotulagem mais detalhados foram revistos 18. O protocolo descrito aqui (Figura 1) é uma modificação desses protocolos que permite o monitoramento do crescimento de múltiplas amostras em placas de de microtitulação. Isso facilita múltiplas estimativas biológicas e técnicas de (p) alterações na abundância de ppGpp e foi inicialmente desenvolvida para estudos de turnos diauxínicos19. A rotulagem de (p) ppGpp com 32p e detecção por TLC também permite medições de (p) taxas de degradação de ppgpp. Métodos alternativos foram desenvolvidos para determinar os níveis de ppGpp (p) como espectrometria de massas, HPLC20, quimiosensoresfluorescentes 21,22e fusões de genes GFP a promotores afetados pelo ppgpp23, os quimiosensores 24. fluorescentes têm atualmente um uso limitado devido a deslocamentos espectrais pequenos após o ppgpp obrigatório assim como os problemas que distinguem entre ppgpp e pppgpp21. Este método é eficiente para detectar (p) ppGpp in vitro, mas não em extratos celulares. Os métodos que envolvem HPLC foram melhorados20 mas exigem o equipamento caro e não são adaptados bem ao elevado-põr. Finalmente, as fusões de GFP podem dar uma estimativa da ativação ou da inibição dependente do ppGpp, mas não medem o próprio ppGpp. Quando cada um destes métodos alternativos for valioso, exigem o equipamento caro ou o tempo hands-on substancial, ou são de outra maneira não passíveis à amostragem cinética múltipla e ao processamento subseqüente. Com o método descrito aqui, 96 amostras podem ser aplicadas a seis placas TLC em cerca de 20 min (18 amostras por placa), resolvidas pelo desenvolvimento de TLC em menos de um par de horas, com dados quantitativos obtidos após várias horas ou durante a noite, dependendo da rotulagem Intensidade.
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Protocol
1. preparação de mídia
-
Para MOPS (3-(N-morpholino) propanesulfonic ácido) Media25, use 1/10 volume de 10x Mops sais, 1/100 volume de 100x micronutrientes solução, 3 mm fosfato de sódio para culturas overnight ou 0,2 mm fosfato de sódio para a rotulagem uniforme com 32P, 0,2% de glicose e 1 μg/mL de tiamina (vitamina B1). Adicionar aminoácidos a 40 μg/mL, se necessário.
- Para os sais de MOPAS, use 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO4, 95 mm NH4CL, 2,6 mm K2so4, 5 ΜM CAcl2, 10,56 mm MgCl2e 500 mm NaCl. Adicione os diferentes componentes na ordem escrita para evitar a precipitação. Ajustar a pH 7,4 com KOH e esterilizar por filtração.
- Para solução de 100 x micronutrientes, use 3 μM (NH4)6(MO 7)24, 0,4 mm H3Bo4, 30 μM Cocl2, 10 μm CuSO4, 80 μm MNCL2e 10 μm znso4. Esterilizar por autoclavagem.
- Para a glicose (20%) e fosfato de sódio (300 mM) soluções, esterilizar como separar 100x estoques por autoclavagem. Esterilizar os estoques de 100x de misturas de tiamina e aminoácidos por filtração. Prepare mídia fresca de soluções de estoque estéril para cada experimento.
2. rotulagem com 32P
- Cresça culturas durante a noite em meios de MOPS com fosfato de sódio de 3 mM.
- Em uma placa de 24 poços, adicione 550 μL de meios de MOPS contendo 0,2 mM de fosfato de sódio e 30 μL de cada inóculo bacteriano (diluição 1/20). Isto produzirá um ininoculto inicial de OD600Nm 0,1. Use um poço com meios frescos como um controle da esterilidade.
- Coloc a placa em uma incubadora de agitação em 37 ° c que agitam em 900 rpm por 30 minutos. as culturas são aquecidas de abaixo e a agitação fornece a aeração. Fixe a chapa firmemente com fita para evitar inclinagens ou derrames. O crescimento pode ser monitorado com uma placa replicada em paralelo na mídia com falta de 32P usando um leitor de placas e incubando as mesmas condições.
- Adicionar 100 μCi a cada poço de 32P ortofosfato (20 μL de um estoque de 5 MCI/ml).
Nota: A quantidade de radioatividade também pode ser ajustada para atender às necessidades experimentais. Para baixos níveis basais 100 μCi com fosfato de portador de 0,2 mM funciona bem, mas para medir (p) os níveis de ppGpp que se espera que se tornem equivalentes aos pools de GTP, o rótulo pode ser Descartado para 25 ou 50 μCi. Abaixar o fosfato do portador abaixo de 0,2 milímetros não é recomendado evitar os níveis do fosfato que tornam-se limitando para o crescimento.
Cuidado: 32P é um isótopo de emissão de β para usar a blindagem adequada especificada para segurança. Todos os materiais radioactivos devem ser devidamente eliminados, tomando todas as precauções possíveis. - Cresça na incubadora de agitação para 1 a 2 duplicações (1 h ou mais) para permitir que a etiqueta externa equilibrar pela maior parte com as associações intracelular do nucleotide antes de induzir o esforço.
3. indução do stress ou da fome
-
Induzir o stress usando um método de sua escolha, dependendo do tipo de estresse estudado, por exemplo, adicionando inibidores da via metabólica, mudando de temperatura, esgotar os nutrientes necessários, deslocando mudanças de osmolaridade, induzindo o estresse oxidativo, adicionando toxinas, etc.
- Por exemplo, adicione 100 μg/mL de L-valina para induzir a fome de isoleucina em cepas de E. coli K-12. O aumento dos níveis de ppGpp será observado após 5 minutos de indução.
4. amostragem e extração de ppGpp
- Adicionar 20 μL de cada amostra de células rotuladas a um tubo de 0,2 mL de PCR contendo 20 μL de ácido fórmico a 6 M de gelo frio.
- Coloque imediatamente as amostras em gelo seco.
- Melhore a eficiência da extração celular por 3 ciclos de congelação e de thawing.
- Pouco antes de manchando cromatogramas finos da camada da celulose de PEI, as amostras do centrifugador por 1 minuto na velocidade máxima aos restos da pilha da pelota para evitar a mancham em cromatogramas.
5. cromatografia de camada fina
- Com um lápis macio, marque uma linha de origem a 1 cm da borda da placa de 20 cm x 20 cm PEI-cellulose TLC que teve 5 cm removido da parte superior com tesouras. Aplique 5 μL como uma gota na superfície PEI para cada amostra. Comece o desenvolvimento ascendente sem permitir que este ponto seque, que melhoram a definição minimizando Streaking.
- Faça o desenvolvimento ascendente em um tanque com uma camada de 1,5 M KH2po4 (pH 3,4) solução rasa o suficiente para que o líquido não toque no local da amostra de origem. Cubra o tanque com um selo hermético e deixe a subida líquida para o topo da folha cortada, 15 cm. Para obter pH 3,4 para uma solução de 1,5 M KH2po4 , é necessário ajustar o pH por adição de H3po4.
- Retire o cromatograma totalmente desenvolvido e o ar seco à temperatura ambiente.
- Corte e descarte a parte superior (frente pH) do cromatograma contendo o 32P livre em resíduos radioactivos. Esta porção é representada na cor amarela na Figura 2 e facilmente visualizada luz UV. Se a medição apenas (p) nucleotídeos ppGpp que migram mais lentamente do que GTP, recomenda-se executar um padrão de GTP UV-visível e, em seguida, cortar e descartar uma porção superior maior (qualquer coisa acima GTP, como mostrado na Figura 2).
- Expor filmes autoradiográficos durante a noite com uma tela de fósforo.
- Desenvolva o filme. Capture e quantificar o sinal da tela do fósforo com um phosphoimager.
6. quantitation de (p) ppGpp
- Quantitate manchas radioativas com a imagem J26,27.
Nota: A quantidade de (p) ppGpp pode ser normalizada para a quantidade total de nucleotídeos G observados em cada amostra (Figura 2). Se a quantidade de fundo é homogênea, um único espaço em branco (caixa 4 da Figura 2) pode ser subtraído para corrigir para o plano de fundo. Total G é a soma de GTP + ppGpp + pppGpp detectados. Essa normalização pressupõe que os níveis de GMP e PIB são desprezíveis, o que é verdadeiro para e. coli. A razão de um dado nucleotídeo ao total G fornece uma maneira importante de corrigir para variações do volume de amostra aplicado.
7. medição da taxa de decaimento ppGpp
Nota: Uma modificação deste protocolo permite medições de taxas de decaimento ppGpp.
- Depois de provocar estresse ou fome por um tempo suficiente para permitir a acumulação de ppGpp (etapa 3), reverter o estresse, a fim de bloquear a síntese de ppGpp continuou, o que permite a detecção de taxas hidrolíticas. O procedimento para reversão dependerá do stress. Por exemplo, adicione 200 μg/mL de cloranfenicol para reverter a fome de aminoácidos.
- As taxas de decaimento são geralmente rápidas, mas podem variar, então pegue amostras a cada 20-30 s até 2 min. processe amostras como na etapa 4.
- Uma vez que o TLC é desenvolvido (como no passo 5) e os níveis de ppGpp obtidos durante o tempo de curso, parcela de conteúdo ppGpp residual em um lote semilogarítmico vs tempo para permitir a visualização de taxas de zero ordem de deterioração, como uma linha reta, e estimativa da meia-vida ppGpp.
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Representative Results
Em cepas de E. coli K-12, a adição de valina provoca uma inanição endógena de isoleucina, o que resulta em um aumento dos níveis de ppGpp após 5 min3. As células cultivadas em MOPS contendo todos os aminoácidos, exceto para ILV, foram rotuladas com 32P conforme indicado na Figura 1. Uma vez rotulado, foram adicionados 6 μL de 10 mg/mL de L-valina (100 μg/mL de concentração final) para produzir inanição de isoleucina. As amostras foram colhidas 0 e 5 min após a adição de valina. Após 5 min (Figura 3a), um aumento de 2 e 2,5 vezes nos níveis de ppgpp e pppgpp ocorreram. Como controle negativo, uma amostra rotulada sem células foi utilizada para detectar possíveis compostos que não eram ortofosfato na fonte de 32P. Além disso, incluindo uma cepa deficiente ppGpp (ΔrelA δspoT) como um controle negativo poderia ajudar a melhor identificação dos pontos.
A reversão da inanição do isoleucina pode ser conseguida pelo Chloramphenicol, um inibidor da síntese da proteína, que reduza o consumo de Ile-tRNA carregado e por sua vez, restaura relações elevadas de carregada ao tRNA não carregado. A ativação do ppgpp sintetase RelA-negociado forte é abolida, que permite uma medida da degradação do ppgpp imperturbável pela síntese residual. Portanto, 200 μg/mL de cloranfenicol foi adicionado às culturas faminta e as amostras foram colhidas em intervalos de 20 s depois disso. Neste caso, o ppGpp deteriorou-se com uma semivida de cerca de 64 s (Figura 3B).
Figura 1: medição do ppGpp pelo fluxo de trabalho TLC. A representação esquemática do protocolo para extrair ppGpp formam culturas bacterianas e sua detecção posterior por TLC. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: análise de TLC representativa. Representação esquemática dos resultados obtidos após autoradiografia e tela de fósforo durante a noite com o TLC. Os pontos a serem medidos são mostrados em vermelho. A fórmula para calcular a quantidade fracionária de ppGpp também é mostrada. Total G refere-se à quantidade total de GTP + ppGpp + pppGpp detectados na amostra. A faixa amarela representa a parte dianteira do pH visível a luz UV. As tesouras indicam onde recomendamos o corte do cromatograma para descartar a maior parte da radioatividade. A seta indica a direção do fluxo durante o desenvolvimento ascendente com tampão fosfato de 1,5 M. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: mensuração da síntese e deterioração do ppGpp. (A) detecção de ppGpp por TLC para amostras 0 e 5 minutos após a adição de valina. Pontos correspondentes a GTP, ppGpp e pppGpp são marcados. Uma cultura livre de células foi incluída como controle negativo (C-). (B) deterioração de ppGpp após adição de cloranfenicol para reverter a fome de aminoácidos. A meia-vida ppGpp é determinada a partir da taxa de decaimento exponencial representada por linhas pontilhadas. As barras de erro refletem o SD das duplicatas. O eixo Y é representado em uma escala da (log2). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Conseguir a rotulagem uniforme próxima das pilhas é uma etapa crítica para este protocolo. Portanto, o uso de meios de comunicação definidos, como MOPS ou Tris, é crucial para permitir a variação das concentrações de fosfato de portador e atividade específica. A mídia tamponada por fosfato, como M9 ou mídia A, não pode ser usada. A maioria dos meios indefinidos contêm quantidades variáveis de fosfato, tais como LB, triptona e ácidos casamino. O isótopo de fosfato 33p é um emissor mais fraco que pode ser substituído por 32p. vantagens da substituição são que é mais seguro e tem uma meia-vida de 25 dias em vez de 14 dias para 32p. No entanto, as emissões mais energéticas de 32P aumentam consideravelmente a sensibilidade à detecção. É importante salientar os perigos de trabalhar com isótopos e a importância de usar proteções e descarte adequados de blindagem. A descoberta recente de um Riboswitch capaz de detectar especificamente ppGpp28 pode um dia levar a uma maneira mais segura para detectar ppgpp in vitro e in vivo. Como mencionado na introdução, existem outros métodos, embora o uso de rotulagem de fosfato permaneça uma abordagem sensível, direta e rápida para medições através de Put de ppGpp bacterianos (p), bem como outros compostos de fosfato rotulados, como ribo ou deoxyribo-NTP pools, PRPP, PPi ou fosfatos de açúcar.
Uma outra etapa crítica é assegurar-se de que o crescimento das culturas paralelas (incubadora da agitação e leitor da placa) seja similar. Ao estudar a exaustão de nutrientes, como a mudança diauxica19, a sincronia entre as culturas é crucial. A comparabilidade do crescimento em placas etiquetadas e sem rótulo pode ser avaliada por OD600 medidas de um poço sem rótulo na placa de outra maneira radioativa. Para aumentar o número de amostras testadas, uma placa de 96 poços pode ser usada em vez de 19, mas a quantidade de mídia necessária para minimizar a evaporação reduzirá a aeração da cultura. Os níveis basais de (p) ppGpp serão ligeiramente mais elevados durante o crescimento em uma placa do poço 96 comparado a uma placa de 24 poços devido à aeração reduzida. Conseqüentemente, para medir níveis básicos, um crescimento da placa de 24 poços é recomendado. Para medir variações de níveis de ppGpp mais fortemente induzidos (p), é preferível uma placa de 96 poços. A escolha entre 24 e 96 placas de de microtitulação bem depende do objetivo experimental.
As variações deste protocolo têm muitas aplicações potenciais para condições diferentes do stress. Recentemente nós aplicamos-lo para medir a acumulação e a deterioração de ppgpp durante deslocamentos dicionário clássicos da glicose à lactose e a outros açúcares alternativos. Estes estudos revelaram a participação da fome da glicose e da inanição19do ácido aminado. Aqui nós descrevemos a inanição do ácido aminado induzida pela valina em estirpes de E. coli K12 como uma condição de esforço mais simples e bem estudada3. Este exemplo pode ser usado como um controle antes de executar situações de fome mais complicadas. A fome de aminoácido pode ser provocada pela adição de quantidades limitadas de um aminoácido necessário que é esgotado durante o crescimento; adição de um inibidor da aminoacilação ou síntese de tRNA (hidroxamato de serina, mupirocina ou 3-Aminotriazol) ou para E. coli K12 acrescentando valina na ausência de isoleucina). O hidroxamato de serina é freqüentemente usado para inibir a aminoacilação de tRNAser , mas requer altas concentrações, o que pode causar problemas devido à reatividade do hidroxamato com outros compostos. Reversão de efeitos de hidroxamato de serina, adicionando uma grande quantidade de serina pode ter efeitos não desejados1. Embora SHX tenha sido provado ser eficaz como um diagnóstico de produção de ppGpp, não recomendamos o seu uso para estudos fisiológicos para produzir a fome de aminoácidos, porque os mecanismos de feedback normal (p) ppGpp são abolidos, tais como conseqüências fisiológicas de reduzir as atividades supérfluas, mas permitindo a ativação de circuitos reguladores de sobrevivência de stress.
Modificações dos procedimentos de TLC aqui descritos são necessárias para separar corretamente nucleotídeos regulatórios não canônicos, como (p) ppApp29, de amostras mistas com (p) ppGpp. Demonstrou-se que o pppapp tem um papel antagônico no ppgpp in vitro30,31; Portanto, é necessária uma melhor separação de ambos os compostos para estudos futuros.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada o programa de pesquisa intramural, Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de saúde da criança e desenvolvimento humano, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
References
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