Summary
Tillväxten av radiomärkade bakteriekulturer i mikrotiterrätter underlättar hög genomströmning provtagning som tillåter flera tekniska och biologiska replikat analyser av nukleotid pool överflöd, inklusive den av (p) ppGpp. Effekterna av tillväxt övergångar provoceras av källor till fysiologisk stress samt återhämtning från stress kan övervakas.
Abstract
Den (p) ppGpp nukleotid fungerar som en global regulator i bakterier som svar på en mängd olika fysiska och näringsmässiga stress. Den har en snabb debut, i sekunder, vilket leder till ackumulering av nivåer som närmar sig eller överskrider de av GTP pooler. Stress återföring tillfällen en snabb försvinnande av (p) ppGpp, ofta med en halveringstid på mindre än en minut. Närvaron av (p) ppGpp resulterar i förändringar av cellulära genuttryck och metabolism som motverkar de skadliga effekterna av stress. Gramnegativa och grampositiva bakterier har olika responsmekanismer, men båda är beroende av (p) ppGpp-koncentration. Under alla omständigheter finns det ett behov av att samtidigt övervaka många radiomärkade bakteriekulturer vid tidsintervall som kan variera från 10 sekunder till timmar under kritiska stress övergångsperioder. Detta protokoll tar upp denna tekniska utmaning. Metoden utnyttjar temperatur-och shaker-kontrollerade mikrotiter skålen inkubatorer som möjliggör parallell övervakning av tillväxt (absorbans) och snabb provtagning av enhetligt fosfat-radiomärkade kulturer att lösa och kvantitera nukleotid pooler genom tunn skikts kromatografi på PEI-cellulosa. Små mängder prov behövs för flera tekniska och biologiska replikat av analyser. Komplexa tillväxt övergångar, såsom diauxic tillväxt och Rapid (p) ppGpp omsättningshastighet kan kvantitativt bedömas med denna metod.
Introduction
Den (p) ppgpp andra budbärare är en global regulator som modulerar uttrycket av ett stort antal gener, inklusive gener för syntetisera ribosomer och aminosyror1,2. Även initialt upptäcktes i Escherichia coli3, (p) ppgpp kan hittas i både grampositiva och gramnegativa bakterier samt i växternas kloroplaster4,5. För E. coli och andra gramnegativa bakterier, (p) ppgpp interagerar direkt med RNA-polymeras på två olika platser6,7,8. I grampositiva, (p) ppgpp hämmar GTP överflöd, som är kände av CodY, ett GTP-bindande protein med genspecifika DNA-igenkännings motiv som leder till regel9,10. (p) ppgpp ackumuleras som svar på svält för olika näringsämnen och stressförhållanden, vilket resulterar i långsam tillväxt och justeringar av genuttryck för att möjliggöra anpassning till stress11,12.
Nettobeloppet för ackumulerade ppgpp återspeglar en balans mellan--syntetas och hydrolas verksamhet. I E. coli RelA är en stark--syntetas och SpoT är bifunktionell, med en stark hydrolas och en svag syntetas, som var och en kan regleras på olika sätt i en stress beroende sättet. Den starka RelA-Synthetasen aktiveras när tillgängligheten av Codon-specificerade laddade tRNA som är destinerade till ribosomalen en plats, när den underlåter för att hänga upp med kraven av proteinsyntes13,14,15. Den svaga punkten (p) ppGpp-syntetas aktiveras medan den starka (p) ppGpp-hydrolasen hämmas som svar på andra stressförhållanden och genom andra mekanismer. Under vissa förhållanden, proteiner som ACP eller RSD kan binda till SpoT, som också ändra balansen mellan hydrolys och syntes16,17. I grampositiva speglar syntes och hydrolys en mer komplex balans mellan ett enda RelA-protein med stark syntes och hydrolysverksamhet samt mindre Hydrolaser och/eller synthetaser12.
Den (p) ppGpp nukleotider upptäcktes först som ovanliga 32p märkta fläckar som dök upp på autoradiograms av tunnskiktskromatogram (TLC) under ett strikt svar induceras av aminosyra svält3. Mer detaljerade märkningsprotokoll har granskats 18. Det protokoll som beskrivs här (figur 1) är en modifiering av dessa protokoll som gör det möjligt att övervaka tillväxten av flera prover på mikrotiterplattor. Detta underlättar flera biologiska och tekniska uppskattningar av (p) ppGpp överflöd förändringar och utvecklades ursprungligen för studier av diauxic Skift19. Märkning av (p) ppGpp med 32p och detektion genom TLC medger också mätning av (p) ppgpp nedbrytningshastigheter. Alternativa metoder har utvecklats för att fastställa (p) ppGpp-nivåer såsom masspektrometri, HPLC20, fluorescerande kemosensorer21,22och GFP-genfusioner till projektansvariga som drabbats av ppgpp23, 24. fluorescerande chemosensors har för närvarande en begränsad användning på grund av små spektralskift efter bindande ppgpp samt problem att skilja mellan ppgpp och pppgpp21. Denna metod är effektiv för att upptäcka (p) ppGpp in vitro, men inte i cellulära extrakt. Metoder med HPLC har förbättrats20 men kräver dyr utrustning och är inte väl anpassade till hög genom-put. Slutligen, GFP fusioner kan ge en uppskattning av ppGpp beroende aktivering eller hämning, men inte mäta ppGpp själv. Medan var och en av dessa alternativa metoder är värdefulla, de kräver dyr utrustning eller betydande hands-on tid, eller de är annars inte mottagliga för flera kinetiska provtagning och efterföljande bearbetning. Med den metod som beskrivs här, 96 prover kan appliceras på sex TLC plattor i ca 20 min (18 prover per tallrik), lösas av TLC utveckling på mindre än ett par timmar, med kvantitativa data som erhållits efter flera timmar eller över natten, beroende på märkning Intensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förberedelse av media
-
För moppar (3-(N-morpholino) propanesulfonic acid) Media25, Använd 1/10 volym av 10X mops salter, 1/100 volym 100x mikronäringsämnen lösning, 3 mm natriumfosfat för natten kulturer eller 0,2 mm natriumfosfat för enhetlig märkning med 32P, 0,2% glukos och 1 μg/mL tiamin (vitamin B1). Tillsätt aminosyror på 40 μg/mL vid behov.
- För moppar salter, Använd 400 mM moppar, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO4, 95 mm NH4cl, 2,6 mm K2så4,5ΜM CaCl2, 10,56 mm mgcl2, och 500 mm NaCl. Lägg till de olika komponenterna i den ordning som skrivits för att undvika nederbörd. Justera till pH 7,4 med KOH och sterilisera genom filtrering.
- För 100x mikronäringsämnen lösning, Använd 3 μM (NH4)6(MO 7)24, 0,4 mm H3bo4, 30 μM Cocl2, 10 μm CuSO4, 80 μm mncl2, och 10 μm znso4. Sterilisera genom autoklav.
- För glukos (20%) och natriumfosfat (300 mM) lösningar, sterilisera som separata 100x lager genom autoklav. Sterilisera 100x lager av tiamin och aminosyran blandningar genom filtrering. Förbered färska medier från sterila lagerlösningar för varje experiment.
2. märkning med 32P
- Odla över natten kulturer i moppar media med 3 mM natriumfosfat.
- Tillsätt 550 μl mops-material i en 24-välsplattor som innehåller 0,2 mm natriumfosfat bärare och 30 μl av varje bakteriell inokulum (spädning 1/20). Detta kommer att producera en initial inokulum av OD600Nm 0,1. Använd en brunn med färska medier som en sterilitet kontroll.
- Placera plattan på en skakande inkubator vid 37 ° c skakning vid 900 rpm i 30 min. kulturer värms underifrån och skakar ger luftning. Fäst plattan ordentligt med tejp för att undvika tippning eller spill. Tillväxten kan övervakas med en replikat platta parallellt i media som saknar 32P med hjälp av en Plattläsare och inkuberas under samma förhållanden.
- Tillsätt 100 μCi till varje brunn på 32P ortofosfat (20 μl från ett 5 MCi/ml-lager).
Anmärkning: Mängden radioaktivitet kan också justeras för att tillgodose experimentella behov. För låga basala nivåer 100 μCi med 0,2 mM bärare fosfat fungerar bra, men för att mäta (p) ppGpp nivåer som förväntas bli likvärdiga med GTP pooler, etikett kan släppas till 25 eller 50 μCi. Sänka bärare fosfat under 0,2 mM rekommenderas inte för att undvika fosfatnivåer blir begränsande för tillväxt.
Varning: 32P är en β-utsändande isotop så Använd lämplig avskärmning specificerad för säkerhet. Allt radioaktivt material måste kasseras på lämpligt sätt med alla tänkbara försiktighetsåtgärder. - Växa i skakning inkubator för 1 till 2 dubbleringar (1 h eller mer) att tillåta extern etikett till stor del jämbrate med intracellulära nukleotid pooler innan inducera stress.
3. induktion av stress eller svält
-
Framkalla stress med hjälp av en metod som du väljer, beroende på vilken typ av stress studeras, e.g. lägga metaboliska väg hämmare, ändra temperatur, utmattande nödvändiga näringsämnen, skiftande osmolaritet Skift, inducera oxidativ stress, lägga till toxiner, etc.
- Till exempel, tillsätt 100 μg/mL L-valin för att inducera isoleucin svält i E. coli K-12 stammar. Förhöjda nivåer av ppGpp kommer att observeras efter 5 minuters induktion.
4. provtagning och ppGpp-extraktion
- Tillsätt 20 μL av varje märkt cellprov till ett 0,2 mL PCR-rör som innehåller 20 μL iskall 6 M myrsyra.
- Placera proverna omedelbart i torris.
- Förbättra cellulära utvinning effektivitet genom 3 cykler av frysning och upptinning.
- Strax före spotting PEI cellulosa tunna skikt kromatogram, Centrifugera prover för 1 min vid maximal hastighet till pellets cell skräp för att undvika spotting den på kromatogram.
5. tunnskiktskromatografi
- Med en mjuk penna, markera en ursprungs linje 1 cm från kanten av 20 cm x 20 cm PEI-cellulosa TLC plattan som har haft 5 cm bort från toppen med sax. Applicera 5 μL som en droppe i PEI-ytan för varje prov. Börja stigande utveckling utan att låta denna plats att torka, vilket förbättrar upplösningen genom att minimera strimmor.
- Gör stigande utveckling i en tank med ett skikt av 1,5 M KH2Po4 (pH 3,4) lösning grunt nog så att vätskan inte vidrör ursprunget provet plats. Täck tanken med en lufttät tätning och låt vätske stigning till toppen av den trimmade arket, 15 cm. För att uppnå pH 3,4 för en 1,5 M KH2Po4 lösning, är det nödvändigt att justera pH genom tillsats av H3Po4.
- Ta bort det fullt utvecklade kromatogrammet och lufttorka i rumstemperatur.
- Klipp ut och kassera den övre delen (pH-Front) i kromatogrammet som innehåller den fria 32P i radioaktivt avfall. Denna del representeras i gul färg i figur 2 och visualiseras lätt under UV-ljus. Om endast mätning (p) ppGpp nukleotider som migrerar långsammare än GTP, rekommenderas att köra en UV-synlig GTP standard och sedan klippa och kassera en större övre delen (något ovan GTP, som visas i figur 2).
- Exponera autoradiografiska filmer över natten med en fosfor skärm.
- Utveckla filmen. Fånga och kvantifiera fosfor skärm signalen med en fosfoimager.
6. kvantifiering av (p) ppGpp
- Kvantitera radioaktiva fläckar med bild J26,27.
Anmärkning: Mängden (p) ppGpp kan normaliseras till total mängd G nukleotider som observerats i varje prov (figur 2). Om mängden bakgrund är homogen, kan en enda tom (ruta 4 från figur 2) subtraas för att korrigera för bakgrunden. Totalt G är summan av GTP + ppGpp + pppGpp upptäcks. Denna normalisering förutsätter att GMP och BNP-nivåer är försumbara, vilket är sant för E. coli. Förhållandet mellan en given nukleotid och total G är ett viktigt sätt att korrigera för variationer av tillämpad provvolym.
7. mätning av graden av ppGpp förfall
Anmärkning: En ändring av detta protokoll tillåter mätningar av ppGpp-sönderfalls hastigheter.
- Efter provocerande stress eller svält under en tid som är tillräcklig för att möjliggöra ackumulering av ppGpp (steg 3), omvänd stressen för att blockera fortsatt ppGpp syntes, vilket möjliggör detektion av hydrolytiska priser. Förfarandet för återföring kommer att bero på stressen. Till exempel, tillsätt 200 μg/mL kloramfenikol att vända någon aminosyra svält.
- Sönderfalls hastigheter är vanligtvis snabba men kan variera, så ta prover varje 20-30 s upp till 2 min. process prov som i steg 4.
- När TLC är utvecklad (som i steg 5) och nivåerna av ppGpp erhålls under tiden kursen, tomt resterande ppGpp innehåll på en semi-logaritmisk Plot vs tid för att möjliggöra visualisering av noll order grader av förfall, som en rak linje, och uppskattning av ppGpp halveringstid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I E. coli K-12 stammar, tillsats av valin provocerar en endogent svält av isoleucin, vilket resulterar en ökning av ppgpp nivåer efter 5 min3. Celler som odlas i moppar som innehåller alla aminosyror utom ILV har märkts med 32P enligt figur 1. När det har märkts har 6 μL 10 mg/mL L-valin (100 μg/mL slutlig koncentration) tillsatts för att framställa isoleucin-svält. Prover togs 0 och 5 min efter tillsats av valien. Efter 5 minuter (figur 3a) inträffade en 2-och 2,5-faldig ökning av nivåerna av ppgpp och pppgpp. Som en negativ kontroll, ett cellfritt märkt prov användes för att upptäcka eventuella föreningar som inte var ortofosfat i 32P källa. Också, inklusive en ppGpp bristfällig stam (ΔrelA δspoT) som en negativ kontroll kan hjälpa en bättre identifiering av fläckarna.
Återföring av isoleucin svält kan uppnås genom kloramfenikol, en hämmare av proteinsyntes, vilket minskar konsumtionen av laddade Ile-tRNA och i sin tur, återställer höga förhållanden debiteras till oladdade tRNA. Aktivering av den starka RelA-medierade ppGpp-Synthetasen avskaffas, vilket gör att ett mått på ppGpp-nedbrytning är ogenomträngande vid restsyntes. Därför sattes 200 μg/mL kloramfenikol i de utsvultna kulturerna och proverna togs vid 20 s-intervaller därefter. I detta fall, ppGpp skämdes med en halveringstid på ca 64 s (figur 3b).
Figur 1: mätning av ppGpp genom TLC-arbetsflöde. Schematisk representation av protokollet för att extrahera ppGpp form bakteriekulturer och dess bakre detektering av TLC. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativ TLC-analys. Schematisk representation av de erhållna resultaten efter autoradiografi och fosfor skärm över natten med TLC. De punkter som ska mätas visas i rött. Formeln för att beräkna fraktionerad mängd ppGpp visas också. Totalt G avser den totala mängden GTP + ppGpp + pppGpp som upptäckts i provet. Det gula bandet representerar pH-fronten synlig under UV-ljus. Sax indikerar var vi rekommenderar att du klipper av kromatogrammet för att kasta det mesta av radioaktiviteten. Pilen indikerar riktningen av flödet under stigande utveckling med 1,5 M fosfatbuffert. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: mätning av syntes och sönderfall av ppGpp. A) detektion av ppGpp med TLC för prover 0 och 5 minuter efter tillsats av VALIT. Fläckar som motsvarar GTP, ppGpp och pppGpp är markerade. En cell fri kultur inkluderades som negativ kontroll (C-). (B) sönderfall av ppGpp efter tillsats av kloramfenikol för att återföra aminosyran svält. Den ppGpp halveringstiden bestäms från den exponentiella sönderfalls frekvensen representeras av prickade linjer. Felstaplar återspeglar SD från dubbletter. Y-axeln representeras i en semilogaritmic (log2) skala. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att uppnå nära enhetlig märkning av cellerna är ett kritiskt steg för detta protokoll. Därför är användningen av definierade medier, såsom moppar eller Tris media, avgörande för att möjliggöra variation av bärare av fosfat koncentrationer och specifik aktivitet. Fosfatbuffrat media, till exempel M9 eller media A, kan inte användas. De flesta odefinierade medierna innehåller varierande mängder fosfat, såsom LB, trypton och casamino syror. Fosfat isotopen 33p är en svagare EMITTER som kan ersätta 32p. fördelarna med substitution är att det är säkrare och har en halveringstid på 25 dagar i stället för 14 dagar för 32p. Emellertid, de mer energiska utsläppen av 32P avsevärt förbättra detekterings känslighet. Det är viktigt att betona farorna med att arbeta med isotoper och vikten av att använda ordentliga skydds-och bortskaffningsskydd. Den senaste upptäckten av en riboswitch kan upptäcka specifikt ppGpp28 maj Someday leda till ett säkrare sätt att upptäcka ppgpp in vitro-och in vivo. Som nämnts i inledningen finns det andra metoder, även om användningen av fosfat märkning fortfarande är en känslig, direkt och snabb metod för genom-put mätningar av bakteriell (p) ppGpp samt andra fosfathalsade föreningar, såsom ribo-eller deoxyribo-NTP pooler, PRPP, PPi eller socker fosfater.
Ett annat kritiskt steg är att se till att de parallella kulturernas tillväxt (skakning av inkubator och Plattläsare) är likartad. När man studerar näringsämne utmattning, såsom diauxic Shift19, Synchrony mellan kulturer är avgörande. Jämförbarheten av tillväxt på märkta och omärkta plattor kan bedömas genom OD600 mätningar av en omärkt brunn på den annars radioaktiva plattan. För att öka antalet prover som testats, en 96 väl plattan kan användas i stället 19, men mängden media som krävs för att minimera avdunstning kommer att minska kulturen luftning. Basala nivåer av (p) ppGpp kommer att vara något högre under tillväxt i en 96 väl plattan jämfört med en 24 väl plattan på grund av den reducerade luftning. Därför, för mätning av basal nivåer, en 24 brunn plattans tillväxt rekommenderas. För att mäta variationer av starkare inducerad (p) ppGpp nivåer, en 96 väl plattan är att föredra. Det primat mellan 24 och 96 väl i mikrotiterbrunnarna pläterar beror på det experimentella målet.
Variationer av detta protokoll har många potentiella tillämpningar för olika villkor för stress. Nyligen har vi tillämpat den för att mäta ackumulering och sönderfall av ppGpp under klassiska diauxiska förskjutningar från glukos till laktos och till andra alternativa sockerarter. Dessa studier avslöjade medverkan av både glukos svält och aminosyra svält19. Här beskriver vi aminosyran svält inducerad av valien i E. coli K12 stammar som en enklare och väl studerade stress villkor3. Det här exemplet kan användas som en kontroll innan du utför mer komplicerade svält-situationer. Aminosyra svält kan provoceras genom att lägga till begränsade mängder av en nödvändig aminosyra som är uttömd under tillväxt; tillsats av en hämmare av tRNA aminoacylation eller syntes (serin hydroxamate, mupirocin, eller 3-aminotriazol) eller för E. coli K12 lägga valin i avsaknad av isoleucin). Serine hydroxamate används ofta för att hämma tRNAser aminoacylation men kräver höga koncentrationer, vilket kan orsaka problem på grund av hydroxamate reaktivitet med andra föreningar. Återföring av serin hydroxamate effekter genom att lägga till en stor mängd serin kan ha icke önskvärda effekter1. Även om SHX har visat sig vara effektiv som en diagnostik av ppGpp produktion, rekommenderar vi inte dess användning för fysiologiska studier för att producera aminosyra svält, eftersom normala (p) ppGpp återkopplingsmekanismer avskaffas, såsom fysiologiska konsekvenser att minska överflödig verksamhet, men tillåta aktivering av reglerings kretsar för spännings överlevnad.
Ändringar av de TLC-procedurer som beskrivs här är nödvändiga för att korrekt separera icke-kanoniska reglerande nukleotider, såsom (p) ppApp29, från blandade prover med (p) ppGpp. Det har visats att pppapp har en antagonistisk roll till ppgpp in vitro30,31; Därför krävs bättre separation av båda föreningarna för framtida studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av intramural forsknings program, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health och Human Development, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
References
- Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D.
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).
- Cashel, M., Gallant, J. Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli. Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life. PloS One. 6 (8), e23479 (2011).
- Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).
- Molodtsov, V., et al. Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA. Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).
- Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response. Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).
- Kriel, A., et al. Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance. Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).
- Kriel, A., et al. GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes. Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).
- Potrykus, K., Cashel, M.
- Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).
- Arenz, S., et al. The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).
- Loveland, A. B., et al. Ribosome•RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation. eLife. 5, e17029 (2016).
- Brown, A., Fernández, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V.
- Battesti, A., Bouveret, E. Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism. Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).
- Lee, J. -W., Park, Y. -H., Seok, Y. -J. Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).
- Cashel, M. Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants. Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).
- Fernández-Coll, L., Cashel, M. Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. , (2018).
- Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp. Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).
- Rhee, H. -W., et al. Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp. J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).
- Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On. Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).
- Pokhilko, A. Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor. BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).
- Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp. Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F.
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Peselis, A., Serganov, A. ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands. Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).
- Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).
- Travers, A. A. ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).
- Bruhn-Olszewska, B., et al. Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).
