Identificatie van EGFR- en RAS-remmers met Caenorhabditis elegans
Summary
De genetisch trekbare nematode Caenorhabditis elegans kan worden gebruikt als een eenvoudig en goedkoop model voor het ontdekken van geneesmiddelen. Hier wordt een protocol beschreven om antikankertherapieën te identificeren die de downstream signalering van RAS- en EGFR-eiwitten remmen.
Abstract
De veranderingen in de plasmamembraanlokalisatie van de epidermale groeifactorreceptor (EGFR) en de downstream-effector RAS zijn betrokken bij verschillende ziekten, waaronder kanker. De vrijlevende nematode C. elegans bezit een evolutionaire en functioneel geconserveerde EGFR-RAS-ERK MAP signaalcascade die centraal staat voor de ontwikkeling van de vulva. Toename van functiemutaties in RAS-homologe LET-60 en EGFR-homolog LET-23 induceert de generatie van zichtbare niet-functionele ectopische pseudovulva langs de ventrale lichaamswand van deze wormen. Eerder is aangetoond dat het multivulvale (Muv) fenotype in deze wormen wordt geremd door kleine chemische moleculen. Hier beschrijven we een protocol voor het gebruik van de worm in een vloeistofgebaseerde test om remmers te identificeren die de activiteiten van EGFR- en RAS-eiwitten afschaffen. Met behulp van deze test tonen we R-fendiline, een indirecte remmer van K-RAS, onderdrukt het Muv fenotype uitgedrukt in de let-60(n1046) en let-23(sa62) mutant wormen. De test is eenvoudig, goedkoop, is niet tijdrovend om in te stellen en kan worden gebruikt als een eerste platform voor de ontdekking van antikankertherapieën.
Introduction
De cellulaire paden die ontwikkelingsgebeurtenissen in organismen reguleren, zijn sterk geconserveerd onder alle metazoën. Een van die routes is de EGFR-RAS-ERK mitogen activated protein kinase (MAPK) signaleringscascade, een kritieke route die de celproliferatie, differentiatie, migratie en overlevingregelt 1,2. Defecten in dit signaleringstraject kunnen leiden tot pathologische of ziektetoestanden zoals kanker. De epidermale groeifactorreceptor (EGFR) is sterk uitgedrukt in menselijke tumoren, waaronder 50% van orale plaveiselcelcarcinomen, en draagt bij aan de ontwikkeling van kwaadaardige tumoren3,4,5. Terwijl mutaties in de drie RAS-isovormen H-, K- en N-RAS belangrijke aanjagers zijn voor kwaadaardige transformatie bij meerdere menselijke kankers. Van deze drie RAS-isovormen komen oncogene mutaties in K-RAS het meest voor6,7,8. Om EGFR en RAS te laten functioneren, moeten ze lokaliseren naar het plasmamembraan (PM). Het voorkomen van de lokalisatie van deze moleculen naar de PM kan de biologische activiteit van deze signaalroute9,10volledig intrekken . Vandaar dat de remming van de lokalisatie van deze eiwitten naar de PM een therapeutische strategie is om de downstream signalering en de daaruit voortvloeiende negatieve resultaten te blokkeren. Met behulp van een screeningstest met een hoog gehalte werd fendiline, een calciumantagoneerder van het L-type, geïdentificeerd als een remmer van K-RAS-activiteit11. Nanoclustering van K-RAS naar de binnenste bijsluiter van de PM is significant verminderd in aanwezigheid van fendiline. Bovendien wordt K-RAS herverdeeld van het plasmamembraan naar het endoplasmatisch reticulum (ER), Golgi-apparaat, endosomen en cytosol. Wat nog belangrijker is, de proliferatie van pancreas-, dikke darm-, long- en endometriumkankercellijnen die oncogene mutant K-RAS uitdrukken, wordt geblokkeerd door de remming van downstreamsignalering door fendiline11. Deze gegevens suggereren fendiline functioneert als een specifieke K-RAS antikanker therapeutische die de verkeerde lokalisatie van het RAS-eiwit naar de PM veroorzaakt.
De nematode Caenorhabditis elegans is uitgebreid bestudeerd in de context van ontwikkeling. Veel van de signaalroutes die de ontwikkeling in de worm regelen, zijn evolutionair en functioneel geconserveerd. De EGFR-gemedieerde activering van RAS en de daaropvolgende activering van de ERK MAPK-signaalcascade worden bijvoorbeeld bewaard in worm12. De cascade wordt vertegenwoordigd door de volgende eiwitten: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 is homoloog voor RAS, terwijl LET-23 homoloog is voor EGFR. In de worm reguleert deze route de ontwikkeling van de vulva13. De vulva is een epitheelopening op de ventrale lichaamswand van de worm waarmee bevruchte eieren kunnen worden gelegd. De vorming van de vulva in de worm is afhankelijk van de blootstelling van de vulval precursorcellen (VPC) aan een gradiënt van activering van de EGFR-RAS-MAPK signaalcascade. Tijdens de normale ontwikkeling ontvangen de proximale VPC’s sterke signalen van de gonadale ankercellen om zich te onderscheiden in 1° en 2° cel lot dat aanleiding geeft tot een functionele vulva12. Terwijl distale VPC’s differentiëren in 3° cel lot dat fuseert met het hypodermale syncytium en geen vulva vormen als gevolg van uitgeputte signalering. Bij afwezigheid van signalering differentiëren alle VPC’s in 3° cel lot wat resulteert in de vorming van geen vulva. Constitutieve signalering leidt echter tot de vorming van een of meer niet-functionele vulva als gevolg van de inductie van alle VPC’s om 1° en 2° cel lot aan te nemen.
Mutaties die defecte of overmatige vulval inductie veroorzaken, zijn geïdentificeerd voor veel van de genen die coderen voor eiwitten die deze route vertegenwoordigen. Defecte vulval inductie resulteert in een vulvaless (Vul) fenotype, terwijl overmatige vulval inductie resulteert in een multivulva (Muv) fenotype dat wordt vertegenwoordigd door de ontwikkeling van talrijke niet-functionele ectopische pseudovulvae door de ventrale lichaamswand. Het Muv-fenotype uitgedrukt door de let-60(n1046) stam is te wijten aan een toename van functiemutatie in RAS, terwijl het bij de let-23(sa62) stam te wijten is aan een activerende mutatie in EGFR14,15. Het sterke Muv-fenotype in deze mutante stammen is verstoord door farmacologische interventies, zoals aangetoond door de behandeling van let-60(n1046) wormen met de MEK-1-remmer U012616,17. Interessant is dat we hebben aangetoond dat R-fendiline en remmers die het sphingomyelinemetabolisme beïnvloeden, het Muv-fenotype in de wormonderdrukken 18. Om aan te tonen dat deze remmers let-60 signalering op ras-niveau blokkeren, is de lin-1 null-stam gebruikt17. Lin-1 is een Ets-achtige remmende transcriptiefactor die fungeert als een repressor in de ontwikkeling van de vulva19. Sterke reversie van het Muv-fenotype bij let-60(n1046) wormen en geen effect op lin-1 null wormen suggereren dat deze remmingen optreden op het niveau van RAS.
In dit protocol demonstreren we het gebruik van C. elegans als model om remmers van RAS- en EGFR-eiwitten te identificeren. Met behulp van een vloeistofgebaseerde test tonen we de remmende effecten van R-fendiline aan door de Muv-fenotypen in de let-60(n1046) en let-23(sa62) mutante stammen van C. elegans teonderdrukken. Deze test valideert het gebruik van C. elegans als hulpmiddel in de beginfase van de ontdekking van geneesmiddelen voor antikankertherapieën.
Protocol
Representative Results
Discussion
De test die we beschrijven met behulp van de worm zijn eenvoudig en goedkoop om remmers van EGFR en RAS-functie te identificeren. C. elegans is een aantrekkelijk model voor het ontdekken van geneesmiddelen omdat het gemakkelijk te kweken is in het lab vanwege de korte levenscyclus (3 dagen bij 20 °C) en het vermogen om grote aantallen larven te genereren. Wat nog belangrijker is, de EGFR-RAS-ERK MAPK-route is evolutionair en functioneel geconserveerd met zoogdieren die een genetisch tracteerbaar systeem bieden …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Dr. Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) voor het leveren van de let-60(n1046). We danken ook Dr. David Reiner (Texas A&M Health Science Center Institute of Biosciences &Technology in Houston) voor de lin-1 soort. Tot slot bedanken we Dr. Danielle Garsin en haar lab (De Universiteit van Texas, McGovern Medical School) voor het verstrekken van enkele van de reagentia. Sommige wormstammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dit onderzoek werd ondersteund door de Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) subsidie RP200047 aan JF Hancock.
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
Riferimenti
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
- Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Ricerca sul cancro. 53 (15), 3579-3584 (1993).
- Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
- Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
- Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Ricerca sul cancro. 49 (17), 4682-4689 (1989).
- Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
- Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Ricerca sul cancro. 72 (10), 2457-2467 (2012).
- Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
- Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
- van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
- Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
- Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
- Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetica. 110 (1), 17-72 (1985).
- Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
- Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
- Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
- van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
- Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
- Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
- Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).
