Идентификация ингибиторов EGFR и RAS с использованием Caenorhabditis elegans
Summary
Генетически поддающегося нематоде Caenorhabditis elegans можно использовать в качестве простой и недорогой модели для открытия лекарств. Здесь описан протокол для идентификации противоопухолевых терапевтических средств, которые ингибируют нисходящую передачу сигналов белков RAS и EGFR.
Abstract
Изменения в локализации плазматической мембраны рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и его последующего эффектора RAS были вовлечены в несколько заболеваний, включая рак. Свободноживущая нематода C. elegans обладает эволюционным и функционально сохраненным сигнальным каскадом EGFR-RAS-ERK MAP, который является центральным для развития вульвы. Усиление функциональных мутаций в гомологе RAS LET-60 и гомологе EGFR LET-23 индуцирует генерацию видимой нефункциональной эктопической псевдовульвы вдоль стенки вентрального тела этих червей. Ранее было показано, что фенотип мультивульвала (Muv) у этих червей ингибируется небольшими химическими молекулами. Здесь мы описываем протокол использования червя в жидкостном анализе для выявления ингибиторов, которые отменяют активность белков EGFR и RAS. Используя этот анализ, мы показываем, что R-фендилин, косвенный ингибитор K-RAS, подавляет фенотип Muv, экспрессируемый у мутантных червей let-60(n1046) и let-23(sa62). Анализ прост, недорог, не занимает много времени для настройки и может быть использован в качестве первоначальной платформы для открытия противоопухолевых терапевтических средств.
Introduction
Клеточные пути, которые регулируют события развития внутри организмов, высоко сохраняются среди всех метазоанов. Одним из таких путей является сигнальный каскад EGFR-RAS-ERK, активированный митогеном протеинкиназой (MAPK), который является критическим путем, который управляет пролиферацией, дифференцировкой, миграцией и выживанием клеток1,2. Дефекты в этом сигнальном пути могут привести к патологическим или болезненным состояниям, таким как рак. Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) показал высокую экспрессию в опухолях человека, включая 50% плоскоклеточных карцином полости рта, и способствует развитию злокачественных опухолей3,4,5. Принимая во внимание, что мутации в трех изоформах RAS H-, K- и N-RAS являются основными факторами злокачественной трансформации при множественных раковых заболеваниях человека. Среди этих трех изоформ RAS наиболее распространены онкогенные мутации в K-RAS6,7,8. Чтобы EGFR и RAS функционировали, они должны локализоваться на плазматической мембране (PM). Предотвращение локализации этих молекул к ТЧ может полностью отменить биологическую активность этого сигнального пути9,10. Следовательно, ингибирование локализации этих белков в ТЧ является терапевтической стратегией для блокирования нисходящей передачи сигналов и возникающих в результате неблагоприятных исходов. С помощью скринингового анализа с высоким содержанием фендилин, блокатор кальциевых каналов L-типа, был идентифицирован как ингибитор активности K-RAS11. Нанокластерие K-RAS на внутренний листок ТЧ значительно снижается в присутствии фендилина. Кроме того, K-RAS перераспределяется от плазматической мембраны к эндоплазматическому ретикулуму (ER), аппарату Гольджи, эндосомам и цитозолу. Что еще более важно, пролиферация клеточных линий рака поджелудочной железы, толстой кишки, легких и эндометрия, экспрессировающих онкогенный мутант K-RAS, блокируется ингибированием нисходящей передачи сигналов фендилином11. Эти данные свидетельствуют о том, что фендилин функционирует как специфический противоопухолевый препарат K-RAS, который вызывает неправильную локализацию белка RAS в PM.
Нематода Caenorhabditis elegans была широко изучена в контексте развития. Многие из сигнальных путей, которые управляют развитием червя, являются эволюционными и функционально сохраненными. Например, опосредоваемая EGFR активация RAS и последующая активация сигнального каскада ERK MAPK сохраняется в черве12. Каскад представлен следующими белками: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 гомологична RAS, в то время как LET-23 гомологична EGFR. У червя этот путь регулирует развитие вульвы13. Вульва представляет собой эпителиальное отверстие на стенке вентрального тела червя, которое позволяет откладывать оплодотворенные яйца. Формирование вульвы у червя зависит от воздействия на клетки-предшественники вульвы (VPC) градиента активации сигнального каскада EGFR-RAS-MAPK. Во время нормального развития проксимальные VPC получают сильные сигналы от клеток гонадного якоря для дифференцировки в 1° и 2° клеточных судеб, которые дают начало функциональной вульве12. В то время как дистальные VPC дифференцируются в 3° клеточные судьбы, которые сливаются с подкожным синцитием и не образуют вульву из-за истощения сигналов. При отсутствии сигнализации все VPC дифференцируются в 3° клеточные судьбы, что приводит к образованию вульвы. Однако конститутивная сигнализация приводит к образованию одной или нескольких нефункциональных вульв из-за индукции всех VPC предполагать судьбы клеток 1° и 2°.
Мутации, которые вызывают дефектную или чрезмерную индукцию вульвы, были идентифицированы для многих генов, которые кодируют белки, представляющие этот путь. Дефектная индукция вульвы приводит к фенотипу без вульвы (Vul), в то время как чрезмерная индукция вульвы приводит к фенотипу мультивульвы (Muv), который представлен развитием многочисленных нефункциональных эктопических псевдовульв по всей стенке вентрального тела. Фенотип Muv, экспрессируемый штаммом let-60(n1046), обусловлен усилением мутации функции в RAS, в то время как у штамма let-23(sa62) он обусловлен активирующей мутацией в EGFR14,15. Было показано, что сильный фенотип Muv в этих мутантных штаммах возмущается фармакологическими вмешательствами, как продемонстрировано лечением червей let-60(n1046) ингибитором MEK-1 U012616,17. Интересно, что мы показали, что R-фендилин и ингибиторы, влияющие на метаболизм сфингомиелина, подавляют фенотип Muv у червя18. Для демонстрации этих ингибиторов блока передачи сигналов let-60 на уровне RAS был использован нулевой штамм lin-1 17. Lin-1 является Ets-подобным ингибирующим фактором транскрипции, который функционирует как репрессор в развитии вульвы19. Сильная реверсия фенотипа Muv у червей let-60(n1046) и отсутствие влияния на нулевых червей lin-1 позволяют предположить, что эти ингибирования происходят на уровне RAS.
В этом протоколе мы демонстрируем использование C. elegans в качестве модели для идентификации ингибиторов белков RAS и EGFR. Используя жидкостный анализ, мы демонстрируем ингибирующие эффекты R-фендилина путем подавления фенотипов Muv в мутантных штаммах let-60(n1046) и let-23(sa62) C. elegans. Этот анализ подтверждает использование C. elegans в качестве инструмента на начальном этапе открытия лекарств для противоопухолевой терапии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализы, которые мы описываем с использованием червя, просты и недороги для выявления ингибиторов функции EGFR и RAS. C. elegans является привлекательной моделью для открытия лекарств, потому что его легко выращивать в лаборатории из-за короткого жизненного цикла (3 дня при 20 ° C) и способно?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Свати Арура (MD Anderson Cancer Center) за предоставление let-60(n1046). Мы также благодарим доктора Дэвида Райнера (Texas A&M Health Science Center Institute of Biosciences & Technology в Хьюстоне) за штамм lin-1. Наконец, мы благодарим доктора Даниэль Гарсин и ее лабораторию (Техасский университет, Медицинская школа Макговерна) за предоставление некоторых реагентов. Некоторые штаммы червей были предоставлены CGC, который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Это исследование было поддержано грантом Техасского института профилактики и исследований рака (CPRIT) RP200047 для JF Hancock.
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
Riferimenti
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
- Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Ricerca sul cancro. 53 (15), 3579-3584 (1993).
- Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
- Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
- Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Ricerca sul cancro. 49 (17), 4682-4689 (1989).
- Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
- Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Ricerca sul cancro. 72 (10), 2457-2467 (2012).
- Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
- Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
- van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
- Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
- Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
- Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetica. 110 (1), 17-72 (1985).
- Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
- Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
- Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
- van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
- Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
- Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
- Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).
