Identificación de inhibidores de EGFR y RAS mediante Caenorhabditis elegans
Summary
El nematodo genéticamente tratable Caenorhabditis elegans se puede utilizar como un modelo simple y económico para el descubrimiento de fármacos. Aquí se describe un protocolo para identificar terapias contra el cáncer que inhiben la señalización aguas abajo de las proteínas RAS y EGFR.
Abstract
Los cambios en la localización de la membrana plasmática del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y su efector aguas abajo RAS se han implicado en varias enfermedades, incluido el cáncer. El nematodo de vida libre C. elegans posee una cascada de señales EGFR-RAS-ERK MAP evolutiva y funcionalmente conservada que es central para el desarrollo de la vulva. Las mutaciones de ganancia de función en el homólogo RAS LET-60 y el homólogo EGFR LET-23 inducen la generación de pseudovulva ectópica no funcional visible a lo largo de la pared del cuerpo ventral de estos gusanos. Anteriormente, se ha demostrado que el fenotipo multivulval (Muv) en estos gusanos es inhibido por pequeñas moléculas químicas. Aquí describimos un protocolo para usar el gusano en un ensayo a base de líquido para identificar inhibidores que abolen las actividades de las proteínas EGFR y RAS. Usando este ensayo, mostramos que la R-fendilina, un inhibidor indirecto de K-RAS, suprime el fenotipo Muv expresado en los gusanos mutantes let-60(n1046) y let-23(sa62). El ensayo es simple, económico, no requiere mucho tiempo de configuración y se puede utilizar como una plataforma inicial para el descubrimiento de terapias contra el cáncer.
Introduction
Las vías celulares que regulan los eventos de desarrollo dentro de los organismos están altamente conservadas entre todos los metazoos. Una de estas vías es la cascada de señalización de la proteína quinasa activada por mitógeno EGFR-RAS-ERK (MAPK), que es una vía crítica que gobierna la proliferación, diferenciación, migración y supervivencia celular1,2. Los defectos en esta vía de señalización pueden conducir a estados patológicos o de enfermedad como el cáncer. El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) ha demostrado estar altamente expresado en tumores humanos, incluyendo el 50% de los carcinomas orales de células escamosas, y contribuye al desarrollo de tumores malignos3,4,5. Mientras que las mutaciones en las tres isoformas RAS H-, K- y N-RAS son los principales impulsores de la transformación maligna en múltiples cánceres humanos. Entre estas tres isoformas RAS, las mutaciones oncogénicas en K-RAS son las más prevalentes6,7,8. Para que EGFR y RAS funcionen, deben localizarse en la membrana plasmática (PM). Prevenir la localización de estas moléculas al PM puede abrogar completamente la actividad biológica de esta vía de señalización9,10. Por lo tanto, la inhibición de la localización de estas proteínas en el PM es una estrategia terapéutica para bloquear la señalización aguas abajo y los resultados adversos resultantes. Mediante un ensayo de cribado de alto contenido, se identificó la fendilina, un bloqueador de los canales de calcio de tipo L, como un inhibidor de la actividad de K-RAS11. La nanoagrupanción de K-RAS a la valva interna del PM se reduce significativamente en presencia de fendilina. Además, K-RAS se redistribuye desde la membrana plasmática al retículo endoplásmico (RE), el aparato de Golgi, los endosomas y el citosol. Más importante aún, la proliferación de líneas celulares de cáncer de páncreas, colon, pulmón y endometrio que expresan K-RAS mutante oncogénico está bloqueada por la inhibición de la señalización aguas abajo por fendilina11. Estos datos sugieren que la fendilina funciona como una terapia específica contra el cáncer K-RAS que causa la mala localización de la proteína RAS al PM.
El nematodo Caenorhabditis elegans ha sido ampliamente estudiado en el contexto del desarrollo. Muchas de las vías de señal que gobiernan el desarrollo en el gusano son evolutivas y funcionalmente conservadas. Por ejemplo, la activación mediada por EGFR de RAS y la posterior activación de la cascada de señal ERK MAPK se conserva en el gusano12. La cascada está representada por las siguientes proteínas: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 es homólogo a RAS, mientras que LET-23 es homólogo a EGFR. En el gusano, esta vía regula el desarrollo de la vulva13. La vulva es una abertura epitelial en la pared ventral del cuerpo del gusano que permite poner huevos fertilizados. La formación de la vulva en el gusano depende de la exposición de las células precursoras vulvales (VPC) a un gradiente de activación de la cascada de señales EGFR-RAS-MAPK. Durante el desarrollo normal, las VPC proximales reciben fuertes señales de las células de anclaje gonadal para diferenciarse en destinos celulares de 1° y 2° que dan lugar a una vulva funcional12. Mientras que las VPC distales se diferencian en destinos celulares de 3° que se fusionan con el sincitio hipodérmico y no forman vulva debido al agotamiento de la señalización. En ausencia de señalización, todas las VPC se diferencian en destinos celulares de 3°, lo que resulta en la formación de ninguna vulva. Sin embargo, la señalización constitutiva conduce a la formación de una o más vulva no funcionales debido a la inducción de todas las VPC para asumir destinos celulares de 1° y 2°.
Se han identificado mutaciones que causan una inducción vulvística defectuosa o excesiva para muchos de los genes que codifican para las proteínas que representan esta vía. La inducción vulvar defectuosa da como resultado un fenotipo sin vulva (Vul), mientras que la inducción vulvar excesiva da como resultado un fenotipo multivulva (Muv) que está representado por el desarrollo de numerosas pseudovulvas ectópicas no funcionales en toda la pared del cuerpo ventral. El fenotipo Muv expresado por la cepa let-60(n1046) se debe a una mutación de ganancia de función en RAS, mientras que en la cepa let-23(sa62) se debe a una mutación activadora en EGFR14,15. Se ha demostrado que el fuerte fenotipo Muv en estas cepas mutantes se ve perturbado por las intervenciones farmacológicas, como lo demuestra el tratamiento de los gusanos let-60(n1046) con el inhibidor de MEK-1 U012616,17. Curiosamente, hemos demostrado que la R-fendilina y los inhibidores que afectan al metabolismo de la esfingomielina suprimen el fenotipo Muv en el gusano18. Para demostrar que estos inhibidores bloquean la señalización let-60 a nivel de RAS, se ha utilizado la cepa nula lin-1 17. Lin-1 es un factor de transcripción inhibidor similar a Ets que funciona como represor en el desarrollo de la vulva19. La fuerte reversión del fenotipo Muv en gusanos let-60(n1046) y ningún efecto sobre los gusanos nulos lin-1 sugieren que estas inhibiciones ocurren a nivel de RAS.
En este protocolo, demostramos el uso de C. elegans como modelo para identificar inhibidores de las proteínas RAS y EGFR. Utilizando un ensayo a base de líquido, demostramos los efectos inhibitorios de la R-fendilina mediante la supresión de los fenotipos Muv en las cepas mutantes let-60(n1046) y let-23(sa62) de C. elegans. Este ensayo valida el uso de C. elegans como herramienta en la fase inicial de descubrimiento de fármacos para la terapéutica contra el cáncer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los ensayos que describimos utilizando el gusano son simples y económicos para identificar inhibidores de la función EGFR y RAS. C. elegans es un modelo atractivo para el descubrimiento de fármacos porque es fácil de cultivar en el laboratorio debido al corto ciclo de vida (3 días a 20 °C) y la capacidad de generar un gran número de larvas. Más importante aún, la vía EGFR-RAS-ERK MAPK se conserva evolutiva y funcionalmente con mamíferos que proporcionan un sistema genéticamente tratable para analizar…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) por proporcionar el let-60 (n1046). También agradecemos al Dr. David Reiner (Texas A&M Health Science Center Institute of Biosciences & Technology en Houston) por la cepa lin-1. Finalmente, agradecemos a la Dra. Danielle Garsin y su laboratorio (La Universidad de Texas, Escuela de Medicina McGovern) por proporcionar algunos de los reactivos. Algunas cepas de gusanos fueron proporcionadas por el CGC, que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). Esta investigación fue apoyada por el Instituto de Prevención e Investigación del Cáncer de Texas (CPRIT) subvención RP200047 a JF Hancock.
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
Riferimenti
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
- Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Ricerca sul cancro. 53 (15), 3579-3584 (1993).
- Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
- Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
- Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Ricerca sul cancro. 49 (17), 4682-4689 (1989).
- Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
- Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Ricerca sul cancro. 72 (10), 2457-2467 (2012).
- Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
- Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
- van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
- Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
- Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
- Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetica. 110 (1), 17-72 (1985).
- Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
- Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
- Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
- van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
- Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
- Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
- Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).
