ケノハブディティス・エレガンスを用いたEGFRおよびRAS阻害剤の同定
Summary
遺伝的に難解な線虫カ エノハブディティスエレガンス は、創薬のためのシンプルで安価なモデルとして使用することができます。ここで説明するプロトコルは、RASおよびEGFRタンパク質の下流シグナル伝達を阻害する抗癌治療を同定するプロトコルである。
Abstract
表皮成長因子受容体(EGFR)とその下流のエフェクターRASの細胞膜局在の変化は、癌を含むいくつかの疾患に関与している。自由に生きている線虫 C.エレガンス は、外陰部の発達の中心である進化的かつ機能的に保存されたEGFR-RAS-ERK MAPシグナルカスケードを有する。RASホモログLET-60およびEGFRホモログLET-23における機能変異の利益は、これらのワームの腹側体壁に沿って目に見える非機能的な子宮外性偽陰骨の生成を誘導する。これまで、これらのワームにおける多対体(Muv)表現型は、小さな化学分子によって阻害されることが示されていた。ここでは、EGFRおよびRASタンパク質の活性を廃止する阻害剤を同定するために、液体ベースのアッセイでワームを使用するためのプロトコルについて説明する。このアッセイを用いて、K-RASの間接的阻害剤であるR-フェンジリンが 、let-60(n1046) および let-23(sa62) 変異型ワームで発現するMuv表現型を抑制する。このアッセイは、簡単で安価で、セットアップに時間を要せず、抗がん治療薬の発見のための初期プラットフォームとして使用することができます。
Introduction
生物内の発生事象を調節する細胞経路は、すべてのメタゾアンの間で高度に保存されています。そのような経路の1つは、細胞増殖、分化、遊動および生存を支配する重要な経路であるEGFR-RAS-ERK活性化プロテインキナーゼ(MAPK)シグナル伝達カスケードである1,2である。このシグナル伝達経路の欠陥は、癌などの病理学的または疾患状態につながる可能性がある。表皮成長因子受容体(EGFR)は、口腔扁平上皮癌の50%を含むヒト腫瘍において高発現することが示されており、悪性腫瘍3、4、5の発症に寄与している。一方、3つのRASアイソフォームH-,K-およびN-RASの突然変異は、複数のヒト癌における悪性転換の主要な原動力である。これら3つのRASアイソフォームの中で、K-RASの発癌性変異は6、7、8で最も普及している。EGFRとRASが機能するためには、それらは、形質膜(PM)に局地化する必要があります。PMにこれらの分子の局在化を防ぐことは、このシグナル経路9,10の生物学的活性を完全に妨げることができる。したがって、PMへのこれらのタンパク質の局在化の阻害は、下流シグナル伝達および結果として生じる有害な結果を遮断する治療戦略である。高含有スクリーニングアッセイを用いて、フェンジリン、L型カルシウムチャネル遮断薬を、K-RAS活性11の阻害剤として同定した。PMの内側のリーフレットへのK-RASのナノクラスタリングはフェンジリンの存在下で有意に減少する。さらに、K-RASは、小形質膜から小胞体(ER)に再分配され、ゴルジ装置、エンドソーム、および細胞質ゾルが挙げられる。さらに重要なことは、膵臓、結腸、肺、およびK-RASに癌細胞株の増殖がフェンジリン11による下流シグナル伝達の阻害によって遮断される。これらのデータは、PMへのRASタンパク質の誤局在化を引き起こす特定のK-RAS抗癌治療としてフェンジリン機能を示唆している。
線虫 カエノハブディティスエレガンス は、開発の文脈で広く研究されています。ワームの発達を支配するシグナル経路の多くは、進化的で機能的に保存されています。例えば、EGFR媒介RASの活性化とERK MAPK信号カスケードのその後の活性化は、ワーム12中で保存される。カスケードは、以下のタンパク質によって表されます: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1.LET-60はRASに相同で、LET-23はEGFRと同種です。ワームでは、この経路は外陰部13の発達を調節する。外陰部は、受精卵を産み付けることを可能にするワームの腹側体壁上の上皮開口である。ワームにおける外陰部の形成は、EGFR-RAS-MAPKシグナルカスケードの活性化の勾配への外陰前駆細胞(VPC)の曝露に依存する。正常な発達の間、近位VPCは、生殖腺アンカー細胞から強いシグナルを受け取り、1°および2°の細胞運命に分化し、機能的外陰部12を生じる。一方、遠位VPCは、皮下シンクティウムに融合し、シグナル伝達が枯渇したために外陰部を形成しない3°細胞運命に分化する。シグナルがない場合、すべてのVPCは3°細胞の運命に分化し、外陰部の形成を生じさせない。しかし、構成シグナル伝達は、1°および2°細胞運命を仮定するすべての VPC の誘導による1つ以上の非機能的外陰部の形成をもたらす。
この経路を表すタンパク質をコードする遺伝子の多くについて、欠陥または過剰な加硫誘導を引き起こす突然変異が同定されている。外陰性(Vul)表現型の外反誘発は、外陰性(Vul)表現型で結果、過剰な外陰誘発は、腹側の体壁全体に多数の非機能的な外向性偽陰部の発達によって表される多外陰性表現型をもたらす。let-60(n1046)株によって発現されるMuv表現型はRASの機能変異の利得によるもので、一方、let-23(sa62)株ではEGFR14,15の活性化変異によるものである。これらの変異株における強いMuv表現型は、MEK-1阻害剤U012616,17によるlet-60(n1046)ワームの治療によって示されるように薬理学的介入によって摂動することが示されている。興味深いことに、スフィンゴミエリン代謝に影響を与えるR-フェンジリンおよび阻害剤がワーム18におけるMuv表現型を抑制することを示した。RASのレベルでこれらの阻害剤ブロックlet-60シグナリングを実証するために、lin-1ヌル株は17を利用している。Lin-1は、外陰部19の開発におけるリプレッサーとして機能するEts様の阻害性転写因子である。let-60(n1046)ワームにおける Muv 表現型の強い復帰とlin-1ヌルワームへの影響は、RAS のレベルで発生する阻害を示唆しています。
本プロトコルでは、RASおよびEGFRタンパク質の阻害剤を同定するモデルとしての C.エレガンス の使用を実証する。液体ベースのアッセイを用いて、 液性60(n1046) および let-23(sa62) 変異株の C.エレガンスのMuv表現型を抑制することにより、Rフェンジリンの阻害効果を実証する。このアッセイは、抗がん治療薬の創薬初期段階におけるツールとしての C.エレガンス の使用を検証する。
Protocol
Representative Results
Discussion
このワームを用いて説明するアッセイは、EGFRおよびRAS機能の阻害剤を同定するために、簡単かつ安価である。 C.エレガンス は、短いライフサイクル(20°Cで3日間)と多数の幼虫を生成する能力のために実験室で成長しやすいので、創薬のための魅力的なモデルです。さらに重要なことに、EGFR-RAS-ERK MAPK経路は、EGFRおよびRAS阻害剤の効果を分析する遺伝的に難解なシステムを提供する哺乳…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは 、let-60(n1046)を提供してくれたスワティ・アルール博士(MDアンダーソンがんセンター)に感謝します。また 、lin-1 株に対するデビッド・ライナー博士(ヒューストンのテキサスA&Mヘルスサイエンスセンターバイオサイエンス&テクノロジー研究所)にも感謝します。最後に、試薬の一部を提供してくれたダニエル・ガーシン博士と彼女の研究室(テキサス大学、マクガヴァン医科大学)に感謝します。いくつかのワーム株は、研究インフラプログラムのNIHオフィス(P40 OD010440)によって資金提供されているCGCによって提供されました。この研究は、テキサス州癌予防研究所(CPRIT)がJFハンコックにRP200047を付与することによって支援されました。
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
Riferimenti
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